高考生物PCR的過程及應(yīng)用考點歸納總結(jié)

高考生物PCR的過程及應(yīng)用考點歸納總結(jié)

一、基礎(chǔ)考點

1.名稱：多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)

2.原理：DNA雙鏈復(fù)制（DNA的半保留復(fù)制）、DNA的熱變性原理

3.前提：要有一段已知目的基因的核甘酸序列

4.過程：PCR由變性一退火一延伸三個基本反應(yīng)步驟構(gòu)成:會解釋三個步驟

①變性：當(dāng)溫度上升到90℃以上時，雙鏈DNA解聚為單鏈

②復(fù)性：當(dāng)溫度下降到50c左右時，兩種引物通過堿基互補(bǔ)配對與兩條單鏈結(jié)合;

③延伸：當(dāng)溫度上升到72℃左右時，溶液中的4種脫氧核甘酸再耐高溫的DNA聚

合酶的作用下，根據(jù)堿基互補(bǔ)配原則合成新的DNA鏈

④重復(fù)：第一輪循環(huán)的產(chǎn)物作為第二輪的模板：重復(fù)循環(huán)變性一復(fù)性一延伸三過

程。

5.PCR反應(yīng)體系的成分及作用

DNA模板：從樣本或細(xì)胞中提取的微量總DNA

原料：dNTP（dATP、dGTP、dCTP、TTP）,提供原料和能量

酶：Taq聚合酶（熱穩(wěn)定DNA聚合酶，從嗜熱菌中分離得到）

引物：一小段能與DNA母鏈的一段堿基序列互補(bǔ)配對的短單鏈核酸

（注意：引物與目的DNA片段兩條母鏈各自的3,端序列互補(bǔ)）

Mg2+：維持酶活性所必需

PCR緩沖液:維持pH,保護(hù)Taq酶

6.DNA在體內(nèi)復(fù)制的條件

模板：DNA分子的每條鏈

酶：解旋酶、DNA聚合酶、DNA連接酶

原料、能量：dATP、dGTP、dCTP、dTTP

引物：RNA引物，溫和的反應(yīng)條件

7.總結(jié)：PCR與體內(nèi)DNA分子復(fù)制的不同點:

PCRDNA復(fù)制

復(fù)制起點無有

復(fù)制叉無有

場所及條件體外；體內(nèi)細(xì)胞核、線粒體、葉綠體；

控制3個不同溫度溫和條件

步驟變性、退火、延伸起始、延伸、終止

酶Taq酶解旋酶、DNA聚合酶、DNA連接醐

引物2種，一小段與DNA母鏈的多種RNA做引物：自行合成

一段堿基序列互補(bǔ)配對的

短單鏈DNA；人工合成

引物是否去除否是

變性的條件90℃以二的高溫解旋酶

結(jié)果短時間內(nèi)快速擴(kuò)增目的基復(fù)制完整的DNA分子

因片段

3#TTT]----------5，

特點......

3，LLLL1/^

5,______3y

半保留復(fù)制半保留復(fù)制

兩條鏈連續(xù)合成半不連續(xù)復(fù)制

8.PCR技術(shù)在基因工程中的應(yīng)用:

(1)特異性、快速擴(kuò)增目的基因獲取目的基因

(2)目的基因的檢測與鑒定

9.用PCR技術(shù)可以擴(kuò)增mRNA嗎？

不可以；在逆轉(zhuǎn)錄酶的作用下，需以mRNA為模板按照堿基互補(bǔ)配對的原則合成

cDNA再進(jìn)行擴(kuò)增

10.提取mRNA擴(kuò)增目的基因的過程：

RNA鏈DNA鏈

X/

①核酸酶H②—―

I----II--------------------

RNA單鏈雜交雙鏈單鏈DNA雙鏈DNA

⑤0c

95P

④

55~60°C

第一步：逆轉(zhuǎn)錄酶以RNA為模板合成一條與RNA互補(bǔ)的DNA鏈，形成RNA-DNA雜

交分子

第二步：核酸酶H降解RNA-DNA雜交分子中的RNA鏈，使之變成單鏈DNA；

第三步：以單鏈DNA為模板，在DNA聚合酶的作用下合成另一條互補(bǔ)的DNA鏈,

形成雙鏈DNA分子

第四步：以雙鏈DNA分子為模板，經(jīng)過③變性、④復(fù)性、⑤延伸，循環(huán)擴(kuò)增形成

目的基因產(chǎn)物

11.cDNA中缺少真核生物基因的哪些結(jié)構(gòu)：

啟動子、內(nèi)含子、終止子

12.目前在PCR反應(yīng)中使用Taq酶而不使用大腸桿菌DNA聚合酶的主要原因是：

Taq酶熱穩(wěn)定性高，而大腸桿菌DNA聚合酶在高溫下會失活

13.PCR產(chǎn)物的影響因素：模板DNA的量、脫氧核甘酸的量、引物的量、酶的數(shù)

