綠色熒光蛋白基因克隆及表達(dá)結(jié)題報(bào)告

綠色熒光蛋白基因克隆及表達(dá)1綠色熒光蛋白基因克隆及表達(dá)結(jié)題報(bào)告5/9/2024研究背景PART012綠色熒光蛋白基因克隆及表達(dá)結(jié)題報(bào)告5/9/2024GFP的應(yīng)用主要集中在利用其熒光性質(zhì)的基礎(chǔ)上作為一種標(biāo)記物。GFP近幾年得到了廣泛的應(yīng)用與發(fā)展,成為各研究領(lǐng)域的寵兒,但由于基礎(chǔ)理論研究遠(yuǎn)不及應(yīng)用研究,因而其存在著一些問(wèn)題與不足。3綠色熒光蛋白基因克隆及表達(dá)結(jié)題報(bào)告5/9/2024研究綠色熒光蛋白(GFP)基因的基因克隆及在大腸桿菌中的表達(dá)。通過(guò)質(zhì)粒重組形成所需要的重組質(zhì)粒pET-28a-GFP,將重組質(zhì)粒導(dǎo)入大腸桿菌體內(nèi),通過(guò)酶切、PCR及用IPTG誘導(dǎo)檢測(cè)是否在大腸桿菌體內(nèi)誘導(dǎo)表達(dá)成功。根據(jù)電泳結(jié)果及熒光現(xiàn)象得出結(jié)論，重組質(zhì)粒在大腸桿菌體內(nèi)成功誘導(dǎo)表達(dá)。4綠色熒光蛋白基因克隆及表達(dá)結(jié)題報(bào)告5/9/2024實(shí)驗(yàn)技術(shù)路線圖PART025綠色熒光蛋白基因克隆及表達(dá)結(jié)題報(bào)告5/9/2024菌株培養(yǎng)28a切膠回收質(zhì)粒提取DH5αPEGFP-N3BamH1Not1電泳檢測(cè)質(zhì)粒PEGFP-N3質(zhì)粒提取DH5αPET-28a質(zhì)粒PET-28aGFP連接28a醋酸銨法檢測(cè)合格GFP醋酸鈉沉淀法回收6綠色熒光蛋白基因克隆及表達(dá)結(jié)題報(bào)告5/9/2024轉(zhuǎn)化重組質(zhì)粒酶切鑒定菌落PCR鑒定抗性篩選質(zhì)粒PET-28-GFP轉(zhuǎn)化BL-21PET-28-GFP

誘導(dǎo)表達(dá)

檢測(cè)得到發(fā)光的GFP蛋白DH5α感受態(tài)細(xì)胞質(zhì)粒PET-28-GFPBL-21PET-28-GFP7綠色熒光蛋白基因克隆及表達(dá)結(jié)題報(bào)告5/9/2024實(shí)驗(yàn)材料和方法PART038綠色熒光蛋白基因克隆及表達(dá)結(jié)題報(bào)告5/9/2024耗材：5ml塑料離心管20個(gè),塑料離心管架(30孔)1個(gè),10、100、1000μL微量加樣器各一支,三角瓶300ml一個(gè),100ml一個(gè)及塑料滴管1個(gè),微型瞬間離心管,加樣器及吸頭,經(jīng)高壓滅菌的Eppendorf管,電泳槽,樣品槽模板(梳子),有機(jī)玻璃內(nèi)槽,橡皮膏,錐形瓶(100mL或50mL),玻璃紙,一次性塑料手套,PCR反應(yīng)小管,離心管架,玻璃平皿,生化培養(yǎng)箱各類(lèi)槍頭,離心管,PCR管,離心機(jī)儀器：臺(tái)式高速離心機(jī)SGMA1-13一臺(tái),臺(tái)式Beckman高速冷凍離心機(jī)一臺(tái),制冰機(jī),高速冷凍離心機(jī),恒溫?fù)u床,電熱恒溫培養(yǎng)箱,無(wú)菌操作超凈臺(tái),電熱恒溫水浴,分光光度計(jì),臺(tái)式高速離心機(jī),臺(tái)式高速冷凍離心機(jī),電泳儀、PCR儀，紫外凝膠成像系統(tǒng),微量移液器、微量取液器，臺(tái)式高速離心機(jī),瞬時(shí)離心機(jī),瓊脂糖平板電泳裝置及電泳儀，恒溫水浴鍋,電熱恒溫培養(yǎng)箱,無(wú)菌工作臺(tái),凝膠成像系統(tǒng),

