DB22-T2049-2014-動物源性飼料中鴨源性成分測定PCR方法-吉林省

ICS65.120B46DB22吉林省地方標準DB22/T2049—2014動物源性飼料中鴨源性成分測定PCR方法吉林省質(zhì)量技術監(jiān)督局發(fā)布DB22/T2049—2014前言本標準按照GB/T1.1-2009和GB/T20001.4-2001給出的規(guī)則起草。本標準由吉林省質(zhì)量技術監(jiān)督局提出并歸口。本標準主要起草單位：吉林省產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗院、國家農(nóng)業(yè)深加工產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗中心、中華人民共和國吉林出入境檢驗檢疫局。本標準主要起草人：史艷宇、劉金華、邴煒、王瑩、周亮、呂航、郎樂、張慶波、宮國強。IDB22/T2049—2014動物源性飼料中鴨源性成分測定PCR方法1范圍本標準規(guī)定了動物源性飼料中鴨源性成分的PCR檢測方法，該方法的檢出限為0.1%。本標準適用于動物源性飼料中鴨源性成分的定性檢測。2規(guī)范性引用文件下列文件對于本文件的應用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，僅所注日期的版本適用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。GB/T6682分析實驗室用水規(guī)格和試驗方法GB/T27403實驗室質(zhì)量控制規(guī)范食品分子生物學檢測3術語和定義下列術語和定義適用于本文件。3.1鴨源性成分duck-derivedmaterials鴨種屬特異性DNA片段。除特別說明以外，所有試劑均為分析純，水為按照GB/T6682規(guī)定的一級水。所有試劑均用無DNA酶污染的容器分裝。5.1鴨源性成分檢測用引物（對）序列為：a)b)上游引物：5’-CATCTATCCTGCTAGCCGCC-3’下游引物：5’-GGCTTGAGTGGAAGAATGCC-3’5.3dNTP：dATP（deoxyadenosinetriphosphate，脫氧腺苷三磷酸）、dGTP（deoxyguanosinatriphosphate，脫氧鳥苷三磷酸）、dCTP（deoxycytidinetriphosphate，脫氧胞苷三磷酸）、dTTP（deoxythymidinetriphosphate，脫氧胸苷三磷酸）。5.7三羥甲基氨基甲烷（Tris）。1DB22/T2049—20145.9三水合乙酸鈉、氯化鈉。5.10十六烷基三甲基溴化銨（cetyltrithylammoniumbromide，CTAB）。5.11乙二胺四乙酸二鈉鹽（EDTA-Na2·2H2O）。5.1275%乙醇、異丙醇、三氯甲烷、異戊醇、正己烷等有機試劑。5.1310×PCR緩沖液：含200mmol/LTris-HCl（pH8.4），200mmol/L氯化鉀（KCl），15mmol/L氯化鎂（MgCl2）。5.14分子量標記：100bp~3000bpDNAMarker。5.15酶切緩沖液：含10mmol/LTris-HCl（pH7.5），10mmol/LMgCl2，50mmol/LNaCl，0.1mg/mLBSA。5.16RNaseA酶溶液：用高壓滅菌的去離子水溶解RNaseA酶為10mg/mL的溶液，分裝后于-20℃保存，避免反復凍融。5.17蛋白酶K溶液：用高壓滅菌的去離子水溶解蛋白酶K為20mg/mL的溶液，分裝后于-20℃保存，避免反復凍融。5.18乙酸鈉溶液，3mol/L：在80mL水中，加入40.81g三水合乙酸鈉，溶解后用冰乙酸調(diào)節(jié)pH值到5.2，用水定容到100mL，分裝后高壓滅菌。5.19Tris-HCl，1mol/L，pH8.0：在800mL去離子水中溶解121.1gTris，冷卻至室溫后用濃鹽酸調(diào)節(jié)溶液的pH值至8.0，加水定容至1L，分裝后高壓滅菌。