超氧化物歧化酶（SuperoxideDismutase,SOD）試劑盒說明書（NBT法）

第第頁超氧化物歧化酶（SuperoxideDismutase,SOD）試劑盒說明書（NBT法）超氧化物歧化酶（SuperoxideDismutase,SOD）試劑盒說明書（NBT法）微量法100管/96樣注意：正式測定前務必取23個預期差別較大的樣本做猜測定測定意義：SOD（EC1.15.1.1）廣泛存在于動物、植物、微生物和培養(yǎng)細胞中，催化超氧化物陰離子發(fā)生岐化作用，生成H2O2和O2。SOD不但是超氧化物陰離子清除酶，也是H2O2重要生成酶，在生物抗氧化系統(tǒng)中具有緊要作用。測定原理：通過黃嘌呤及黃嘌呤氧化酶反應系統(tǒng)產(chǎn)生超氧陰離子（O2），O2可還原氮藍四唑生成藍色甲臜，后者在560nm處有汲?。籗OD可清除O2，從而抑制了甲臜的形成；反應液藍色越深，說明SOD活性愈低，反之活性越高。需自備的儀器和用品：酶標儀、離心機、移液器、96孔板、研缽、冰和蒸餾水試劑的構(gòu)成和配制：提取液：液體100mL×1瓶，4℃保管；試劑一：液體5mL×1瓶，4℃保管；試劑二：液體200μL×1支，4℃保管；試劑三：液體4mL×1瓶，4℃保管；試劑四：粉劑×2瓶，4℃保管。粗酶液提?。?、細菌、細胞或組織樣品的制備：細菌或培養(yǎng)細胞：先收集細菌或細胞到離心管內(nèi)，離心后棄上清；依照細菌或細胞數(shù)量（104個）：提取液體積（mL）為500～1000：1的比例（建議500萬細菌或細胞加入1mL提取液），超聲波碎裂細菌或細胞（冰浴，功率20％或200W，超聲3s，間隔10s，重復30次）；8000g4℃離心10min，取上清，置冰上待測。組織：依照組織質(zhì)量（g）：提取液體積（mL）為1：5～10的比例（建議稱取約0.1g組織，加入1mL提取液），進行冰浴勻漿。8000g4℃離心10min，取上清，置冰上待測。2、血清（漿）樣品：直接檢測。測定步驟：1、酶標儀預熱30min以上，調(diào)整波長至560nm。2、將試劑二用蒸餾水稀釋兩倍，用多少配多少。（試劑二和蒸餾水1：1稀釋）3、將一瓶試劑四用5mL蒸餾水溶解（溶解后一周內(nèi)用完），再用蒸餾水稀釋4倍，用多少配多少（試劑四和蒸餾水1：3稀釋）。4、測定前將試劑一、三和四在37℃（哺乳動物）或25℃（其他物種）水浴5min以上。5、樣本測定（在EP管或96孔板中依次加入下列試劑）試劑名稱（μL）測定管對照管試劑一4545試劑二22樣本18蒸餾水18試劑三3535試劑四100100充分混勻，室溫靜置30min后，560nm處測定各管吸光值A。注意事項：1、試劑二為酶，不行冷凍，使用時在冰上放置。2、對照管只需要做一管。3、若對照管吸光值大于1，建議將試劑二用蒸餾水稀釋7倍后使用（10μL試劑二原液+60μL蒸餾水）。4、SOD為什么有的樣本測定管大于對照管，對照管數(shù)值在什么范圍？對照管的范圍是0.41。對照管吸光值過低可能是（1）試劑二或試劑四沒有現(xiàn)配現(xiàn)用；（2）沒有按次序加試劑；（3）反應時間不足，可以延長反應時間（反應時間30min可以延長到40min）。對照管吸光值過高可能是試劑二未按操作說明書稀釋相應倍數(shù)。若顯現(xiàn)測定管大于對照管，可能是樣本中雜質(zhì)的影響太大，為了降低雜質(zhì)的影響一般將樣本提取上清液用蒸餾水或提取液稀釋10倍后再測，通?？梢允箿y定正常。計算公式中乘以相應稀釋倍數(shù)。SOD活性計算：1、抑制百分率的計算抑制百分率＝（A對照管—A測定管）÷A對照管×100%盡量使樣本的抑制百分率在1090%范圍內(nèi)。假如計算出來的抑制百分率小于10%或大于90%，則通常需要調(diào)整加樣量后重新測定。假如測定出來的抑制百分率偏高，則需將樣本用提取液適當稀釋；假如測定出來的抑制百分率偏低，則需重新準備濃度比較高的待測樣本。2、SOD酶活性單位：在上述黃嘌呤氧化酶藕聯(lián)反應體系中抑制百分率為50%時，反應體系中的SOD酶活力定義為一個酶活力單位（U/mL）。3、SOD酶活性計算：（1）血清（漿）SOD活性（U/mL）=[抑制百分率÷（1—抑制百分率）×V反總]÷V樣=11.11×抑制百分率÷（1—抑制百分率）（2）組織、細菌或培養(yǎng)細胞SOD活力計算：a.按樣本蛋白濃度計算SOD活性（U/mgprot）=[抑制百分率÷（1—抑制百分率）×V反總]÷（V樣×Cpr）=11.11×抑制百分率÷（1—抑制百分率）÷Cpr需要另外測定，建議使用本公司BCA蛋白質(zhì)含量測定試劑盒。b.按樣本鮮重計算SOD活性（U/g鮮重）=[抑制百分率÷（1—抑制百分率）×V反總]÷（W×V樣÷V樣總）=11.11×抑制百分率÷（1—抑制百分率）÷Wc.按細菌或細胞個數(shù)計算SOD活力（U/104cell）=[抑制百分率÷（1—抑制百分率）×V反總]÷（500×V樣÷V樣總）=0.022×抑制百分率÷（1—抑制