PCR儀,電泳儀。實(shí)驗(yàn)材料9綠色熒光蛋白基因克隆及表達(dá)結(jié)題報(bào)告5/9/2024大腸桿菌DH5α，含有pEGFP質(zhì)粒的DH6α菌株、含有pET-28a（+）質(zhì)粒的DH5α菌株、空載的DH5α和BL21（DE3）菌株。用3~4ml漢Kan+抗性的LB液體培養(yǎng)基培養(yǎng)含有pEGFP質(zhì)粒的DH5α菌和含有pET-28a（+）質(zhì)粒的DH5α菌BamHⅠ和NotⅠ酶，T4噬菌體，DNA連接酶，限制性?xún)?nèi)切酶BufferK。實(shí)驗(yàn)材料10綠色熒光蛋白基因克隆及表達(dá)結(jié)題報(bào)告5/9/2024溶液1－G.E.T緩沖液（pH8.0），溶液2－0.2mol/LNaOH,1%SDS，溶液3－乙酸鉀溶液(3M,pH=4.8)，滅菌蒸餾水，pH7.5~8.0醋酸銨（NH4Ac）7.5mol/L，異丙醇，70％乙醇，無(wú)水乙醇，0.5×TBE緩沖液，平衡液BL，溶膠液PN，漂洗液PW，洗脫緩沖液EB，0.1mol/LCaCl2溶液，卡那霉素100mg/ml，IPTG，2KBDNAMaker，6XLoadingBuffer，酶反應(yīng)終止液(10xLoadingBuffer)，0.25%溴酚藍(lán)，10xPCR緩沖液，瓊脂糖，NaAc，TE緩沖液，酚氯仿，T4DNAligase及其緩沖液(10xligaseBuffer)試劑11綠色熒光蛋白基因克隆及表達(dá)結(jié)題報(bào)告5/9/20241.菌株培養(yǎng)12綠色熒光蛋白基因克隆及表達(dá)結(jié)題報(bào)告5/9/2024將含有pEGFP質(zhì)粒的DH5α菌株、含有pET-28a（+）質(zhì)粒的DH5α菌株、空載的DH5α，分別用3~4mL含有Kan抗性的LB液體培養(yǎng)基37℃培養(yǎng)，搖床過(guò)夜。13綠色熒光蛋白基因克隆及表達(dá)結(jié)題報(bào)告5/9/2024及分析技術(shù)2.質(zhì)粒DNA的提取14綠色熒光蛋白基因克隆及表達(dá)結(jié)題報(bào)告5/9/2024（1）分別取已經(jīng)培養(yǎng)好的含有pEGFP質(zhì)粒和含有pET-28a（+）質(zhì)粒的大腸桿菌DH5α1.5mL置于Eppendorf管中，以12000r/min離心1min，去掉上清；重復(fù)一次。然后將小管倒扣在吸水紙上，盡量除培養(yǎng)基。加入150μL的GET緩沖液，室溫下放置10min。(2)加入200μL的SDS溶液(含NaOH),緩慢輕柔地顛倒4-5次混勻后,冰上放置5min。(3)加入150uL預(yù)冷的KAc,緩慢輕柔地顛倒數(shù)次后冰上放置15min。(4)用臺(tái)式離心機(jī)以12000/min離心5min,取上清液至一新的Eppendorf管中,加入等體積的異丙醇,混勻,室溫放置5min,以12000/min離心5min,棄上清。15綠色熒光蛋白基因克隆及表達(dá)結(jié)題報(bào)告5/9/2024(5)加入200μL的ddH2O溶解沉淀,加入100μL醋酸銨,混勻后冰置5min。(6)以12000r/min離心5min,取上清至一新的Eppendorf管中,加入2倍體積的無(wú)水乙醇,室溫放置5min后,以12000r/min冷凍離心15min,棄上清。