兩種土壤處理劑對(duì)生姜莖腐病菌的體外抑菌試驗(yàn)

兩種土壤處理劑對(duì)生姜莖腐病菌的體外抑菌試驗(yàn)

目前，植物土壤傳播病害的主要包括真菌性疾病、細(xì)菌疾病和由線蟲(chóng)感染的疾病。生姜莖腐病、姜瘟病和生姜癩皮病(病原為南方根結(jié)線蟲(chóng))是生姜生產(chǎn)上重要的土傳病害,近年來(lái)在山東省生姜主產(chǎn)區(qū)呈逐年蔓延擴(kuò)大的趨勢(shì),嚴(yán)重影響了生姜的產(chǎn)量和品質(zhì)。土壤處理是防治土傳病害的重要途徑,化學(xué)熏蒸是土壤處理的重要措施之一,也是目前主要的防治方法。由于常用熏蒸劑溴甲烷對(duì)臭氧層的消耗極為嚴(yán)重,目前其主要替代品氯化苦、棉隆、1,3-二氯丙烯等在田間均對(duì)土傳病害表現(xiàn)出了一定的防治效果。其中氯化苦和棉隆在山東省生姜主產(chǎn)區(qū)均有應(yīng)用,但兩者對(duì)3種病害的控制能力是否存在差異尚未見(jiàn)報(bào)道。目前國(guó)內(nèi)關(guān)于熏蒸劑毒力測(cè)定方法的報(bào)道多針對(duì)儲(chǔ)糧及衛(wèi)生害蟲(chóng),用于病菌測(cè)定易導(dǎo)致雜菌污染。Fernando等曾利用密封盤(pán)(sealedplates)法測(cè)定過(guò)苯并噻唑、環(huán)己醇等揮發(fā)性化合物對(duì)真菌的抑制活性?？紤]到藥劑對(duì)真菌、細(xì)菌和線蟲(chóng)的活性存在較大差異,本研究對(duì)Fernando等的方法進(jìn)行了改進(jìn),采用合適的熏蒸容器分別測(cè)定了棉隆和氯化苦對(duì)莖腐病菌(真菌)、姜瘟病菌(細(xì)菌)和南方根結(jié)線蟲(chóng)的毒力,旨在為快速有效地篩選和評(píng)價(jià)土壤熏蒸劑的活性提供參考。1材料和方法1.1水電空氣/空氣溫度分布99.5%的氯化苦(chloropicrin)液劑(遼寧大連綠峰化學(xué)股份有限公司)、98%的棉隆(dazomet)微粒劑(MG,江蘇省南通施壯化工有限公司)。GA110萬(wàn)分之一電子天平(德國(guó));LDZX-40BI自動(dòng)電熱壓力蒸汽滅菌器(上海申安醫(yī)療器械廠);SW-CJ-LD超凈工作臺(tái)(蘇凈集團(tuán)蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司);WD700微波爐(順德格蘭仕電器廠);THZ-82空氣浴搖床(江蘇太倉(cāng)公司);UV-2201紫外分光光度計(jì)(日本島津公司);GXZ型智能光照培養(yǎng)箱(寧波江南儀器廠)。1.2培養(yǎng)了姜疫病原菌生姜莖腐病菌PythiummyriotylumDrechsler由山東省萊蕪市農(nóng)業(yè)科學(xué)院提供,于18℃生化培養(yǎng)箱中PDA斜面上保存;姜瘟病菌Ralstoniasolanacearum由山東農(nóng)業(yè)大學(xué)植物病理系提供,室溫下于無(wú)菌水中保存;南方根結(jié)線蟲(chóng)Meloidogyneincognita采自山東農(nóng)業(yè)大學(xué)蔬菜標(biāo)本園,參照劉維志報(bào)道的根結(jié)線蟲(chóng)分離方法分離培養(yǎng),每24h收集2齡幼蟲(chóng),置于4℃冰箱中備用。1.3培養(yǎng)基a培養(yǎng)基馬鈴薯葡萄糖瓊脂(PDA)培養(yǎng)基;NA培養(yǎng)基(牛肉浸膏3g,酵母浸膏1g,蛋白胨5g,葡萄糖10g,瓊膠15g,蒸餾水1000mL)。