土壤和沉積物  3種氯霉素類抗生素的測定 液相色譜-三重四級(jí)桿質(zhì)譜法

T/CQEEMA11-2025I，于-18℃以下冷凍、密封、避光，保存期為90d。5.14內(nèi)標(biāo)貯備液：ρ=100mg/L。內(nèi)標(biāo)物為氯霉素-d5，亦可選用其他性質(zhì)相近的同位素物質(zhì)作內(nèi)標(biāo)?？芍苯淤徺I市售有證標(biāo)準(zhǔn)溶液，溶劑為甲醇，貯備液參照產(chǎn)品說明書保存。5.15內(nèi)標(biāo)使用液：ρ=1.00mg/L。移取適量內(nèi)標(biāo)貯備液（5.14），用甲醇稀釋，于-18℃以下冷凍、密封、避光，保存期為90d。5.16硅藻土：粒徑250μm~850μm。（20目~60目）馬弗爐中450℃灼燒4h，稍冷卻后置于潔凈干燥器中備用。5.17石英砂：粒徑150μm～250μm（100目～60目）馬弗爐中450℃灼燒4h，稍冷卻后置于潔凈干燥器中備用。5.18固相萃取柱：填料為二乙烯苯和N-乙烯基吡咯烷酮共聚物，規(guī)格為500mg/6mL，或其他等效固相萃取柱。5.19針頭式過濾器：孔徑為0.22μm，聚四氟乙烯、聚醚砜或其他等效材質(zhì)濾膜。5.20氮?dú)猓杭兌取?9.99%。5.21氬氣：純度≥99.999%。6儀器和設(shè)備6.1采樣瓶：棕色，具有聚四氟乙烯襯墊磨口玻璃瓶。6.2液相色譜-三重四極桿質(zhì)譜儀：配有電噴霧離子源（ESI），具備流動(dòng)相梯度洗脫和質(zhì)譜多反應(yīng)監(jiān)測功能。6.3色譜柱：填料粒徑為1.7μm，柱長為100mm，內(nèi)徑為2.1mm的C18液相色譜柱，或其他等效色譜柱6.4萃取池：34mL或其他規(guī)格。6.5冷凍干燥儀。6.6提取裝置：加壓流體萃取儀等性能相當(dāng)?shù)脑O(shè)備。6.7濃縮裝置：旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀、氮吹儀或其他同等性能的設(shè)備。6.8固相萃取裝置：自動(dòng)或手動(dòng)，流速可調(diào)節(jié)。6.9進(jìn)樣瓶：棕色玻璃瓶，2mL。6.10樣品篩：不銹鋼材質(zhì)，孔徑為250μm（60目）。6.11一般實(shí)驗(yàn)室常用儀器和設(shè)備。7樣品7.1樣品采集和保存分別按照HJ/T166、HJ/T91、HJ442.4、GB17378.3的相關(guān)要求采集和保存土壤和沉積物樣品。樣品應(yīng)置于潔凈的采樣瓶（6.1）中，4℃以下避光、冷藏保存，7d內(nèi)完成提取。7.2樣品的制備除去樣品中的異物（枝棒、葉片、石子等），自然陰干或冷凍干燥后，研磨、均質(zhì)、過樣品篩（6.10）。7.3水分的測定土壤樣品干物質(zhì)含量測定按照HJ613執(zhí)行，沉積物樣品含水率測定按照GB17378.5執(zhí)行。7.4.1提取稱取1g試樣（可根據(jù)試樣中待測化合物濃度適當(dāng)增加或減少取樣量），加入10μl替代物（5.13）混勻后，置于萃取池（6.4）中，將萃取池（6.4）置于提取裝置（6.6）中，以甲醇-檸檬酸鹽緩沖溶液（5.8）為提取溶劑，按以下參考條件進(jìn)行提?。禾崛囟葹?0℃，提取壓力為10.34KPa，靜態(tài)提取時(shí)間為15min，淋洗體積為60%池體積，氮?dú)猓?.20）吹掃時(shí)間為120s，循環(huán)次數(shù)為2次，收集提取液，并用實(shí)驗(yàn)室水稀釋至500mL，待凈化。7.4.2凈化將固相萃取柱（5.18）固定在固相萃取裝置（6.8）上，依次用10mL甲醇（5.1）、10mL水活化固相萃取柱（5.18）。將提取液（7.4.1）以8ml/min～10ml/min的流速通過固相萃取柱后，用10mL水淋洗固相萃取柱（5.18），然后用真空泵抽氣干燥小柱或用氮?dú)猓?.20）吹干小柱。再用10mL甲醇（5.1）以1ml/min～3ml/min的流速洗脫固相萃取柱，收集洗脫液。7.4.3濃縮定容用濃縮裝置（6.7）將洗脫液（7.4.2）濃縮至近干，用甲醇（5.1）定容至1.0mL，加入10.0μl內(nèi)標(biāo)使用液（5.15），混勻后經(jīng)針頭式過濾器（5.19）過濾至進(jìn)樣瓶（6.9）中，密封、避光，-18℃以下冷凍保存，15d內(nèi)完成分析。用石英砂（5.17）代替樣品，按照與試樣制備（7.4）相同步驟制備空白試樣。8分析步驟8.1儀器參考條件8.1.1液相色譜參考條件流動(dòng)相A：乙酸銨溶液（5.9）；流動(dòng)相B：甲醇（5.1）；參考梯度洗脫程序見表1；流速為0.3mL/min；進(jìn)樣體積：2μl；柱溫：40oC。