咖啡因代謝產(chǎn)物及檢測(cè)方法研究進(jìn)展

咖啡因代謝產(chǎn)物及檢測(cè)方法研究進(jìn)展

咖啡因是提取自茶葉和咖啡果實(shí)中的一種堿性物質(zhì)。這種純茶是由白色和強(qiáng)烈苦的粉末組成的?？Х纫?qū)偌谆S嘌呤生物堿,化學(xué)式為C8H10N4O2,化學(xué)名為1,3,7-三甲基黃嘌呤或3,7-二氫-1,3,7三甲基-1H-嘌呤-2,6-二酮。自從人們認(rèn)識(shí)到咖啡因的用途以來(lái),咖啡因就被人為添加到多種食品、飲料和藥物中,咖啡因與人類(lèi)健康息息相關(guān),并在人們生活中占有不可替代的地位?？Х纫蜻m度地使用有祛除疲勞、興奮神經(jīng)的作用,臨床上用于治療神經(jīng)衰弱和昏迷復(fù)蘇。但是,大劑量或長(zhǎng)期使用也會(huì)對(duì)人體造成損害,特別是其成癮性,一旦停用會(huì)出現(xiàn)精神萎頓、渾身困乏疲軟等各種戒斷癥狀,雖然其成癮性較弱,戒斷癥狀也不十分嚴(yán)重,但由于藥物的耐受性而導(dǎo)致用藥量不斷增加時(shí),咖啡因就不僅作用于大腦皮層,還能直接興奮延髓,引起陣發(fā)性驚厥和骨骼震顫,損害肝、胃、腎等重要內(nèi)臟器官,誘發(fā)呼吸道炎癥、婦女乳腺瘤等疾病,甚至導(dǎo)致吸食者下一代智能低下,肢體畸形,因此也被列入受?chē)?guó)家管制的精神藥品范圍。一、-n-脫甲基化降解信號(hào)通路咖啡因口服后主要在胃腸道快速而完全的吸收,約在15~60分鐘達(dá)峰值濃度,峰值可持續(xù)到120分鐘,胃排空延遲是導(dǎo)致峰值變異的主要原因(Benowitz.1990)。當(dāng)咖啡因由小腸進(jìn)入門(mén)脈循環(huán)時(shí),會(huì)經(jīng)過(guò)首過(guò)消除效應(yīng),主要由分布在腸壁和肝臟的細(xì)胞色素P450(CYP450)酶作用,之后再進(jìn)入全身大循環(huán)。因?yàn)榭Х纫蚴走^(guò)消除效應(yīng)較弱,所以咖啡因經(jīng)吸收后,能完全地進(jìn)入全身組織并且自由通過(guò)血-腦、胎盤(pán)、血-睪屏障(Miners等.1996)?？Х纫蛳到y(tǒng)平均清除率約為150ml/min,半衰期為2~4.5小時(shí)(Lelo等.1986),有的個(gè)體則長(zhǎng)達(dá)12小時(shí)?？Х纫蚋粢挂话憔蜁?huì)被肝臟代謝清除,只有不到5%的咖啡因以原形通過(guò)腎臟排泄(Devoe等.1993)?？Х纫蝮w內(nèi)代謝過(guò)程復(fù)雜,在尿液中現(xiàn)今已發(fā)現(xiàn)咖啡因15種代謝產(chǎn)物,參與代謝過(guò)程的酶也逐一證實(shí)?？诜Х纫蚝?首先經(jīng)3-N-脫甲基化生成17X(副黃嘌呤),為主要代謝產(chǎn)物,約占80%,這一步反應(yīng)由藥物代謝酶CYP1A2催化(部分由CYP2E1代謝)。此外,咖啡因通過(guò)1-N-脫甲基和7-N-脫甲基分別生成37X(可可堿,12%)和13X(膽茶堿,7%),分別由藥物代謝酶CYP1A2和CYP2E1催化完成;13X進(jìn)一步經(jīng)3-N-脫甲基化生成1X(1-甲基嘌呤);17X和1X進(jìn)一步經(jīng)C-8-羥基化分別生成17U和1U,這兩步反應(yīng)分別由CYP2A6和黃嘌呤氧化酶(xanthineoxidase)催化完成。咖啡因及其代謝途徑詳見(jiàn)圖1。17X為主要代謝產(chǎn)物之一,分子結(jié)構(gòu)與咖啡因相近,在血尿標(biāo)本中很容易被檢測(cè),幾乎60%的17X是以原型從尿中排泄(Lelo等.1986,Arnaud等.1980,Klebanoff等.1998)。17X的代謝速度與其生成速度相當(dāng),相對(duì)血漿咖啡因而言,一天中17X的波動(dòng)水平和變異程度較小,血漿中17X的降解速度比咖啡因要慢,通常服藥后8~10小時(shí),17X的血藥濃度超過(guò)咖啡因水平(Arnaud等.1993)。