5.20EDTA，0.5mol/L，pH8.0：稱取186.1gEDTA-Na2·2H2O，加入700mL水中，在磁力攪拌器上劇烈攪拌，用10mol/L氫氧化鈉調(diào)pH值至8.0，用水定容到1L，分裝后高壓滅菌。5.21CTAB提取緩沖液I：在800mL去離子水中加入46.75g氯化鈉，溶解后加入1mol/LTris-HCl（pH8.0）50mL，0.5mol/LEDTA（pH8.0）20mL，在磁力攪拌器上劇烈攪拌，用10mol/L氫氧化鈉調(diào)節(jié)溶液的pH值至8.0，用水定容至1L，分裝后高壓滅菌。5.22CTAB提取緩沖液II：在800mL去離子水中加入46.75g氯化鈉，20gCTAB，完全溶解后加入1mol/LTris-HCl（pH8.0）50mL，0.5mol/LEDTA（pH8.0）20mL，用水定容至1L，分裝后高壓滅菌。5.23Tris飽和苯酚和三氯甲烷混合液，V(Tris飽和苯酚)+V(三氯甲烷)=1+1。5.24三氯甲烷和異戊醇混合液，V(三氯甲烷)+V(異戊醇)=24+1。5.25TE緩沖液（pH8.0）：在800mL水中，依次加入10mL的1mol/LTris-HCl（pH8.0）和2mL的0.5mol/LEDTA（pH8.0），用水定容到1L，分裝后高壓滅菌。5.26電泳緩沖液：Tris54g，硼酸27.5g，0.5mol/LEDTA溶液（pH8.0）20mL，加蒸餾水至1000mL；使用時10倍稀釋。5.28加樣緩沖液：稱取溴酚藍250mg，加水10mL，在室溫下過夜溶解；再稱取二甲腈藍250mg，用10mL水溶解；稱取蔗糖50g，用30mL水溶解，合并三種溶液，用水定容至100mL，在4℃保存。6.3離心機：轉(zhuǎn)速≥12000r/min。6.4核酸蛋白分析儀或紫外分光光度計。6.5電泳儀。2DB22/T2049—20146.6凝膠成像分析系統(tǒng)。6.7恒溫水浴鍋。6.8高壓滅菌器。6.9pH計。6.10移液器：0.5μL～10μL、10μL～100μL、20μL～200μL、200μL～1000μL。6.11振蕩器。7檢測步驟7.1試樣的預處理50g固體樣品粉碎，顆粒大小在0.125mm以下。7.2DNA提取和純化7.2.1CTAB法制備非油脂類飼料模板DNA稱取100mg經(jīng)預處理的試樣于1.5mL離心管中，加入300μL冰上預冷的CTAB提取緩沖液I，加入500μL于65℃預熱的CTAB提取緩沖液II，混勻，65℃保溫30min～90min，期間不時輕緩顛倒混勻；加入5μL~25μL蛋白酶K溶液，上下倒轉(zhuǎn)混勻，37℃水浴中保溫1h，中途每隔10min左右倒轉(zhuǎn)混合數(shù)次；待冷卻至室溫后加入5μLRNaseA溶液（10mg/mL)，室溫下放置30min；室溫12000r/min離心10min，取上清液，于另一干凈的2mL離心管中，分別用等體積Tris飽和苯酚、Tris飽和苯酚+三氯甲烷（1+1）和三氯甲烷+異戊醇（24+1）抽提三次，12000r/min離心10min；將上清液轉(zhuǎn)移至干凈的2mL離心管中，加入等體積異丙醇及1/10體積的3mol/L乙酸鈉溶液，輕緩顛倒混勻；12000r/min離心10min，棄上清液，用500μL75%乙醇洗滌沉淀兩次；除去殘留的乙醇，干燥后，DNA沉淀溶解于100μLTE緩沖液（預先加熱至65℃有利于溶解DNA）中，-20℃保存?zhèn)溆谩?.2.2CTAB法制備油脂類飼料模板DNA取油脂飼料適量（液態(tài)油取30mL、磷脂類和固態(tài)油脂取5g）放入250mL三角瓶中，加入25mL正己烷，于磁力攪拌器上不斷振蕩混合2h后，加入25mLCTAB提取緩沖液II，繼續(xù)于磁力攪拌器上振蕩混合2h；將溶液轉(zhuǎn)入100mL離心管中，于8000r/min離心10min，使有機相和水相分離，取下層水相，加入與下層水相溶液等體積的異丙醇及水相溶液1/10體積的3mol/L乙酸鈉溶液，輕緩顛倒混勻，室溫放置10min；12000r/