量和活性、循環(huán)次數(shù)、Mg"的濃度

14.PCR后期，反應(yīng)速率下降的原因：酶的活性降低、引物和dNTP濃度降低、反

應(yīng)產(chǎn)物增多

15.變性溫度過低會導(dǎo)致雙鏈不能充分解開；

16：PCR擴(kuò)增中預(yù)變性的目的：

預(yù)變性破壞DNA中可能存在的較難破壞的二級結(jié)構(gòu)。使DNA充分變性解旋為單鏈,

有利于引物與模板的正確結(jié)合

17.PCR反應(yīng)體系實際操作時，加入的是4種脫氧核甘三磷酸(dATPdGTPdCTP

dTTP),每摻入一個核甘酸，伴隨著兩個特殊化學(xué)鍵(高能磷酸鍵)的斷裂，由此

釋放的能量滿足核甘酸聚合反應(yīng)的需求

18.內(nèi)參蛋白的作用：排出細(xì)胞取樣、實驗操作等對實驗結(jié)果的影響

(內(nèi)參蛋白是用來確保蛋白上樣量一致性，量化目的蛋白的表達(dá)情況，是對實驗

結(jié)果定量分析或定性比較的重要標(biāo)尺)

19.內(nèi)參蛋白的選擇：細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)定存在和高表達(dá)的蛋白質(zhì)

二、有關(guān)引物的考點總結(jié)：影響PCR的各種因素中，引物的設(shè)計最為重要

1.引物的作用：使DNA聚合酶能夠從引物的3,端開始延伸DNA鏈

2.需要引物的原因：DNA聚合酶不能從頭開始合成DNA,而只能從3'端延伸DNA

鏈，因此DNA的復(fù)制需要引物

3.設(shè)計兩種引物的原因：基因的兩條反向平行鏈都做模板，其堿基序列不同，且

DNA聚合酣只能從3'端延伸子鏈，用2種引物才能確保DNA兩條鏈同時被擴(kuò)增

4.需要大量引物的原因：子鏈?zhǔn)窃谝锏囊龑?dǎo)下合成的，引物隨子鏈D\A數(shù)量的

增多而被消耗

5.需要引物的數(shù)量：(2n-l)X2

若擴(kuò)增4次，共產(chǎn)生坨個DNA時，消耗阻個引物。

6.PCR擴(kuò)增的產(chǎn)物的特異性：由引物的特異性決定；引物是根據(jù)目的基因兩端的

核甘酸序列設(shè)計的

例：PCR技術(shù)擴(kuò)增干擾素基因時，設(shè)計引物序列的主要依據(jù)是有一段已知干擾素

基因的核省酸序列。

例：（2020山東高考）通過PCR技術(shù)可在總cDNA中專一性的擴(kuò)增出Wx基因的

cDNA,原因是o

答案：引物是根據(jù)Wx基因的一段已知序列設(shè)計合成的（或：引物能與Nx基因的

cDNA特異性結(jié)合）

7.兩引物間固定長度（等長）的DNA序列在PCR擴(kuò)增之次后首先出現(xiàn)

8.復(fù)制方向：是沿子鏈5'->3\從引物的3'端延伸子鏈

9.）如果需要在引物上加限制酶的識別序列：需要在引物的5'加

10.在引物的5'端設(shè)計兩種限時酣識別序列的原因：便于目的基因和載體的定向

正確連接

注：

（1）引物的5'端可以修飾，引物的5'端決定著PCR產(chǎn)物的長度，它對擴(kuò)增特

異性影響不大。因此，可以被修飾而不影響擴(kuò)增的特異性。引物5'端修飾包括:

加酶切位點，加標(biāo)記熒光，引入點突變、插入突變、缺失突變序列；引入啟動子

序列等。

（2）引物的3'端不可修飾；引物的延伸是從3'端開始的，不能進(jìn)行任何修飾。

1L設(shè)計引物時，引物自身不能有堿基互補(bǔ)配對的序列：避免引物自連，不能得到

目的產(chǎn)物

12.設(shè)計引物時，兩引物之間不能有堿基互補(bǔ)配對的序列：防止兩引物之間結(jié)合

形成雙鏈，降低引物與DNA模板鏈結(jié)合的效率

13.引物設(shè)計不能太短：防止非目的基因的獲得

例：為方便構(gòu)建重組質(zhì)粒，設(shè)計引物時需要增加適當(dāng)?shù)奈稽c。設(shè)計引物

時需要避免引物之間形成，而造成引物自連，

（答案：限制酶堿基互補(bǔ)配對）

例：為便于擴(kuò)增的DNA片段與表達(dá)載體連接，需在引物的端加上限制性

酶切位點，且常在兩條引物上設(shè)計加入不同的限制性酶切位點，主要目的是

(答案：5-使DNA片段能定向插入表達(dá)載體，減少自連)