另外兩個(gè)主要代謝產(chǎn)物37X和13X在體液及臍帶血中就能被檢測(cè)到,它們的半衰期相對(duì)較長(zhǎng)。37X是咖啡因的主要活性代謝產(chǎn)物,約50%的37X在8~12小時(shí)內(nèi)由尿液排泄(Tarka等.1983)。37X藥理作用包括利尿、刺激心血管系統(tǒng)、舒張平滑肌、增加腺體分泌(Shively等.1985)。37X的代謝主要由CYP1A2參與,幾乎占86%,部分由CYP2E1完成,其半衰期為7.2~11.5小時(shí),37X血漿和腎清除率分別為46%和67%,吸煙人群中血漿清除率一般高于非吸煙人群33%左右(Shively等.1985,Rostami-Hodjegan等.1986,Lelo等.1986,Birkett等.1985,Gates等.1999)。代謝產(chǎn)物13X結(jié)構(gòu)與咖啡因也相近,僅少一個(gè)7-N-甲基,其藥理活性相近于咖啡因和37X,但是毒性作用卻強(qiáng)于二者,毒性作用比咖啡因持續(xù)時(shí)間長(zhǎng)3~9小時(shí),但是個(gè)體間變異卻比較大(Stavric等.1988)。13X通過(guò)肝腎代謝清除,主要代謝酶為CYP1A2,通過(guò)3-N-去甲基化反應(yīng)生成1X以及8-氫化反應(yīng)生成13U。腎清除率與尿流速和流量高度相關(guān),13X血漿濃度偏高將導(dǎo)致代謝清除率降低并增加腎臟清除率。13X的清除、代謝、排泄,類(lèi)似于咖啡因,均存在較大的個(gè)體差異。常見(jiàn)外源性的影響因素包括:吸煙、病毒感染、心、肝疾患、妊娠、飲食和合并用藥,這些因素均影響13X的代謝和排泄,如吸煙增加其代謝和排泄,懷孕則降低其代謝清除,可以導(dǎo)致13X在體內(nèi)的聚積,而胎兒和新生兒缺少代謝13X的酶,完全依賴(lài)于腎臟的排泄,容易發(fā)生咖啡因中毒。二、其他ayp2a6酶在咖啡因代謝的途徑中,有多種藥物代謝酶參與,主要的藥物代謝酶歸納如下:(一)CYP1A2CYP1A2是細(xì)胞色素P450氧化酶的一個(gè)亞家族,約占肝臟CYP450s酶含量的13%,參與咖啡因、華法林、茶堿、普萘洛爾、美西律、維拉帕米、硝苯地平、他克林、丙咪嗪、氯丙咪嗪、阿米替林、氟伏沙明和氯氮平等20多種臨床常用藥物的代謝。CYP1A2也參與外源性物質(zhì)的代謝,介導(dǎo)許多前致癌原或前毒性物質(zhì)的體內(nèi)激活,同時(shí)也代謝解毒一些有害物質(zhì)。CYP1A2的活性能被吸煙、多環(huán)芳香烴及藥物(如奧美拉唑、卡馬西平)誘導(dǎo),也可被喹諾酮類(lèi)抗生素和口服避孕藥抑制。CYP1A2是參與咖啡因初級(jí)代謝過(guò)程的主要代謝酶,CYP1A2催化咖啡因1-N-和7-N-脫甲基化反應(yīng),此外CYP1A2還參與了咖啡因幾個(gè)次級(jí)代謝產(chǎn)物的生成。CYP1A2同樣也參與了代謝產(chǎn)物17X、37X和13X的N7、N3和N1位脫甲基反應(yīng),分別生成1X、7X和3X。此外,CYP1A2還可能參與了17X、37X和13X8-羥化反應(yīng),分別生成17U、37U和13U。此外,其他藥物酶如CYP2A6、2E1、3A4也在二甲基尿苷代謝產(chǎn)物的生成中發(fā)揮重要作用(Fuhr等.1992,Tang等.1994,Robson等.1988)。(二)CYP2A6CYP2A6是細(xì)胞色素酶P450家族中的重要成員之一,完成整個(gè)CYP450家族代謝任務(wù)的約3%。許多外源性物質(zhì)包括藥物(如香豆素、丙戊烷、氟烷等)、前致癌原(如亞硝胺、尼古丁、黃曲霉素B1等),以及其他一些化學(xué)物質(zhì)均通過(guò)CYP2A6進(jìn)行生物轉(zhuǎn)化。