表1梯度洗脫程序090101.0090103.0020805.0020805.1090106.0090108.1.2質(zhì)譜參考條件離子源：電噴霧離子源（ESI），負(fù)離子模式；監(jiān)測方式：多反應(yīng)監(jiān)測（MRM）；離子化電壓：-4500V；離子源溫度：400℃；霧化氣壓力：50psi；輔助加熱氣壓力：50psi；氣簾氣壓力：35psi；多反應(yīng)監(jiān)測條件參見表2。序號(hào)化合物名稱母離子（m/z）子離子（m/z）錐孔電壓（eV）碰撞能量（eV）定量內(nèi)標(biāo)1氯霉素321152.0*-60-24氯霉素-d5257.2-172氟苯尼考356185.0-60-26氯霉素-d5336.2*-123甲砜霉素354185.0*-50-29氯霉素-d5290.1-184甲砜霉素-d3357188.0-40-27氯霉素-d5293.1*-175氯霉素-d5326157.1*-60-24-262.0-17*為定量離子表2質(zhì)譜多反應(yīng)監(jiān)測條件8.1.3質(zhì)譜儀調(diào)諧按照儀器使用說明書調(diào)諧儀器并確認(rèn)儀器性能，儀器性能正常后測定樣品。8.2校準(zhǔn)8.2.1標(biāo)準(zhǔn)系列的配制分別移取適量的氯霉素類抗生素標(biāo)準(zhǔn)使用液（5.11）、替代物使用液（5.13），于進(jìn)樣瓶（6.9）中，用甲醇（5.1）配制不少于5個(gè)濃度點(diǎn)的標(biāo)準(zhǔn)系列，目標(biāo)化合物和替代物的質(zhì)量濃度分別為1.0μg/L、2.0μg/L、5.0μg/L、10.0μg/L、20.0μg/L、50.0μg/L、和100μg/L（此為參考濃度）。1mL標(biāo)準(zhǔn)系列中加入10μL內(nèi)標(biāo)使用液（5.15），混勻，待測。8.2.2標(biāo)準(zhǔn)系列的測定照儀器參考條件（8.1），由低濃度到高濃度依次對(duì)標(biāo)準(zhǔn)系列溶液進(jìn)行測定。記錄各目標(biāo)化合物、提取內(nèi)標(biāo)、進(jìn)樣內(nèi)標(biāo)的保留時(shí)間和定量離子峰面積。各總離子色譜圖見圖1。5431、25431、21——甲砜霉素；2——甲砜霉素-d3(替代物）；3——氟苯尼考；4——氯霉素；5——氯霉素-d5(內(nèi)標(biāo)）。圖1各目標(biāo)化合物、替代物及內(nèi)標(biāo)物的總離子流圖8.2.3用最小二乘法繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線以標(biāo)準(zhǔn)系列溶液中目標(biāo)化合物物的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，以其對(duì)應(yīng)峰面積與內(nèi)標(biāo)物峰面積的比值和內(nèi)標(biāo)物濃度的乘積為縱坐標(biāo)，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線。8.2.4平均相對(duì)響應(yīng)因子計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)系列中第j點(diǎn)目標(biāo)化合物i的相對(duì)響應(yīng)因子（），按照公式（1）計(jì)算。QUOTEKsam=Asam2Asam1×100%QUOTEKsam=A式中：——標(biāo)準(zhǔn)系列中第j點(diǎn)目標(biāo)化合物i的相對(duì)響應(yīng)因子；——標(biāo)準(zhǔn)系列中第j點(diǎn)目標(biāo)化合物i定量離子的峰面積；——標(biāo)準(zhǔn)系列中第j點(diǎn)目標(biāo)化合物i相對(duì)應(yīng)的內(nèi)標(biāo)物定量離子的峰面積；——標(biāo)準(zhǔn)系列中第j點(diǎn)目標(biāo)化合物i對(duì)應(yīng)內(nèi)標(biāo)物的質(zhì)量濃度，μg/L；——標(biāo)準(zhǔn)系列中第j點(diǎn)目標(biāo)化合物i的質(zhì)量濃度，μg/L。標(biāo)準(zhǔn)系列中目標(biāo)化合物i的平均相對(duì)響應(yīng)因子（），按照公式（2）計(jì)算。