《膠體金檢測技術(shù)》PPT課件.ppt

免疫膠體金快速檢測技術(shù) 農(nóng)業(yè)農(nóng)業(yè)部飼飼料質(zhì)質(zhì)量監(jiān)監(jiān)督檢驗測試檢驗測試中心（西安） 培訓(xùn)資料 主要內(nèi)容 一、免疫膠體金技術(shù)的發(fā)展歷史 二、膠體金檢測卡的基本原理及構(gòu)造 三、免疫膠體金層析法檢測原理及應(yīng)用 四、-激動劑檢測卡快速篩查尿樣的方法介紹 五、常見問題分析與注意事項 六、免疫膠體金技術(shù)的發(fā)展的方向 培訓(xùn)資料 一、免疫膠體金技術(shù)的發(fā)展史 1.1939年（英，植物）Kausche和Ruska把煙草葉病毒吸 附在金顆粒上，在電子顯微鏡下觀察呈現(xiàn)高電子密度的細(xì)狀 顆粒，開啟了免疫膠體金技術(shù)的研究。 2.1971年（美，微生物）Faulk和Taylor首先將兔抗沙門菌 抗血清與膠體金顆粒結(jié)合，用直于檢測沙門菌的表面抗原。 3.1974年（奧）Romano等將膠體金標(biāo)記在馬抗人IgG上， 實現(xiàn)了間接免疫金染色法。同年Bauer等報道將膠體金標(biāo)記 在凝集素上的應(yīng)用。 培訓(xùn)資料 4.1978年Geoghegan等應(yīng)用免疫金技術(shù)檢測B淋巴 細(xì)胞表面抗原。 5.1981年Danscher建立了銀顯影液增強光鏡下金顆 粒的免疫金銀染色方法 （Immunogold-silver staining,IGSS）。 6.1986年Fritz（美，生物）等人在IGSS法基礎(chǔ)上成 功地進行了彩色I(xiàn)GSS的染色法,使得檢測結(jié)果更加鮮 艷奪目這是免疫金檢測技術(shù)誕生的一次歷程碑！ 培訓(xùn)資料 二、 膠體金的概念、原理及結(jié)構(gòu) 1.膠體金概念及來源： 膠體金又稱金溶膠，是由金 鹽還原成金后形成的金顆粒懸濁液。 2.膠體金顆粒結(jié)構(gòu)：由一個基礎(chǔ)金核即金原子與包圍 在外的離子層構(gòu)成，離子層為氯金酸負(fù)離子（AuCl2-)， 外層為H+，分散在溶液中。呈球形(小顆粒)或橢圓形( 大顆粒)。 培訓(xùn)資料 圖1 金顆粒示意圖 在溶液中金顆粒呈 圓形,表面帶有負(fù)電 荷,由于靜電的排斥 力,使其在水中保穩(wěn) 定狀態(tài)，形成穩(wěn)定 的膠體狀態(tài)。 培訓(xùn)資料 3. 膠體金試紙條的構(gòu)造 樣品墊 PVC底板 層析方向 膠體金墊 測試線 （T線） 控制線（C線） NC膜（硝酸纖維素膜） 吸水濾紙 培訓(xùn)資料 4.免疫層析法檢測原理（雙抗體夾心) 4.1（以HCG檢測為例） 培訓(xùn)資料 4.2 免疫層析法檢測原理（競爭抑制反應(yīng)） （以嗎啡檢測為例） 培訓(xùn)資料 4.3 免疫層析法檢測的原理（應(yīng)用proteinA金標(biāo)） （以HIV檢測為例） 陰性 陽性 培訓(xùn)資料 克倫特羅、萊克多巴胺、沙丁胺醇膠體金試紙條是膠體金層析 法的應(yīng)用 采用競爭抑制法，將氯金酸用還原法制成一定直徑的金溶膠 顆粒，標(biāo)記為抗體。以硝酸纖維素膜為載體，樣本中的鹽酸克倫 特羅在流動的過程中與膠體金標(biāo)記的特異性單克隆抗體結(jié)合，抑 制了抗體和硝酸纖維素（NC）膜檢測線上鹽酸克倫特羅BSA 偶聯(lián)物（與鹽酸克倫特羅的化學(xué)結(jié)構(gòu)相似）的結(jié)合，使檢測線不 顯顏色，結(jié)果為陽性。