(7)沉淀用500μL的70%乙醇洗滌一次,以12000r/min離心5min,棄上清。除盡乙醇后,冷凍干燥5~10min。(8)加入20μL含有RNaseA的ddH20(或TE緩沖液)溶解提取物,充分溶解。16綠色熒光蛋白基因克隆及表達(dá)結(jié)題報(bào)告5/9/20243.DNA瓊脂糖電泳鑒定質(zhì)粒17綠色熒光蛋白基因克隆及表達(dá)結(jié)題報(bào)告5/9/2024（1）制作膠板：瓊脂糖凝膠的制備：稱(chēng)取0.3g瓊脂糖，置于耐高溫高壓試劑瓶中，加入30mLTBE（O.5×TBE）緩沖液，將該試劑瓶放入微波爐加熱2-3次，每次1-2分鐘，直至瓊脂糖溶解，加熱時(shí)要反復(fù)觀察溶液中的瓊脂糖顆粒是否完全溶解并且防止溶液溢出。取有機(jī)玻璃內(nèi)槽，洗浄、晾干。取膠帶將有機(jī)玻璃內(nèi)槽的兩端邊緣封好。將有機(jī)玻璃內(nèi)槽置于一水平位置，放好梳子。將冷卻至65℃左右的瓊脂糖凝膠液充分搖勻，小心地倒在有機(jī)玻璃內(nèi)槽上，控制灌膠速度，使膠液緩慢地展開(kāi)，直到在整個(gè)有機(jī)玻璃板表面形成均勻的膠層。待凝固完全后大約30min，制備好膠板后應(yīng)取下膠帶，將鋪有膠的玻璃內(nèi)槽放在電泳槽中備用。將電泳槽內(nèi)注滿TBE稀釋液，使TBE稀釋液剛沒(méi)過(guò)膠即可。輕輕拔出梳子，在膠板上即形成相互隔開(kāi)的加樣槽。（2）加樣：預(yù)先染色DNA：分別在每個(gè)含有5μL樣品的樣品管內(nèi)加入1μL6XLoadingBuffer，充分混勻，放置30分鐘。在拿新的管加入10μLMarker和2μL的6XLoadingBuffer.。用移液槍進(jìn)行點(diǎn)樣。（3）電泳：連接電泳槽與電泳儀的正負(fù)極。通電，進(jìn)行電泳。（4）拍照觀察：將電泳結(jié)東后的凝膠放置成像儀上，用凝膠自動(dòng)成像儀處理凝膠，拍攝照片，分析結(jié)果。18綠色熒光蛋白基因克隆及表達(dá)結(jié)題報(bào)告5/9/20244.DNA酶切19綠色熒光蛋白基因克隆及表達(dá)結(jié)題報(bào)告5/9/2024用限制性?xún)?nèi)切酶BamHⅠ和NotⅠ切下EGFP片段,同時(shí)酶切pET-28a及pEGFP-N3載體。體系如表所示,37℃酶切3小時(shí)。20綠色熒光蛋白基因克隆及表達(dá)結(jié)題報(bào)告5/9/20245.DNA瓊脂糖電泳和切膠回收所需酶切產(chǎn)物片段21綠色熒光蛋白基因克隆及表達(dá)結(jié)題報(bào)告5/9/2024（1）DNA瓊脂糖電泳:稱(chēng)取0.4g瓊脂糖，加入40mLTBE（O.5×TBE）緩沖液,制作瓊脂糖凝膠板，對(duì)酶切產(chǎn)物進(jìn)行電泳分離;將25μL酶切產(chǎn)物加入加樣孔中,使用120V電壓對(duì)酶切產(chǎn)物進(jìn)行電泳分離。電泳結(jié)束后觀察結(jié)果,并且拍照;（2）酶切產(chǎn)物的回收：將質(zhì)粒的酶切產(chǎn)物補(bǔ)水至200μL，加1/10體積（20μL）3MNaAc和2倍體積（400μL）冰冷的無(wú)水乙醇。置于-20℃冰箱，放置30min以上。4℃，12000rpm離心10min，棄上清，加0.5mL70%乙醇洗2次。棄上清，室溫于燥，溶解至10μL無(wú)菌水中。