1.4測(cè)試方法1.4.1不同覆蓋厚度的玻璃鐘罩對(duì)菌落生長(zhǎng)的影響采用玻璃鐘罩作為密閉熏蒸容器,測(cè)定藥劑對(duì)生姜莖腐病菌的毒力。經(jīng)轉(zhuǎn)接活化后的菌株于PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng),待菌落長(zhǎng)至培養(yǎng)皿3/4大小時(shí),于邊緣打取直徑約8mm的菌絲塊。無(wú)菌條件下,向培養(yǎng)皿中倒入2mm高、冷卻至45℃的PDA培養(yǎng)基,待培養(yǎng)基凝固后將菌絲塊菌絲面向下接種于平板中央,將接種后的平板開(kāi)蓋放置在厚度為0.04mm、面積為50cm×50cm的塑料膜上,設(shè)4次重復(fù)。同時(shí)放置1個(gè)盛有無(wú)菌水的培養(yǎng)皿蓋,在預(yù)備試驗(yàn)基礎(chǔ)上向其中加入相應(yīng)劑量的處理藥劑(玻璃鐘罩容積用水標(biāo)定為21.07L。棉隆的熏蒸質(zhì)量濃度分別為0.2、0.5、1.0、2.5、5.0mg/L,氯化苦分別為0.04、0.08、0.12、0.16、0.24mg/L)。迅速蓋上玻璃鐘罩,用皮筋將塑料膜沿玻璃鐘罩外壁密封嚴(yán)實(shí),將玻璃鐘罩放入25℃培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)3d。以只添加無(wú)菌水組為對(duì)照,試驗(yàn)重復(fù)3次。用十字交叉法測(cè)量菌落直徑,按式(1)、(2)計(jì)算各處理凈生長(zhǎng)量和菌絲生長(zhǎng)抑制率的平均值。凈生長(zhǎng)量/mm=測(cè)量菌落直徑-8(1)菌絲生長(zhǎng)抑制率/%=對(duì)照組凈生長(zhǎng)量?處理組凈生長(zhǎng)量對(duì)照組凈生長(zhǎng)量×100(2)菌絲生長(zhǎng)抑制率/%=對(duì)照組凈生長(zhǎng)量-處理組凈生長(zhǎng)量對(duì)照組凈生長(zhǎng)量×100(2)采用DPS軟件分別計(jì)算出兩種藥劑的EC50、EC90、95%置信限和相應(yīng)的b值及標(biāo)準(zhǔn)差(SD)。1.4.2土壤熏蒸劑對(duì)致病性細(xì)菌的毒性影響1.4.2.培養(yǎng)姜坯病原菌菌落將保存的姜瘟病菌菌株取出,在NA固體培養(yǎng)基上活化,挑取單菌落置于NA液體發(fā)酵培養(yǎng)基中,于25℃、190r/min下振蕩培養(yǎng)24h,制得菌懸液。菌懸液用滅菌水稀釋1×107倍,取0.05mL稀釋后的菌懸液均勻涂抹在PDA固體培養(yǎng)基上,于25℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1d。記錄姜瘟病菌的菌落數(shù)量,根據(jù)式(3)計(jì)算每1mL菌懸液中的細(xì)菌數(shù)(N)。N=平板上菌落數(shù)×稀釋倍數(shù)平板上加菌液的量/mLΝ=平板上菌落數(shù)×稀釋倍數(shù)平板上加菌液的量/mL(3)1.4.2.測(cè)定波長(zhǎng)的確定用無(wú)菌水將菌懸液分別稀釋9、13、17、33、49、65倍,通過(guò)預(yù)試驗(yàn)確定吸光度在0.1～0.9之間的吸收波長(zhǎng)。以不加菌懸液組為對(duì)照。在選定的波長(zhǎng)下測(cè)定不同稀釋倍數(shù)菌懸液的吸光值,試驗(yàn)重復(fù)3次。