同時(shí),CYP2A6也是尼古丁的主要代謝酶,CYP2A6的活性與個(gè)體吸煙行為以及吸煙數(shù)量相關(guān)。CYP2A6基因突變導(dǎo)致CYP2A6酶活性的降低與多種腫瘤疾病存在負(fù)相關(guān),例如肺癌、結(jié)腸癌、胰腺癌、鼻咽癌等。而影響CYP2A6酶活性的因素多種多樣,年齡、性別、遺傳因素、合并用藥、環(huán)境等都均能對(duì)CYP2A6活性產(chǎn)生影響。CYP2A6參與了咖啡因代謝產(chǎn)物17X的羥化代謝,生成17U,因而尿中咖啡因代謝比率17U/17X可以應(yīng)用于CYP2A6活性的評(píng)價(jià),該比率增加表明CYP2A6活性增加。(三)N-乙酰轉(zhuǎn)移酶(N-acetyltransferase)N-乙酰轉(zhuǎn)移酶參與芳香胺和肼類(lèi)物質(zhì)包括2-氨基芴、4-氨基聯(lián)苯以及聯(lián)苯胺的代謝,外源性的毒物以及臨床用藥包括異煙肼、氨苯砜、普魯卡因胺、磺胺二甲基嘧啶等,因此N-乙?；磻?yīng)可以改變藥物活性及降解致癌物質(zhì)。在咖啡因所有開(kāi)環(huán)的代謝產(chǎn)物中,AFMU及其降解產(chǎn)物AAMU在定量上均具有重要的地位,而N-乙酰轉(zhuǎn)移酶是影響AFMU生成的主要代謝酶(Kilbane等.1992)。(四)黃嘌呤氧化酶(XO)XO(xanthineoxidase)參與了1X到1U的生成,這是沒(méi)有爭(zhēng)議的事實(shí)。然而不管是從137X、37X或13X來(lái)源的3X,均不代謝為3U(Krul等.1998)。(五)CYP3ACYP3A是人體最為重要的藥物代謝酶,在肝和腸道中含量豐富,約占成人肝臟CYP450酶總量的25%,并且為腸道的主要CYP450酶。CYP3A有多種亞型,在成人體內(nèi)主要是CYP3A4和CYP3A5。CYP3A在外源性物質(zhì),尤其是藥物代謝中起重要作用,臨床中約有60%的藥物由其代謝轉(zhuǎn)換;同時(shí)CYP3A也催化許多內(nèi)源性物質(zhì),例如雌二醇、睪丸酮及可的松的6β-羥化代謝。CYP3A酶活性存在顯著的個(gè)體差異性,體外人肝微粒體中CYP3A活性的個(gè)體差異達(dá)40倍,同樣在小腸及肝微粒體中的差異也很大,導(dǎo)致個(gè)體差異的影響因素包括遺傳、環(huán)境、生理、病理及飲食等多種遺傳和非遺傳因素。化學(xué)及免疫抑制試驗(yàn)結(jié)果證明,CYP3A4主要參與了137X到137U的生成代謝(Tassaneeyakul等.1992)。(六)CYP2ElCYP2E1和其他同工酶參與了137X三種脫甲基化產(chǎn)物17X、13X、37X的生成,其中,相對(duì)CYP1A2來(lái)說(shuō),CYP2E1在13X、37X的生成中可能起主導(dǎo)作用(Gu等.1992)。三、血藥濃度和測(cè)定方法關(guān)于咖啡因及其代謝產(chǎn)物的檢測(cè),一直以來(lái)國(guó)內(nèi)外都有較多的研究報(bào)道。然而根據(jù)不同的研究目的,咖啡因代謝產(chǎn)物的選取各不一樣,有些研究關(guān)注咖啡因和幾個(gè)甲基嘌呤代謝產(chǎn)物的檢測(cè),而另外的研究則關(guān)注黃嘌呤和尿酸代謝產(chǎn)物的檢測(cè)。HPLC-UV/DAD法最常用于血尿標(biāo)本咖啡因及其代謝產(chǎn)物的檢測(cè),也有HPLC-MS/MS檢測(cè)方法的報(bào)道,質(zhì)譜檢測(cè)器靈敏度高,離子篩選能力強(qiáng),特異性高,實(shí)現(xiàn)了高通量檢測(cè)的需求,能很好的滿(mǎn)足咖啡因及其代謝產(chǎn)物的同時(shí)檢測(cè)及其定量要求。