（3）瓊脂糖凝膠中回收目的DNA酶切產(chǎn)物片段（凝胺回收試劑盒）柱平衡:向吸附柱Ca2中（吸附柱放入收集管中）加入500μL平衡液BL，12000rpm離心1min，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱重新放入收集管中。在長(zhǎng)波紫外燈下，用干凈的刀片將單一的DNA條帶從凝膠上切下目的基因EGFP片段（盡量切除不含DNA的凝膠），放入干凈的離心管中，稱(chēng)取重量。膠塊中加入等體積的溶膠液PN，以0.1g凝膠對(duì)應(yīng)100pL的體積加入溶膠液PN，在50℃水浴中放置10min，其間不斷溫和上下翻動(dòng)離心管至膠完全融解；將上一步得到的溶液加入到吸附柱Ca2中，（吸附柱放入收集管），室溫靜置2min，12000r/min離心30-60s，將收集管中廢液棄掉，將吸附柱Ca2放入收集管中。向吸附柱Ca2中加入600μL漂洗液PW，12000r/min離心30-60s，將收集管中廢液棄掉，將吸附柱Ca2放入收集管中。22綠色熒光蛋白基因克隆及表達(dá)結(jié)題報(bào)告5/9/2024重復(fù)步驟上述步驟。將吸附柱Ca2放回收集管中，12000r/min離心2min，室溫放置數(shù)分鐘，徹底除去漂洗液PW。將吸附柱Ca2，置于室溫10分鐘，向吸附膜的中間位置懸空滴加適量洗脫緩沖液EB，室溫放置2min，12000r/min離心2min，收集DNA溶液。23綠色熒光蛋白基因克隆及表達(dá)結(jié)題報(bào)告5/9/20246.連接反應(yīng)24綠色熒光蛋白基因克隆及表達(dá)結(jié)題報(bào)告5/9/2024（1）將酶切后的片段用T4-DNA連接酶相連（2）16℃連接過(guò)夜。25綠色熒光蛋白基因克隆及表達(dá)結(jié)題報(bào)告5/9/20247.宿主菌培養(yǎng)及感受態(tài)制備26綠色熒光蛋白基因克隆及表達(dá)結(jié)題報(bào)告5/9/2024(1)加400μL過(guò)夜菌液至20mlBL液體培養(yǎng)基，放入37℃搖床中震蕩培養(yǎng)2小時(shí)，當(dāng)培養(yǎng)液開(kāi)始出現(xiàn)混濁后，用分光光度計(jì)測(cè)600nm光吸值，A600nm<=0.7。(2)無(wú)菌條件下用滅菌的鑷子取出一個(gè)滅菌的Eppendorf管，每管加菌液1.5mL，離心6000r/min離心2min,棄上清。(3)每管加入600uL冰冷的0.1mol/L的CaCl2，懸浮菌液,迅速冰上放置5min，離心6000r/min離心4min，棄去上清液。(5)每管加入300μL冰冷的0.1mol/LCaCl2液,小心懸浮細(xì)胞,迅速冰上放置,即制成了感受態(tài)細(xì)胞懸液感受態(tài)，分裝3管，每管100μL,冰上放置以備使用。27綠色熒光蛋白基因克隆及表達(dá)結(jié)題報(bào)告5/9/20248.轉(zhuǎn)化28綠色熒光蛋白基因克隆及表達(dá)結(jié)題報(bào)告5/9/2024(1)將分裝的兩管進(jìn)行標(biāo)號(hào)，1號(hào)管為陰性對(duì)照，不含任何質(zhì)粒，2號(hào)管為陽(yáng)性對(duì)照，加入2μl的自提pET-28a，3號(hào)管為試驗(yàn)樣品，加入4μl的連接產(chǎn)物,混勻后，冰上放置30min;(2)將冰浴好的1、2、3號(hào)管放入水浴鍋中42℃保溫90s，之后立即放入冰上冷卻3-5分鐘。(3)在超凈臺(tái)中加入100μlLB液體培養(yǎng)基,搖勻后37℃震蕩培養(yǎng)15-30分鐘。