食品檢測(cè)培訓(xùn)課件

一、微生物檢測(cè)工作的意義據(jù)世界衛(wèi)生組織估計(jì)，在全世界每年數(shù)以億計(jì)的食源性疾病患者中，70％是由于食用了各種致病性微生物污染的食品和飲水造成的。2000年至2002年，中國疾病預(yù)防控制中心營(yíng)養(yǎng)與食品安全所對(duì)全國部分省市的生肉、熟肉、乳和乳制品、水產(chǎn)品、蔬菜中的致病菌污染狀況的監(jiān)測(cè)結(jié)果表明，微生物性食物中毒仍居首位，占39.62％；化學(xué)性食物中毒占38.56％；動(dòng)植物性和原因不明的食物中毒均占10％左右。傳統(tǒng)的微生物檢測(cè)方法，主要包括形態(tài)檢查和生化方法，涉及的實(shí)驗(yàn)較多、操作繁瑣、需要時(shí)間較長(zhǎng)、準(zhǔn)備和收尾工作繁多。1955年德國學(xué)者F.J.Forg發(fā)明了一種簡(jiǎn)單快速的大腸菌群快速檢測(cè)法—紙片法，使原來的檢測(cè)周期由72小時(shí)縮短到15小時(shí)，材料成本降低了四分之三，同時(shí)大大簡(jiǎn)化了操作程序。從此，這種生化檢測(cè)方法開始發(fā)展起來。另外，將培養(yǎng)基固化在試劑盒中的速測(cè)盒法，也是一種較為簡(jiǎn)潔快速的檢測(cè)方法，省去了大量的實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備工作。二、開展微生物檢測(cè)所需的基本條件無菌室（含紫外燈等消毒設(shè)備的隔離空間）；恒溫培養(yǎng)箱；微生物檢測(cè)設(shè)備、器皿、試劑等；高壓滅菌鍋；（滅菌是否徹底）具備以上設(shè)備和無菌操作概念即可進(jìn)行檢測(cè)了。滅菌徹底與否指示滅菌指示膠帶（3M）生物指示（嗜熱脂肪芽孢桿菌121.1℃）紫外燈相關(guān)強(qiáng)度：對(duì)室內(nèi)空氣的消毒，直接照射法：采用室內(nèi)懸吊式紫外線消毒時(shí)，室內(nèi)安裝紫外線消毒燈（30Ｗ紫外燈，在1.0m處的強(qiáng)度>70μW/cm2）的數(shù)量為平均每立方米不少于1.5W，照射時(shí)間不少于30min。

更換頻率：紫外線燈使用過程中其輻照強(qiáng)度逐漸降低，故應(yīng)定期測(cè)定消毒紫外線的強(qiáng)度，一旦降到要求的強(qiáng)度以下時(shí)，應(yīng)及時(shí)更換。紫外線消毒燈的使用壽命，即由新燈的強(qiáng)度降低到70μW/cm2的時(shí)間(功率≥30W)，或降低到原來新燈強(qiáng)度的70%（功率<30Ｗ）的時(shí)間，應(yīng)不低于1000h。紫外線燈管有高硼玻璃和石英玻璃之分，由于高硼玻璃的UV254nm紫外線透過率只有50%左右，一般只有1000小時(shí)；石英是紫外線透過率最高的材料，普通石英可以透過UV254的80%以上，石英玻璃紫外線燈壽命一般大于6000小時(shí)，進(jìn)口的紫外線燈可以到8000h以上，部分廠家可以達(dá)到1200小時(shí)。紫外線強(qiáng)度計(jì)至少1年標(biāo)定1次。紫外線輻照時(shí)間計(jì)算照射劑量和時(shí)間：不同種類的微生物對(duì)紫外線的敏感性不同，用紫外線消毒時(shí)必須使用照射劑量達(dá)到殺滅目標(biāo)微生物所需的照射劑量。