QUOTEKsam=Asam2Asam1×100%QUOTEKsam=式中：——標(biāo)準(zhǔn)系列中目標(biāo)化合物i的平均相對(duì)響應(yīng)因子；——標(biāo)準(zhǔn)系列中第j點(diǎn)目標(biāo)化合物i的相對(duì)響應(yīng)因子；——標(biāo)準(zhǔn)系列點(diǎn)數(shù)。8.3試樣測定按照與標(biāo)準(zhǔn)系列的配制與測定（8.2.1）相同的儀器條件進(jìn)行試樣（7.4）測定。8.4空白試驗(yàn)按照與試樣測定（8.3）相同的儀器條件進(jìn)行空白試樣（7.5）的測定。9結(jié)果計(jì)算與表示9結(jié)果計(jì)算與表示9.1定性分析根據(jù)保留時(shí)間與離子對(duì)豐度比例定性分析。在相同的實(shí)驗(yàn)條件下，試樣中目標(biāo)化合物的保留時(shí)間與標(biāo)準(zhǔn)溶液中該目標(biāo)化合物的保留時(shí)間比較，相差±0.2min以內(nèi)；樣品中各目標(biāo)化合物定性離子的相對(duì)豐度（）與濃度接近的標(biāo)準(zhǔn)溶液中對(duì)應(yīng)的定性離子相對(duì)豐度（）進(jìn)行比較，所得偏差在表3規(guī)定的最大允許偏差范圍內(nèi)，則可判定樣品中存在該目標(biāo)化合物。和分別按照公式（3）和公式（4）計(jì)算。（3）QUOTE????????=??2/??1×100%式中：——試樣中目標(biāo)化合物i定性離子的相對(duì)豐度，%；——試樣中目標(biāo)化合物i定性離子的響應(yīng)值；——試樣中目標(biāo)化合物i定量離子的響應(yīng)值。QUOTEKsam=Asam2Asam1×100%QUOTEKsam=A式中：——標(biāo)準(zhǔn)溶液中目標(biāo)化合物i定性離子的相對(duì)豐度，%；——標(biāo)準(zhǔn)溶液中目標(biāo)化合物i定性離子的響應(yīng)值；——標(biāo)準(zhǔn)溶液中目標(biāo)化合物i定量離子的響應(yīng)值。表3相對(duì)離子豐度的最大允許偏差（%）最大允許偏差（%）＞50±2020＜≤50±2510＜≤20±30≤10±509.2定量分析9.2.1平均相對(duì)響應(yīng)因子法土壤樣品中目標(biāo)化合物i的質(zhì)量濃度按照公式（5）計(jì)算：QUOTEρx=Ax×ρISAIS×??????×1fQUOTEρx=Ax×ρISAIS×RRF×1f式中：——樣品中目標(biāo)化合物i的含量，μg/kg；——樣品中目標(biāo)化合物i定量離子的峰面積；——內(nèi)標(biāo)物的質(zhì)量濃度，μg/L；——試樣定容的體積，ml；——試樣稱樣量，g；——試樣干物質(zhì)含量，%；——內(nèi)標(biāo)物定量離子的峰面積；——目標(biāo)化合物i的平均相對(duì)響應(yīng)因子；——稀釋倍數(shù)。沉積物樣品中目標(biāo)化合物i的質(zhì)量濃度按照公式（6）計(jì)算：QUOTEρx=Ax×ρISAIS×??????×1fQUOTEρx=Ax×ρISAIS×RRF×1f式中：——樣品中目標(biāo)化合物i的含量，μg/kg；——樣品中目標(biāo)化合物i定量離子的峰面積；——內(nèi)標(biāo)物的質(zhì)量濃度，μg/L；——試樣定容的體積，ml；——試樣稱樣量，g；——試樣含水率，%；——內(nèi)標(biāo)物定量離子的峰面積；——目標(biāo)化合物i的平均相對(duì)響應(yīng)因子；——稀釋倍數(shù)。9.2.2最小二乘法土壤樣品中目標(biāo)化合物i的質(zhì)量濃度按照公式（7）計(jì)算：QUOTEQUOTE（7）式中：——樣品中目標(biāo)化合物i的含量，μg/kg；——試樣中目標(biāo)化合物i的質(zhì)量濃度，μg/L；——試樣定容的體積，ml；——試樣稱樣量，g；——試樣干物質(zhì)含量，%；——稀釋倍數(shù)。沉積物樣品中的目標(biāo)化合物含量i的質(zhì)量濃度按照公式（8）進(jìn)行計(jì)算：QUOTEQUOTE（8）式中：——樣品中目標(biāo)化合物i的含量，μg/kg；——試樣中目標(biāo)化合物i的質(zhì)量濃度，μg/L；——試樣定容的體積，ml；——試樣稱樣量，g；——試樣含水率，%；——稀釋倍數(shù)。9.3結(jié)果表示測定結(jié)果小數(shù)點(diǎn)后位數(shù)的保留與方法檢出限一致，最多保留3位有效數(shù)字。