14,復(fù)性的溫度取決于：引物的長度、堿基組成、濃度及靶基因序列的長度。如果

引物中GC含量較高，可適當(dāng)提高退火溫度

15.復(fù)性溫度過高，得不到產(chǎn)物的原因：引物不能穩(wěn)定的與模板結(jié)合

16.延伸溫度過高不利于引物與模板鏈的結(jié)合；

17.延伸的時間根據(jù)待擴(kuò)增片段長度而定，延伸時間過長會導(dǎo)致非特異性擴(kuò)增。

例：進(jìn)行擴(kuò)增時，反應(yīng)的溫度和時間需根據(jù)具體情況進(jìn)行設(shè)定，下列選項中—

的設(shè)定與引物有關(guān)，—的設(shè)定與擴(kuò)增片段的長度有關(guān)。

①變性溫度②退火溫度③延伸溫度

④變性時間⑤退火時間⑥延伸時間

答案：②⑥

18.退火溫度過高會導(dǎo)致引物不能充分與模板鏈結(jié)合，導(dǎo)致目標(biāo)產(chǎn)物的量減少

三、PCR技術(shù)與電泳技術(shù)結(jié)合的相關(guān)考點總結(jié)：選擇性必修三P84

L方法：瓊脂糖凝膠電泳一鑒定并分離DNA

2.原理：DNA具有可解離的基團(tuán)，在一定的PH下，這些基團(tuán)可以帶上正電荷或負(fù)