殺滅一般細(xì)菌繁殖體時(shí)，應(yīng)使照射劑量達(dá)到10000μW.s/cm2；殺滅細(xì)菌芽孢時(shí)應(yīng)達(dá)到100000μW.s/cm2；病毒對(duì)紫外線的抵抗力介于細(xì)菌繁殖體和芽胞之間；真菌孢子的抵抗力比細(xì)菌芽孢更強(qiáng)，有時(shí)需要照射到600000μW.s/cm2，但一般致病性真菌對(duì)紫外線的抵抗力比細(xì)菌芽胞弱；在消毒的目標(biāo)微生物不詳時(shí)，照射劑量不應(yīng)低于100000μW.s/cm2。輻照劑量是所用紫外線燈在照射物品表面處的輻照強(qiáng)度和照射時(shí)間的乘積。因此，根據(jù)紫外線光源的輻照強(qiáng)度，可以計(jì)算出需要照射的時(shí)間。例如，用輻照強(qiáng)度為70μW/cm2的紫外線表面消毒器近距離照射物品表面，選擇的輻照劑量是100000μW.s/cm2，則需照射的時(shí)間是：

100000μW.s/cm2÷70μW/cm2=1429s÷60s≌24min。

1、概念的理解無菌是指物體中沒有活的微生物存在。防止微生物進(jìn)入人體或物體的操作方法，稱為無菌技術(shù)或無菌操作。關(guān)鍵點(diǎn)：人：操作前洗手更衣等物：試劑器械環(huán)境：無菌室三、無菌操作和注意事項(xiàng)四、革蘭氏染色

革蘭氏染色法是細(xì)菌學(xué)中廣泛使用的一種鑒別染色法，1884年由丹麥醫(yī)師、細(xì)菌學(xué)家ChristainGram創(chuàng)立。步驟：a.將涂片在火焰上固定，滴加結(jié)晶紫染液，染1min，水洗。b.滴加革蘭氏碘液，作用lmin，水洗。c.滴加95%乙醇脫色約15-30s，直至染色液被洗掉，不要過分脫色，水洗。d.滴加復(fù)染液，復(fù)染lmin，水洗、待干、鏡檢。原理：細(xì)菌先經(jīng)堿性染料結(jié)晶紫染色，而經(jīng)碘液媒染后，用酒精脫色，在一定條件下有的細(xì)菌此色不被脫去，有的可被脫去，因此可把細(xì)菌分為兩大類，前者叫做革蘭氏陽性菌（G+），后者為革蘭氏陰性菌（Gˉ）。G﹢菌：細(xì)胞壁厚，肽聚糖網(wǎng)狀分子形成一種透性障，當(dāng)乙醇脫色時(shí)，肽聚糖脫水而孔障縮小，故保留結(jié)晶紫-碘復(fù)合物在細(xì)胞膜上。呈紫色。Gˉ菌：肽聚糖層薄，交聯(lián)松散，乙醇脫色不能使其結(jié)構(gòu)收縮，其脂含量高,乙醇將脂溶解，縫隙加大，結(jié)晶紫-碘復(fù)合物溶出細(xì)胞壁，番紅染液復(fù)染后呈紅色。革蘭氏陽性菌：葡萄球菌屬（主要是金黃色葡萄球菌）、蠟樣芽孢桿菌、單增李斯特氏菌等；革蘭氏陰性菌：埃希氏菌屬、沙門氏菌屬、志賀氏菌屬（痢疾桿菌等）、霍亂弧菌、副溶血性弧菌等。五、BSL簡(jiǎn)介biologysecuritylevel(BSL):生物安全水平根據(jù)所用病原微生物的危害程度、對(duì)人和動(dòng)物的易感性、氣溶膠傳播的可能性、預(yù)防和治療的可行性等因素，其實(shí)驗(yàn)室生物安全水平共分為四級(jí)，一級(jí)最低，四級(jí)最高。一級(jí)生物安全水平（BSL-1）：能夠安全操作，對(duì)實(shí)驗(yàn)室工作人員和動(dòng)物無明顯致病性的，對(duì)環(huán)境危害程度微小的，特性清楚的病原微生物的生物安全水平。二級(jí)生物安全水平（BSL-2）：能夠安全操作，對(duì)實(shí)驗(yàn)室工作人員和動(dòng)物致病性低的，對(duì)環(huán)境有輕微危害的病原微生物的生物安全水平。如：大腸埃希氏菌三級(jí)生物安全水平（BSL-3）：能夠安全地從事國內(nèi)和國外的，可能通過呼吸道感染，引起嚴(yán)重或致死性疾病的病原微生物工作的生物安全水平。如：炭疽芽孢桿菌、鼠疫桿菌、結(jié)核分枝桿菌、狂犬病毒