10準(zhǔn)確度10.1精密度6家實(shí)驗(yàn)室，分別對(duì)2μg/kg、10μg/kg和90μg/kg的空白加標(biāo)樣品進(jìn)行了6次重復(fù)測定，實(shí)驗(yàn)室內(nèi)相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為6.3%~15%、3.2%~11%和1.3%~11%；實(shí)驗(yàn)室間相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為14%~33%、6.7%~17%和6.3%~10%；重復(fù)性限分別為：0.27μg/kg~0.34μg/kg、1.2μg/kg~1.6μg/kg和7.8μg/kg~9.0μg/kg；再現(xiàn)性限分別為：0.49μg/kg~1.1μg/kg、1.9μg/kg~3.8μg/kg和14μg/kg~21μg/kg。6家實(shí)驗(yàn)室，分別對(duì)2μg/kg、10μg/kg和90μg/kg的土壤樣品進(jìn)行了6次重復(fù)測定，實(shí)驗(yàn)室內(nèi)相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為2.8%~20%、3.1%~19%和2.5%~9.9%；實(shí)驗(yàn)室間相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為13%~21%、8.6%~17%和6.4%~13%；重復(fù)性限分別為：0.26μg/kg~0.35μg/kg、1.7μg/kg~2.4μg/kg和9.8μg/kg~13μg/kg；再現(xiàn)性限分別為：0.49μg/kg~0.85μg/kg、2.4μg/kg~3.8μg/kg和16μg/kg~26μg/kg。6家實(shí)驗(yàn)室，分別對(duì)2μg/kg、10μg/kg和90μg/kg的沉積物加標(biāo)樣品進(jìn)行了6次重復(fù)測定，實(shí)驗(yàn)室內(nèi)相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為3.0%~19%、2.3%~15%和2.0%~13%；實(shí)驗(yàn)室間相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為14%~28%、10%~23%和7.0%~12%；重復(fù)性限分別為：0.29μg/kg~0.37μg/kg、1.7μg/kg~2.2μg/kg和8.9μg/kg~9.93μg/kg；再現(xiàn)性限分別為：0.50μg/kg~0.98μg/kg、3.0μg/kg~5.1μg/kg和14μg/kg~21μg/kg。精密度結(jié)果統(tǒng)計(jì)參見附錄C中表C.1。10.2正確度6家實(shí)驗(yàn)室，分別對(duì)2μg/kg、10μg/kg和90μg/kg的空白加標(biāo)樣品進(jìn)行了6次重復(fù)測定，加標(biāo)回收率分別為41.6%~98.6%、45.9%~108%和54.5%~87.4%；加標(biāo)回收率最終值分別為54.3%±15%~60.8%±40%、66.6%±22%~83.3%±24%和66.1%±13%~77.6%±16%。6家實(shí)驗(yàn)室，分別對(duì)2μg/kg、10μg/kg和90μg/kg的土壤樣品進(jìn)行了6次重復(fù)測定，加標(biāo)回收率分別為43.3%~97.7%、42.1%~92.4%和54.1%~89.1%；加標(biāo)回收率最終值分別為55.4%±14%~69.1%±30%、63.1%±22%~76.1%±18%和65.8%±17%~79.4%±18%。6家實(shí)驗(yàn)室，分別對(duì)2μg/kg、10μg/kg和90μg/kg的沉積物加標(biāo)樣品進(jìn)行了6次重復(fù)測定，加標(biāo)回收率分別為41.9%~95.3%、42.6%~112%和47.9%~76.6%；加標(biāo)回收率最終值分別為52.0%±14%~60.9%±34%、74.1%±34%~90.7%±28%和58.6%±14%~67.0%±15%。正確度統(tǒng)計(jì)結(jié)果參見附錄C中表C.2。11質(zhì)量保證和質(zhì)量控制11.1空白試驗(yàn)每20個(gè)樣品或每批次（≤20個(gè)樣品/批）應(yīng)至少分析1個(gè)空白樣品，測定結(jié)果應(yīng)低于方法檢出限。11.2校準(zhǔn)采用平均相對(duì)響應(yīng)因子法時(shí)，相對(duì)響應(yīng)因子的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差應(yīng)≤20%。