(4)倒平板：倒第一個(gè)平板標(biāo)記為1號(hào)k-，后往培養(yǎng)基中加入60μl的Kna，繼續(xù)倒第二個(gè)平板標(biāo)記為1號(hào)k+，第三個(gè)平板標(biāo)記為2號(hào)k+，第四個(gè)平板標(biāo)記為3號(hào)k+。(5)涂板:各取1號(hào)管的菌液100μl涂布在1號(hào)k-和k+平板上，取2號(hào)管菌液100μl涂布在2號(hào)平板上,取3號(hào)管菌液100μl涂布在3號(hào)平板上。菌液完全被培養(yǎng)基吸收后，倒置培養(yǎng)皿，于37℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)12-16小時(shí)，待菌落生長(zhǎng)良好而又未互相重疊時(shí)停止培養(yǎng)。29綠色熒光蛋白基因克隆及表達(dá)結(jié)題報(bào)告5/9/20249.轉(zhuǎn)板30綠色熒光蛋白基因克隆及表達(dá)結(jié)題報(bào)告5/9/2024挑取轉(zhuǎn)化產(chǎn)物生長(zhǎng)的板上陽(yáng)性菌落,轉(zhuǎn)接到新的Kan抗性板上,37℃培養(yǎng)。31綠色熒光蛋白基因克隆及表達(dá)結(jié)題報(bào)告5/9/202410.PCR篩選32綠色熒光蛋白基因克隆及表達(dá)結(jié)題報(bào)告5/9/2024然后進(jìn)行PCR篩選。每人取兩個(gè)PCR專(zhuān)用管，按照下表體系添加試劑。PCR反應(yīng)各步驟時(shí)間和溫度分別為:94℃5min,94℃30s,55℃30s,72℃1min.30cycles,72℃7min。DNA電泳檢驗(yàn)擴(kuò)增片段,選出能夠得到700bp左右片段的陽(yáng)性克隆。33綠色熒光蛋白基因克隆及表達(dá)結(jié)題報(bào)告5/9/202411.陽(yáng)性菌株培養(yǎng)34綠色熒光蛋白基因克隆及表達(dá)結(jié)題報(bào)告5/9/2024等轉(zhuǎn)板的菌長(zhǎng)出以后,挑取2~3個(gè)陽(yáng)性克隆搖菌,37℃過(guò)夜。35綠色熒光蛋白基因克隆及表達(dá)結(jié)題報(bào)告5/9/202412.重組質(zhì)粒提取36綠色熒光蛋白基因克隆及表達(dá)結(jié)題報(bào)告5/9/2024(1)取已經(jīng)培養(yǎng)好的含有pEGFP和pET-28a重組質(zhì)粒1.5mL置于Eppendorf管中，以10000r/min離心1min，去掉上清；重復(fù)一次。然后將小管倒扣在吸水紙上，并用移液槍吸出多余的菌液，盡量除盡。加入150μL的GET緩沖液，充分混勻，室溫下放置10min。使用EDTA是為了除去細(xì)胞壁上的Ca2+，使溶菌酶更易與細(xì)胞壁接觸。(2)加入200μL新配置的0.2mol/LNaO(內(nèi)含1％SDS),緩慢輕柔地顛倒2-3次混勻后,冰上放置5min。SDS能使細(xì)胞膜裂解，并使蛋白質(zhì)變性。(3)加入150uL預(yù)冷的KAc,緩慢輕柔地顛倒數(shù)次后冰上放置15min。(4)用臺(tái)式離心機(jī)以12000/min離心5min,取上清液至一新的Eppendorf管中。(5)加入等體積的異丙醇,混勻,室溫放置5min,以12000/min離心5min,棄上清。(6)加入200μL的ddH2O溶解沉淀,加入100μL醋酸銨,混勻后冰置3-5min。以12000r/min離心5min,取上清。