電荷。在電場的作用下，這些帶電分子會向著與它所帶電荷相反的電極移動

3,遷移速率的影響因素：凝膠的濃度、DNA分子的大小和構(gòu)象

(1)凝膠濃度：凝膠濃度的高低影響凝膠介質(zhì)孔隙的大小，濃度越高，孔隙越小，

DNA遷移受到的阻力越大，速率越慢，離點樣孔越近；根據(jù)分離DNA片段的大小，

用電泳緩沖液配置瓊脂糖溶液，濃度0.8%-1.2%(瓊脂糖溶液加熱融化、冷卻后

加核酸染料)。

(2)DNA分子的大?。篋NA的分子量越大，遷移速率越慢，離點樣孔越近

（3）DNA分子的構(gòu)象：

具有三種構(gòu)像的質(zhì)粒在瓊脂糖電泳的前后順序：環(huán)形超螺旋》線形）開環(huán)；

環(huán)形超螺旋（DNA兩條鏈都是完整的質(zhì)粒，就是超螺旋），結(jié)構(gòu)緊致，受到的阻力

小，遷移速率最快；完全斷裂的線性DNA,遷移速率次之；環(huán)形松弛（D\A雙鏈斷

了一條，質(zhì)粒DNA就失去超螺旋，成為松弛的環(huán)），遷移速率最慢

4.儀器：PCR儀、微量離心管、微量可調(diào)移液器、電泳裝置（電泳儀、水

平電泳槽等）

試劑：購買的PCR試劑盒、配方參考教材或試劑盒說明書

電泳試劑：電泳緩沖液、凝膠載樣緩沖液、瓊脂糖、核酸染料等

5.步驟及注意事項：

★步驟：

1.用微量移液器按照右欄中的配方活PCR試劑盒的說明書，在微量離心管中依次

加入各種組分。

PCR反應(yīng)體系的配方

10倍濃縮的擴(kuò)增緩沖液5nL

20mmoI/L的4種脫氧核甘酸的等量混合液1UL

20mmoI/L引物I2.5|1L

20mmoI/L引物112.5uL

H2028~33uL

/5U/piL的TaqDNA聚合酶廣2U

模板DNA5~10|iL

總體積50|iL

注：模板DNA的用量為1pg~1|ig

2.待所有組分都加入后，蓋嚴(yán)離心管的蓋子。將微量離心管放入離心機(jī)，離心約

10s,使反應(yīng)液幾種在管的底部

3.按照下表的參數(shù)，設(shè)置好PCR儀的循環(huán)程序。將裝有反應(yīng)液的微量離心管放入

PCR儀中進(jìn)行反應(yīng)。

循環(huán)程序變性復(fù)性延伸

預(yù)變性94℃,5min//

30次94℃,30s55℃,30s72℃,1min

最后1次94℃,1min55℃,30s72℃,1min

4.根據(jù)待分離的DNA片段的大小，用電泳緩沖液配置瓊脂糖溶液，一般配置質(zhì)量

體積比為0.8%-1.2%的瓊脂糖溶液。在沸水浴或微波爐內(nèi)加熱至瓊脂糖熔化。稍

冷卻后，力口入適量的核酸染料混勻O

5.將溫?zé)岬沫傊侨芤貉杆賹?dǎo)入模具，并插入合適大小的梳子，以形成加樣孔。

6.待凝膠溶液完全凝固，小心拔出梳子，取出凝膠放入電泳槽內(nèi)。

7.將電泳緩沖液加入電泳槽中，電泳緩沖液沒過凝膠1mm為宜。

8.將擴(kuò)增得到的PCR產(chǎn)物與凝膠載樣緩沖液（內(nèi)含指示劑）混合，再用微量移液

器將混合液緩慢注入凝膠的加樣孔內(nèi)。留一個加樣孔加入指示分子大小的標(biāo)準(zhǔn)參

照物。

9.接通電源，根據(jù)電泳槽陽極至陰極之間的距離來設(shè)定電壓，一般1?5V/cm。待

指示劑前沿遷移接近凝膠邊緣時，停止電泳。

10.觀察電泳鑒定結(jié)果：取出凝膠至于波長為300nm的紫外燈下觀察并照相。

★注意事項：

1.為避免外源DNA等因素的污染，PCR實驗使用的微量離心管、槍頭和蒸儲水等

在使用前必須進(jìn)行高壓滅菌處理。

2.該實驗所需材料可以直接從公司購買，緩沖液和酶應(yīng)分裝成小份，并在-20℃

儲存。使用前，將所需試劑從冰箱拿出，放在冰塊上緩慢融化。

3.在向微量離心管中添加反應(yīng)組分時，每吸取一種試劑后，移液器上的槍頭都必

須更換。

4.在進(jìn)行操作時，一定要戴好一次性手套。

★結(jié)果分析：

一次性成功的DNA片段擴(kuò)增應(yīng)該產(chǎn)生與預(yù)期大小一致的DNA片段。若出現(xiàn)與預(yù)期

不一致的結(jié)果，可嘗試從以下幾個方面進(jìn)行分析：模板DNA的制備、引物的質(zhì)量

與特異性、酶的質(zhì)量以及PCR循環(huán)的條件。

1.未出現(xiàn)擴(kuò)增條帶的原因：

(1)模板：模板DNA含有雜蛋白或Taq酶的抑制劑、模板DNA污染。

若反應(yīng)系統(tǒng)中污染了蛋白酶及核酸酶，應(yīng)在未加Taq酶以前.，將反應(yīng)體系95℃

加熱5~10分鐘。

(2)酶：Taq酶失活或在反應(yīng)體系中未加入酶。

(3)引物：引物特異性不強(qiáng)，濃度不合適。檢查引物特異性或重新設(shè)計引物；引

物濃度過高會引起錯配和非特異性擴(kuò)增，且可增加引物之間形成二聚體的機(jī)會。

(4)變性溫度是否準(zhǔn)確：過高酶在前幾個循環(huán)就迅速失活；變性溫度低，變性時

間短則模板變性不徹底。

(5)Mg2+濃度過低,擴(kuò)增的產(chǎn)物過少；

(6)4種dNTP濃度過低,擴(kuò)增的產(chǎn)物過少；

(7)目的序列變異

2.擴(kuò)增產(chǎn)物出現(xiàn)多條帶(雜帶)的原因：

(1)模板：模板DNA污染。確保操作的潔凈。

(2)酶：酶的用量偏高或酶的質(zhì)量不好，應(yīng)降低酶量或調(diào)換另一來源的酶。

(3)引物：引物用量偏大，引物的特異性不高，或形成引物二聚體，特別是引物

的3,短互補(bǔ)，易形成引物二聚體，產(chǎn)生非特異性擴(kuò)增條帶；

(4)復(fù)性溫度偏低，復(fù)性及延伸時間偏長：應(yīng)提高復(fù)性溫度，減少變性與延伸時

間

（5）Mg2+濃度過高，反應(yīng)特異性降低，會引發(fā)非特異性擴(kuò)增

（6）4種dNTP濃度不相等：任意一種濃度過高或過低，都會引發(fā)錯配，擴(kuò)增的

產(chǎn)物過少；

（7）循環(huán)次數(shù)過多

（8）延伸時間過長會導(dǎo)致非特異性擴(kuò)增

★對照的作用：

陽性對照：用于檢測PCR體系是否正確及擴(kuò)增效率，確保不是DNA凝膠和PCR

程序的問題

陰性對照：用于檢測是否存在含有目的序列的DNA污染

陰性對照出現(xiàn)條帶：試劑，槍頭，工作臺污染。

四、DNA片段的擴(kuò)增及電泳鑒定實驗的問題串

1.PCR擴(kuò)增的原理：

2.DNA分子帶電的原因：

3.DNA在電場中的移動方