采用最小二乘法時(shí)，標(biāo)準(zhǔn)曲線線性相關(guān)系數(shù)應(yīng)≥0.995。否則應(yīng)查找原因，重新繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。每20個(gè)或每批次樣品（少于20個(gè)）至少分析1個(gè)曲線中間濃度點(diǎn)標(biāo)準(zhǔn)溶液，測定結(jié)果與該點(diǎn)濃度的相對(duì)誤差應(yīng)在±20%以內(nèi)，否則應(yīng)重新建立標(biāo)準(zhǔn)曲線。11.3平行樣每20個(gè)樣品或每批次（≤20個(gè)樣品/批）應(yīng)至少分析1個(gè)平行樣，平行樣品測定結(jié)果的相對(duì)偏差應(yīng)在±40%以內(nèi)。11.4基體加標(biāo)每20個(gè)樣品或每批次（≤20個(gè)樣品/批）應(yīng)至少分析1個(gè)基體加標(biāo)樣品，加標(biāo)回收率范圍應(yīng)在40%～150%。11.5替代物的回收率每個(gè)樣品均需加入替代物，替代物回收率應(yīng)在40%～150%之間。附錄A（規(guī)范性附錄）方法檢出限和測定下限各目標(biāo)化合物的方法檢出限和測定下限見表A.1。表A.1方法檢出限和測定下限序號(hào)化合物中文名稱目標(biāo)化合物英文名稱CASNo.方法檢出限/（μg/kg）測定下限/（μg/kg）1氯霉素chloramphenicol56-75-70.62.42氟苯尼考Florfenicol73231-34-20.41.63甲砜霉素Thiamphenicol52628-58-70.41.6附錄B（資料性附錄）質(zhì)譜參考條件離子化電壓：-4500V。離子源溫度：400℃。霧化氣壓力：3.45×105Pa（50psi）。輔助加熱氣壓力：3.45×105Pa（50psi）。氣簾氣壓力：2.41×105Pa（35psi）。各目標(biāo)化合物、替代物及內(nèi)標(biāo)物的多反應(yīng)監(jiān)測條件見表B.1。表B.1目標(biāo)化合物、替代物及內(nèi)標(biāo)物的多反應(yīng)監(jiān)測條件序號(hào)化合物名稱母離子（m/z）子離子（m/z）錐孔電壓（eV）碰撞能量（eV）定量內(nèi)標(biāo)1氯霉素321152.0*-60-24氯霉素-d5257.2-172氟苯尼考356185.0-60-26氯霉素-d5336.2*-123甲砜霉素354185.0*-50-29氯霉素-d5290.1-184甲砜霉素-d3357188.0-40-27氯霉素-d5293.1*-175氯霉素-d5326157.1*-60-24-262.0-17*為定量離子附錄C（資料性附錄）方法的準(zhǔn)確度方法的精密度數(shù)據(jù)見表C.1，正確度數(shù)據(jù)見表C.2。表C.1方法精密度化合物樣品類型加標(biāo)濃度（μg/kg）實(shí)驗(yàn)室內(nèi)相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（%）實(shí)驗(yàn)室間相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（%）重復(fù)性限（μg/kg）再現(xiàn)性限（μg/kg）氯霉素石英砂2.006.3~15140.30.550.03.6-106.71.41.990.01.3-6.56.38.114土壤2.004.3-14130.30.550.05.6-118.61.72.390.04.0-8.76.41116沉積物2.007.5-14190.40.650.04.1-9.0101.83.090.03.4-6.87.18.914氟苯尼考石英砂2.006.9-12330.31.150.03.2-9.1151.63.890.01.6-6.2107.821土壤2.002.8-12210.30.850.05.1-19122.23.390.02.5-8.7121226沉積物2.003.0-17280.40.650.02.3-14162.24.590.02.0-12111021甲砜霉素石英砂2.006.9-11140.270.4950.03.9-10171.23.390.02.7-119.59.018土壤2.003.7-20170.40.650.03.1-19172.43.890.02.7-9.9139.823沉積物2.004.5-19180.30.550.05.1-13231.65.190.03.9-1312