依據(jù)平板活菌計(jì)數(shù)結(jié)果,以菌懸液濃度為橫坐標(biāo)、吸光值為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。1.4.2.添加對(duì)藥劑的篩選和各處理的菌懸液的抑制率及生長(zhǎng)量的測(cè)定參照Fernando等報(bào)道的密封盤(pán)法進(jìn)行,采用密封盤(pán)作為熏蒸容器。無(wú)菌條件下,在直徑15cm的大培養(yǎng)皿蓋中放一張濾紙,加入20mL無(wú)菌水保濕。取5mL菌懸液加入直徑7cm的小培養(yǎng)皿中,再加入NA液體培養(yǎng)基5mL。將小培養(yǎng)皿去蓋后放入大培養(yǎng)皿蓋中。在預(yù)試驗(yàn)基礎(chǔ)上,于濕濾紙上添加各處理藥劑(密封盤(pán)容積用水標(biāo)定為1.88L。棉隆的質(zhì)量濃度分別為1063.8、1595.7、2127.7、2659.6和3191.5mg/L,氯化苦分別為0.09、0.18、0.36、0.54和0.72mg/L),以只添加無(wú)菌水組為對(duì)照。迅速用另一直徑15cm的大培養(yǎng)皿蓋蓋上,并用封口膜封嚴(yán),于25℃、45r/min搖床上培養(yǎng)1d。將各處理菌懸液用無(wú)菌水稀釋13倍,在選定波長(zhǎng)下測(cè)定不同處理組菌懸液的吸光值,由標(biāo)準(zhǔn)曲線方程獲得不同處理的菌懸液濃度。根據(jù)式(4)、(5)計(jì)算各藥劑對(duì)姜瘟病菌的抑制率。凈生長(zhǎng)量=菌液濃度?N26-Ν26(4)抑制率/%=對(duì)照組凈生長(zhǎng)量?處理組凈生長(zhǎng)量對(duì)照組凈生長(zhǎng)量×100(5)抑制率/%=對(duì)照組凈生長(zhǎng)量-處理組凈生長(zhǎng)量對(duì)照組凈生長(zhǎng)量×100(5)式中N為每1mL菌懸液中的細(xì)菌數(shù)。采用DPS軟件分別計(jì)算出兩種藥劑的EC50、EC90、95%置信限和相應(yīng)的b值及標(biāo)準(zhǔn)差(SD)。1.4.3藥劑處理和安全性評(píng)價(jià)采用層析缸作為密閉熏蒸容器。將分離活化得到的2齡根結(jié)線蟲(chóng)配制成2000條/mL的懸浮液,分別添加50μL于三孔凹玻片的3個(gè)凹穴內(nèi),設(shè)2次重復(fù)。將處理后的凹玻片置于密封性良好的層析缸內(nèi),同時(shí)放置一個(gè)盛有無(wú)菌水的培養(yǎng)皿蓋,在預(yù)備試驗(yàn)的基礎(chǔ)上,向培養(yǎng)皿蓋中加入處理藥劑(層析缸容積用水標(biāo)定為5.15L。棉隆的熏蒸質(zhì)量濃度分別為0.1、0.2、0.3、0.4、0.5mg/L,氯化苦分別為0.89、1.79、2.68、3.58、4.47mg/L),迅速蓋上層析蓋并用封口膜封嚴(yán)。以只添加無(wú)菌水為對(duì)照,試驗(yàn)重復(fù)2次。將層析缸于室溫下培養(yǎng)48h后取出凹玻片,于空氣中暴露放置3min,4×10倍顯微鏡下鏡檢,記錄根結(jié)線蟲(chóng)的死亡情況(蟲(chóng)體僵直且完全停止活動(dòng)者視為死亡)。根據(jù)式(6)、(7)計(jì)算各藥劑處理死亡率和校正死亡率。死亡率/%=死亡線蟲(chóng)數(shù)調(diào)查總線蟲(chóng)數(shù)×100/%=死亡線蟲(chóng)數(shù)調(diào)查總線蟲(chóng)數(shù)×100(6)校正死亡率/%=處理死亡率?