雖然檢測(cè)儀器代代更新,逐步趨向高尖化,性能也在提高完善,但咖啡因及其代謝產(chǎn)物樣本的前處理環(huán)節(jié)改動(dòng)較少,其流程基本保持不變,可能的原因是咖啡因及其代謝產(chǎn)物各自的理化性質(zhì)差異比較大,所以能同時(shí)滿(mǎn)足這些物質(zhì)萃取條件的要求受到了苛刻的限制。四、固相萃取法咖啡因樣本前處理通常采用有機(jī)溶劑液-液萃取法,常用的萃取試劑為三氯甲烷/異丙醇混合液(90:10或85:15),三氯甲烷/異丙醇不同的比率影響著咖啡因及其代謝產(chǎn)物的萃取效率,而90:10或85:15的配比較為常用。液-液萃取過(guò)程中常需酸化樣本,一是可以穩(wěn)定樣本中咖啡因的代謝產(chǎn)物,減少生物降解;二是酸化樣本可提高待測(cè)物的萃取回收率。除了液-液萃取法外,固相萃取法也是常用的處理方法,固相萃取法節(jié)省試劑,在極性強(qiáng)、小分子物質(zhì)及復(fù)雜物質(zhì)的萃取方面有著較強(qiáng)的優(yōu)勢(shì)。但是固相萃取法的萃取柱造價(jià)高,費(fèi)用貴,使用壽命短,因而消耗大,給普通實(shí)驗(yàn)室樣本的前處理帶來(lái)較大的經(jīng)濟(jì)壓力。此外,也有直接沉淀法處理樣本的報(bào)道,操作中直接往樣本中加入高氯酸,震蕩離心,再用適當(dāng)?shù)膲A中和多余的高氯酸,然后直接進(jìn)色譜分析系統(tǒng)分析。方法簡(jiǎn)單、快速、低廉,為咖啡因及其代謝產(chǎn)物的檢測(cè)提供了一條經(jīng)濟(jì)的樣本前處理方案(Holland等.1998)。此外,尿液標(biāo)本也可經(jīng)酸化、甲醇脫蛋白、離心除雜質(zhì),取上清進(jìn)入液相色譜系統(tǒng)檢測(cè)。值得一提的是,也有研究中采用攪拌棒吸附萃取(stirbarsorptiveextraction,SBSE)的方法,SBSE是上世紀(jì)90年代末Baltussen等發(fā)明的一種新型的樣品前處理技術(shù),具有靈敏度高、重現(xiàn)性好、不使用有機(jī)溶劑等優(yōu)點(diǎn),適用于食品、環(huán)境、生物樣品中揮發(fā)性及半揮發(fā)性有機(jī)物的痕量分析。就咖啡因及其代謝產(chǎn)物的萃取方面而言,SBSE提取設(shè)備可以大大減少咖啡因及其代謝產(chǎn)物的萃取流程,實(shí)現(xiàn)待測(cè)物的直接提取,縮短流程、節(jié)省時(shí)間,但目前應(yīng)用還未得到推廣。五、cyp1a2活性眾所周知,許多CYP450s酶均參與了咖啡因體內(nèi)的生物轉(zhuǎn)換。因?yàn)榭Х纫蚴侨祟?lèi)生活中廣泛接觸的外源物質(zhì),用咖啡因代謝指數(shù)評(píng)估體內(nèi)藥物代謝酶活性的研究近年來(lái)引發(fā)人們極大的興趣。尿液中咖啡因代謝產(chǎn)物的比率(CMRs)常用于藥物代謝酶活性的評(píng)估,包括CYP1A2、CYP2A6、N-乙酰轉(zhuǎn)移酶、黃嘌呤氧化酶?？Х纫蚴荂YP1A2經(jīng)典的探藥,因?yàn)閹缀?0%的咖啡因由CYP1A2轉(zhuǎn)化代謝。血尿中咖啡因代謝比率(17U+17X)/137X、17X/137X和(AFMU+1X)/17U及(AAMU+1X+1U)/17U常用于CYP1A2活性的評(píng)價(jià)(Nakajima等.1994,Lang等.1994)。(AFMU+1X+1U)/17U這一指標(biāo)不受尿流量的影響,主要建立在咖啡因代謝終產(chǎn)物的比率上,因而尿液標(biāo)本的采集量和時(shí)間對(duì)CYP1A2活性的評(píng)價(jià)影響不大。AFMU/1X、AFMU/(AFMU+1X+1U)、(AAMU+AFMU)/(AAMU+AFMU+1X+1U)常用于NAT2的活性評(píng)價(jià)(Bendriss等.2000);17U/17X、17U/(AFMU+1X+1U+17X+17U)常用于CYP2A6活性的評(píng)價(jià);1U/(