min離心10min，棄上清液，待沉淀干燥后用200μLTE緩沖液溶解沉淀，加入200μLTris飽和苯酚+三氯甲烷（1+1），輕緩顛倒混勻溶液；12000r/min離心10min，取上清液，加入與上清液等體積三氯甲烷+異戊醇（24+1），輕緩顛倒混勻，12000r/min離心2min至分層；將上清液轉(zhuǎn)移至干凈的離心管中，加入與溶液等體積的異丙醇及溶液1/10體積的3mol/L乙酸鈉溶液，輕緩顛倒混勻；室溫放置10min后，12000r/min離心10min，棄上清液后，依次加入800μL體積分數(shù)為75%的乙醇和100μL體積分數(shù)為75%的乙醇洗滌沉淀；12000r/min離心5min，除乙醇溶液；待沉淀干燥后，DNA沉淀溶解于100μLTE緩沖液（預先加熱至65℃有利于溶解DNA）中，-20℃保存?zhèn)溆谩?DB22/T2049—2014取10μLDNA溶液加蒸餾水稀釋至1mL，使用核酸蛋白儀或紫外分光光度計分別檢測260nm和280nm處的吸光值。DNA的濃度按照式（1）計算，當A260/A280比值在1.5～2.1之間時，適宜于PCR擴增。擴增前將所有樣品DNA調(diào)至10ng/μL~50ng/μL。c=A′N′501000.............................................................................................(1)式中：c——DNA濃度，單位為納克每微升（ng/μL）；A——260nm處的吸光值；N——核酸稀釋倍數(shù)。7.4PCR檢測7.4.1PCR反應體系PCR反應體系見表1。每個樣品設置2個平行。表1PCR反應體系試劑加入量（μL）10×PCR緩沖液dNTP溶液(10mmol/L)TaqDNA聚合酶(5U/μL)上游引物(10μmol/L)下游引物(10μmol/L)DNA模板（10ng/μL~50ng/μL)補水至2.594℃預變性5min，94℃變性30s，58℃退火30s，72℃延伸30s，共35個循環(huán)，最后72℃延伸10min。4℃保存。不同儀器、不同TaqDNA聚合酶可根據(jù)要求將反應條件做適當調(diào)整。檢測過程中設置PCR擴增空白對照、陰性對照和陽性對照。用已知含有鴨源性成分的樣品DNA作陽性對照，用已知不含有鴨源性成分的樣品DNA作陰性對照，用等體積的滅菌去離子水代替模板DNA作空白對照。取2g瓊脂糖，于100mL電泳緩沖液中加熱，充分熔化，加入溴化乙錠貯存液至終濃度為0.5μg/mL，制膠。在電泳槽中加入電泳緩沖液，使液面剛剛沒過凝膠。將5μL～8μLPCR擴增產(chǎn)物分別和適量加樣緩沖液混合，點樣，用分子量標記作參照。9V/cm恒壓電泳，直至溴酚藍指示劑遷移至凝膠中部，電泳檢測結果用凝膠成像分析系統(tǒng)記錄并保存。4DB22/T2049—2014如果PCR擴增產(chǎn)物電泳檢測結果陽性，進行限制性內(nèi)切酶酶切反應或進行測序（序列參考附錄A）。酶切反應體系（20μL）：StuI酶2U，酶切緩沖液2μL，加入PCR擴增產(chǎn)物至總體積20μL。酶切在37℃下進行，20min。酶切完成后電泳，方法見7.4.3。8結果判斷與表述8.1PCR擴增產(chǎn)物電泳檢測結果陽性樣品的PCR擴增產(chǎn)物大小為201bp（序列參考附錄A）。8.2限制性內(nèi)切酶酶切結果陽性樣品PCR產(chǎn)物采用內(nèi)切酶StuI酶切后，酶切片段大小為118bp和83bp。8.3結果表述PCR產(chǎn)物為陽性，限制性內(nèi)切酶酶切產(chǎn)物片段大小正確，確認含有鴨源性成分，表述為檢出鴨源性成分；酶切產(chǎn)物片段大小不正確，確認不含有鴨源性成分，表述為未檢出鴨源性成分。PCR產(chǎn)物為陰性者判定不含有鴨源性成分，表述為未檢出鴨源性成分。9檢測過程中防止交叉污染的措施按照GB/T27403執(zhí)行。5DB22/T2049—2014附錄A（資料性附錄）PCR產(chǎn)