對(duì)照死亡率1?對(duì)照死亡率×100/%=處理死亡率-對(duì)照死亡率1-對(duì)照死亡率×100(7)采用DPS軟件分別計(jì)算出兩種藥劑的EC50、EC90、95%置信限和相應(yīng)的b值及標(biāo)準(zhǔn)差(SD)。2結(jié)果與分析2.1土壤熏蒸劑對(duì)生姜莖腐病的毒性結(jié)果(見(jiàn)表1)表明,氯化苦和棉隆對(duì)生姜莖腐病菌均表現(xiàn)出較高的毒力,且氯化苦的毒力高于棉隆。2.2土壤熏蒸劑對(duì)姜醇菌的毒性2.2.1菌懸液濃度c平板活菌計(jì)數(shù)結(jié)果為每1mL菌懸液中的細(xì)菌數(shù)(N)=3.2×1010個(gè)。以吸光度(A)為縱坐標(biāo),菌懸液濃度(c)為橫坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸,得標(biāo)準(zhǔn)曲線方程A=0.1345c-0.0713(R2=0.9861,c的單位為109個(gè)/mL)。結(jié)果表明,在0.49×109～3.6×109個(gè)/mL濃度范圍內(nèi),菌懸液濃度與吸光度值至呈良好的線性關(guān)系。2.2.2中毒試驗(yàn)的結(jié)果由表2可知,氯化苦對(duì)姜瘟病菌的活性較高,而棉隆的活性較低。2.3穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果48h后空白對(duì)照組存活率很高,均達(dá)90%以上,表明試驗(yàn)體系穩(wěn)定可靠。兩種藥劑對(duì)南方根結(jié)線蟲(chóng)的毒力存在一定的差異(表3),其中棉隆對(duì)南方根結(jié)線蟲(chóng)的活性較高,氯化苦的毒力低于棉隆。3培養(yǎng)培養(yǎng)基及藥劑熏蒸容器的大小對(duì)試驗(yàn)結(jié)果影響較大,容器太小將導(dǎo)致藥劑計(jì)量困難,試驗(yàn)誤差增大。本研究經(jīng)預(yù)試,選取了合適的容器進(jìn)行毒性試驗(yàn),所改進(jìn)的生測(cè)方法具有良好的重現(xiàn)性,可為快速準(zhǔn)確地評(píng)價(jià)其他土壤熏蒸劑的毒力提供參考。此外,姜瘟病菌數(shù)量的測(cè)定若采用平板菌落計(jì)數(shù)法較為費(fèi)時(shí)且誤差較大,利用比色法則更為快捷和準(zhǔn)確。NA培養(yǎng)基比LB培養(yǎng)基營(yíng)養(yǎng)豐富,更適宜姜瘟病菌生長(zhǎng),試驗(yàn)中可根據(jù)實(shí)際情況選擇合適的培養(yǎng)基及發(fā)酵培養(yǎng)時(shí)間。另外,藥劑揮發(fā)后可能不易透過(guò)菌懸液液面起到殺菌效果,因此應(yīng)盡量增大液面面積并使用低速搖床培養(yǎng),使病原菌充分接觸液面空氣。本研究表明,棉隆對(duì)姜瘟病菌活性較低,加之其用量大、成本高、處理時(shí)間長(zhǎng),故不推薦專門(mén)使用棉隆來(lái)控制生姜病害。有研究證明,氯化苦在被激活狀態(tài)下可生成一種誘導(dǎo)細(xì)菌有機(jī)體突變的代謝物,對(duì)土壤桿菌屬細(xì)菌防治效果較好,此外氯化苦還能有效控制土傳病原真菌,如鐮刀菌屬、疫霉屬、腐霉屬、絲核菌屬等,其防治土壤真菌的效果比溴甲烷高近20倍。本研究中氯化苦各濃度組對(duì)姜瘟病菌和生姜莖腐病菌表現(xiàn)出顯著的抑制