DB22-T2559-2016-牛新孢子蟲病檢測方法LAMP法-吉林省

ICS11.220DB22B41吉林省地方標準DB22/T2559—2016牛新孢子蟲病檢測方法LAMP法LAMPassayfordetectionofbovineNeosporaosis吉林省質量技術監(jiān)督局發(fā)布DB22/T2559—2016前言本標準按照GB/T1.1-2009和GB/T20001.4-2015給出的規(guī)則起草。本標準由吉林省畜牧業(yè)管理局提出并歸口。本標準起草單位：延邊大學、吉林省動物疫病預防控制中心。本標準主要起草人：賈立軍、柴方紅、張守發(fā)、梁晚楓。IDB22/T2559—2016牛新孢子蟲病檢測方法LAMP法1范圍本標準規(guī)定了牛新孢子蟲病LAMP檢測方法的技術要求。本標準適用于牛新孢子蟲病病原檢測。2規(guī)范性引用文件下列文件對于本文件的應用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，僅所注日期的版本適用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。GB/T6682分析實驗室用水規(guī)格和試驗方法3術語和定義下列術語和定義適用于本文件3.1由犬新孢子蟲(Neosporacaninum)引起的多種動物的一種原蟲病，該病主要引起母畜的流產、死胎或新生胎兒的運動障礙和神經系統(tǒng)疾病。環(huán)介導等溫擴增(LAMP)Loop-mediatedisothermalamplification針對靶基因的6個區(qū)域設計4種特異性引物，利用一種鏈置換DNA聚合酶在等溫條件下(63℃左右)保溫30min～60min，使得鏈置換DNA合成在不停地自我循環(huán)，即而完成的核酸擴增反應。除有特殊說明外，所有實驗用試劑均為分析純；實驗用水符合GB/T6682中一級水的要求。4.1.1100mg/mL溶菌酶見附錄A.1。4.1.210mg/mL蛋白酶K見附錄A.2。4.1.310%十二烷基磺酸鈉見附錄A.3。4.1.45%十六烷基三甲基溴化銨見附錄A.4。4.1.5TE（pH8.0）見附錄A.5。4.1.81.5%瓊脂糖凝膠的制備見附錄A.8。1DB22/T2559—2016BstDNAPolymerase、SYBRGreenⅠ、限制性內切酶TaqⅡ、組織DNA提取試劑盒、血液DNA提取試劑盒、溴化乙錠、DNAMarker分子量標準等。使用或稀釋時均參照試劑說明書進行。4.3引物表1LAMP特異性引物序列及濃度引物F3引物序列引物濃度0.2μmol/L0.2μmol/L1.6μmol/L1.6μmol/LATGCTTGTGTGGTGAGGCB3CAAGTGCCACCCACTGATCFIPBIPCGCTGACCGATCGGTTAACTGATTGCCAAACTCAGTGCGTTTAGCAGTTGGGGTGTCGGGTACCCTGTTTCGGGAGACA4.4標準陽性、陰性對照4.4.1標準陽性樣品為犬新孢子蟲基因組DNA提取物，DNA濃度為10mg～30mg。制備方法見附錄B。4.4.2標準陰性樣品健康牛組織DNA提取物，DNA濃度為10mg～30mg。5儀器設備5.1低溫高速離心機（12000g以上）。5.2恒溫水浴鍋（室溫～100℃）6試驗步驟無菌采集流產胎牛腦、肝、脾、肺等組織樣品，或牛的血液樣品，置滅菌1.5mL塑料離心管中，進行樣品處理；或冷凍保存，備用。2DB22/T2559—2016表2LAMP反應體系加樣物濃度體積2μLDNA模板10～30mg6.0mmol/L1.4mmol/L0.2μmol/L0.2μmol/L1.6μmol/L1.6μmol/L10×MgSO43μLdNTP3.5μL1μLF3B31μLFIPBIP1μL1μLBstDNAPolymeraseBufferBstDNAPolymeraseddH2O2.5μL1μL8U/μL9μL總體系25μL6.4結果判定6.4.1眼觀判定將樣品反應物加入1000×SYBRGreenI2μL，室溫放置10min，置于凝膠成像儀的紫外燈下觀察。陽性對照樣品應呈現(xiàn)綠色熒光，陰性對照與水對照樣品應呈現(xiàn)棕色、無熒光。在對照成立的前提下，樣品呈現(xiàn)綠色熒光判為陽性，呈現(xiàn)棕色、無熒光判為陰性。具體參考標準見附錄C.1。取樣品反應物2μL加入到1.5%瓊脂凝膠板的樣品孔中，并設置標準陽性、陰性和標準分子量DNAMarker。將凝膠在150V恒定電壓下電泳30min后，置于凝膠成像儀觀察。陽性樣品應呈現(xiàn)特征性梯狀條帶，陰性與水對照樣品無條帶。具體參考標準見附錄C.2。3DB22/T2559—2016AA附錄A（規(guī)范性附錄）環(huán)介導等溫擴增（LAMP）常用溶液配制A.1100mg/mL溶菌酶表A.1100mg/mL溶菌酶溶菌酶100mg滅菌雙蒸水定容至1mLA.210mg/mL蛋白酶K表A.210mg/mL蛋白酶K蛋白酶K10mg滅菌雙蒸水定容至1mL表A.310%十二烷基磺酸鈉（SDS）5%十六烷基三甲基溴化銨（CTAB）十六烷基三甲基溴化銨（CTAB）滅菌雙蒸水4DB22/T2559—2016A.6.10.5mol/L乙二銨四乙酸（EDTA）（pH8.0）表A.50.5mol/L乙二銨四乙酸（EDTA）（pH8.0）乙二銨四乙酸二鈉滅菌雙蒸水18.6g80mL注：用氫氧化鈉溶液調pH至8.0，滅菌雙蒸水定容至100mL。A.6.2TAE緩沖液（50×）配制表A.6TAE緩沖液（50×）配制三羥甲基氨基甲烷（Tris）冰乙酸24.2g5.71mL10mL0.5mol/L乙二銨四乙酸（EDTA）（pH8.0）注：加去離子水定容至100mL，室溫保存?zhèn)溆?，使用時稀釋50×為工作液。A.7加樣緩沖液表A.7加樣緩沖液A.81.5%瓊脂糖凝膠的制備表A.81.5%瓊脂糖凝膠的制備將三角瓶放在沸水浴或微波爐中加熱至瓊脂糖充分溶解（注意用微波爐加熱時不要沸出），置室溫冷卻到50℃左右，加入10mg/mL的溴化乙錠10μL，搖勻，倒入電泳板上，凝固后取下梳子，4℃?zhèn)溆谩?DB22/T2559—2016BB附錄B（規(guī)范性附錄）標準陽性對照模板DNA制備B.1取體外培養(yǎng)收集的犬新孢子蟲懸液150μL加入1.5mL離心管中，加入溶菌酶（100mg/mL）15μL，充分混勻，37℃下1h。B.2依次加入蛋白酶K(10mg/ml)9μL、10%SDS105μL、5mol/LNaCl150μL、5%CTAB240μL，充分混勻后，65℃下10min。B.3加入等體積Tris-飽和酚和氯仿反復抽提兩次，氯仿洗滌一次。B.4取上層于另一1.5mL離心管中，加入等體積無水乙醇和1/10體積醋酸鈉沉淀30min。B.54℃下12000r/min離心15min，棄上清。B.6將70%乙醇100μL沿管壁徐徐加入，4℃下12000r/min離心1min，吸棄上清，干燥。B.7用20μLTE溶解DNA，取一部分測定OD260