(7)轉(zhuǎn)以上清至一新的Eppendorf管中,加入等體積的異丙醇或2倍體積的無(wú)水乙醇,-20℃冷凍30min后，以12000r/min冷凍離心10min,棄上清。(8)沉淀用500μL的70%乙醇洗滌一次,以12000r/min離心5min,棄上清。除盡乙醇后,打開(kāi)蓋子自然干燥。(9)加入30μL的ddH20溶解提取物,充分溶解，室溫放置10min以上，放入4℃冰箱待用。37綠色熒光蛋白基因克隆及表達(dá)結(jié)題報(bào)告5/9/202413.重組質(zhì)粒酶切鑒定38綠色熒光蛋白基因克隆及表達(dá)結(jié)題報(bào)告5/9/2024用BamHⅠ和NotⅠ同時(shí)對(duì)提取的質(zhì)粒進(jìn)行酶切,每個(gè)反應(yīng)體系如下瓊脂糖電泳,對(duì)酶切產(chǎn)物條帶進(jìn)行分析,確定正確連入外源ECFP片段的pET-28a融合質(zhì)粒。39綠色熒光蛋白基因克隆及表達(dá)結(jié)題報(bào)告5/9/202414.BI21(DE3)培養(yǎng)及感受態(tài)細(xì)胞制備40綠色熒光蛋白基因克隆及表達(dá)結(jié)題報(bào)告5/9/2024(1)加400μL過(guò)夜菌液至20mlBL液體培養(yǎng)基，放入37℃搖床中震蕩培養(yǎng)2小時(shí)，當(dāng)培養(yǎng)液開(kāi)始出現(xiàn)混濁后，用分光光度計(jì)測(cè)600nm光吸值，A600nm<=0.7。(2)無(wú)菌條件下用滅菌的鑷子取出一個(gè)滅菌的Eppendorf管，每管加菌液1.5mL，離心6000r/min離心2min,棄上清。(3)每管加入600uL冰冷的0.1mol/L的CaCl2，懸浮菌液,迅速冰上放置5min，離心6000r/min離心4min，棄去上清液。(5)每管加入200μL冰冷的0.1mol/LCaCl2液,小心懸浮細(xì)胞,迅速冰上放置,即制成了感受態(tài)細(xì)胞懸液感受態(tài)，分裝兩管，每管100μL,冰上放置以備使用。41綠色熒光蛋白基因克隆及表達(dá)結(jié)題報(bào)告5/9/202415.轉(zhuǎn)化入表達(dá)載體42綠色熒光蛋白基因克隆及表達(dá)結(jié)題報(bào)告5/9/2024(1)將分裝的兩管進(jìn)行標(biāo)號(hào)，一管為1號(hào)管，另一管為2號(hào)。1號(hào)管中不加任何質(zhì)粒，2號(hào)管終加入3μl的連接產(chǎn)物在感受態(tài)細(xì)胞懸液中,混勻后，冰上放置30min;(2)將冰浴好的1、2號(hào)管放入水浴鍋中42℃保溫90s，之后立即放入冰上冷卻3-5分鐘。(3)在超凈臺(tái)中加入100μlLB液體培養(yǎng)基,搖勻后37℃震蕩培養(yǎng)15-30分鐘。(4)倒平板：倒第一個(gè)平板標(biāo)記為1號(hào)k-，后往培養(yǎng)基中加入45μl的Kna，繼續(xù)倒第二個(gè)平板標(biāo)記為1號(hào)k+，第三個(gè)平板標(biāo)記為2號(hào)k+，第四個(gè)平板標(biāo)記為2號(hào)k+，待平板冷卻后將IPTG均勻徒步在2號(hào)k+平板上。(5)涂板:各取1號(hào)管的菌液100μl涂布在1號(hào)平板上，各取2號(hào)管菌液100μl涂布在2號(hào)平板上,涂布完成后37℃倒置培養(yǎng)(6)第二天在熒光激發(fā)下可看到平板上長(zhǎng)出綠色菌落,照相保存結(jié)果。此時(shí)完全證明綠色熒光蛋白已得到表達(dá)。43綠色