四級(jí)生物安全水平（BSL-4）：能夠安全地從事國內(nèi)和國外的，能通過氣溶膠傳播，實(shí)驗(yàn)室感染高度危險(xiǎn)，嚴(yán)重危害人和動(dòng)物生命和環(huán)境的，沒有特效預(yù)防和治療方法的微生物工作的生物安全水平。與上述相近的或有抗原關(guān)系的，但尚未完全認(rèn)識(shí)的病原體也應(yīng)在此種水平條件下進(jìn)行操作，直到取得足夠的數(shù)據(jù)后，才能決定是繼續(xù)在此種安全水平下工作還是在低一級(jí)安全水平下工作。如：埃博拉病毒、馬爾堡病毒、天花病毒

六、提高檢測(cè)速度的一些方法一、設(shè)備更新：移液管、吸球/移液器普通高壓蒸汽滅菌器/全自動(dòng)高壓蒸汽滅菌器攪拌器或勻漿機(jī)/拍擊式均質(zhì)器二、采用快速檢測(cè)方法進(jìn)行粗篩紙片法快速檢測(cè)試劑盒測(cè)試片檢測(cè)結(jié)果圖像七、常見微生物檢測(cè)設(shè)備Biolog微生物鑒定數(shù)據(jù)庫容量是目前世界上最大的，可鑒定包括細(xì)菌、酵母和絲狀真菌在內(nèi)總計(jì)1973種微生物，涵蓋了所有的人類、動(dòng)物、植物病原菌以及食品和部分環(huán)境微生物，其中細(xì)菌234個(gè)屬，1226個(gè)種。Biolog全自動(dòng)快速微生物鑒定儀原理：

Biolog自動(dòng)微生物分析系統(tǒng)主要根據(jù)細(xì)菌等95種碳源的利用情況,配合四唑類顯色物質(zhì)進(jìn)行鑒定。分子生物學(xué)細(xì)菌鑒定1.16SrRNA分析

2.特異片段擴(kuò)增3.DNA指紋技術(shù)（RFLP－DNA的限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性,RAPD-隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性)PCR儀BDPhoenixSystem“鳳凰”

全自動(dòng)細(xì)菌/鑒定藥敏系統(tǒng)

1．概況1998年BectonDickinsonandCompany公司Phonenix全自動(dòng)細(xì)菌鑒定藥敏系統(tǒng)

原理采用熒光增強(qiáng)原理與傳統(tǒng)酶、底物生化呈色反應(yīng)結(jié)合。（菌種庫270種細(xì)菌）MicroScan微生物自動(dòng)鑒定及藥敏系統(tǒng)概況

MicroScan自動(dòng)細(xì)菌鑒定系統(tǒng)包括半自動(dòng)系列AutoScan-4以及全自動(dòng)系列Walkaway40/96。是美國最普遍使用的鑒定系列之一。

原理將熒光物質(zhì)均勻地混在培養(yǎng)基中，菌種接種到鑒定板，通過檢測(cè)熒光底物的水解、底物被利用后的pH變化，特殊代謝產(chǎn)物的生成和某些代謝產(chǎn)物的生成率來進(jìn)行菌種鑒定。原理：采用傳統(tǒng)生化反應(yīng)，8進(jìn)位數(shù)碼鑒定及熒光分析相結(jié)合。熒光分析是用熒光標(biāo)記細(xì)菌表面特異酶的底物，經(jīng)細(xì)菌水解底物產(chǎn)生熒光來判斷結(jié)果Sensititre(自動(dòng)熒光法微生

物鑒定藥敏分析系統(tǒng)）AutoReaderARIS（可以自動(dòng)孵育）VITEK

VITEK-ATB(半自動(dòng)微生物鑒定和藥敏系統(tǒng))

Vitek-AMS（全自動(dòng)細(xì)菌鑒定和藥敏分析系統(tǒng)）VitekIIVIDAS原理：VIDAS(bioMerieuxVitek公司)是應(yīng)用酶聯(lián)免疫熒光試驗(yàn)(ELFA)檢測(cè)食品中的病原菌。即用熒光標(biāo)記后的抗體檢測(cè)特異性的抗原(沙門氏菌、李斯特菌、葡萄球菌毒素、E．ColiO157和單核細(xì)胞增生李斯特氏菌)FDA認(rèn)可使用的檢測(cè)系統(tǒng)

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