反之，檢測線顯紅色，結(jié)果為陰性。 規(guī)定尿液中鹽酸克倫特羅的膠體金免疫層析測定方法。適用于 豬、牛尿液中鹽酸克倫特羅的篩選，最低檢測濃度為3ng/ml。 培訓(xùn)資料 -結(jié)果判定依據(jù) 陰性對照出現(xiàn)紅色條帶，陽性對照不出現(xiàn)紅色條帶，說 明檢測卡有效。 如陰性對照不出現(xiàn)紅色條帶，或陽性對照出現(xiàn)紅色條帶， 出現(xiàn)任何一種現(xiàn)象或兩種同時出現(xiàn)，說明檢測卡失效。 待檢尿樣檢測區(qū)出現(xiàn)紅色條帶為陰性 待檢尿樣檢測區(qū)不出現(xiàn)紅色條帶為陽性 陽性結(jié)果 樣品中可能含有等于或高于3ng/ml的鹽酸克倫特羅。 培訓(xùn)資料 四、-激動劑檢測卡快速篩查尿樣的方法介紹 以鹽酸克倫特羅膠體金快速檢測卡為例 一適用范圍： 主要用于定性檢測，測定動物尿液，如豬尿、牛尿、羊 尿等樣品中鹽酸克倫特羅的殘留。整個檢測過程只需要 510分鐘左右，靈敏度為3 ng/ml(3ppb)。也就是說當(dāng) 尿液中鹽酸克倫特羅的殘留大于或等于3 ng/ml時，檢測 卡才能檢測到。 培訓(xùn)資料 二 、包裝 每個包裝袋中包含鹽酸克倫特羅免疫膠體金快速檢測卡 ，滴管1個、干燥劑1片。 三、現(xiàn)場篩查步驟 1在進行測試前先完整閱讀使用說明書，使用前將檢測卡 和待檢樣本溶液恢復(fù)至室溫。 2從原包裝袋中取出檢測卡，打開后請在一個小時內(nèi)就地 使用。 培訓(xùn)資料 3將檢測卡平放，用移液器或滴管吸取尿液樣品溶液，垂 直滴加3滴（約80ul）于加樣孔中，加樣后開始計時。 培訓(xùn)資料 4結(jié)果應(yīng)在510分鐘讀取，其他時間判讀無效，根據(jù)示意 圖判定結(jié)果。 培訓(xùn)資料 A、陰性（-）：C、T線均出現(xiàn)。表示樣品中不含有克倫 特羅或其深度低于檢測限。 培訓(xùn)資料 B、陽性（+）：檢測T線不出現(xiàn)，則表示樣品中克倫特羅濃 度高于檢測限。 培訓(xùn)資料 C、無效：未出現(xiàn)質(zhì)控C線，表明操作過程不正確或檢測卡已 失效，重新使用新卡。 培訓(xùn)資料 經(jīng)試劑卡檢測的陽性樣品在未進行確正之前，被稱為疑似 樣品，必須進行確證后，才能準(zhǔn)確判斷，不能提前作結(jié)論。 因此，對于出現(xiàn)陽性結(jié)果的樣品，應(yīng)按官方抽樣程序分瓶 封裝樣品，并于0 -4保存，盡快送到我中心進行確證檢測 。 培訓(xùn)資料 五、常見問題及注意事項 1.使用前將檢測卡和待檢樣本恢復(fù)至室溫 2.保持干燥，避免受潮，打開包裝請盡快使用 試紙條中的NC膜受潮后，尿樣在上面無法正常泳動，無 法到達(dá)吸水紙的位置；膠金墊上的金標(biāo)抗體受潮后會變性， 從而失去原有的生理性功能，影響抗原抗體的選擇性反應(yīng)。 因此，試紙條必須保持干燥，從包裝袋中取出后要盡快使用 。 3.檢測時，避免陽光直射和電風(fēng)扇、空調(diào)的風(fēng)直吹 尿樣一開始在NC膜上泳動時，是利用毛細(xì)管作用，如果 風(fēng)吹太陽曬，NC膜上的尿樣蒸發(fā)后難以到達(dá)吸水紙的位置 ，會產(chǎn)生假陽性結(jié)果，因此，檢測時要避免陽光直射和電風(fēng) 扇、空調(diào)的風(fēng)直吹。 培訓(xùn)資料 4.盡量不要觸摸檢測卡中央的白色膜面 這主要是人手掌的汗 液中有鉀、鈉離子存在，影響NC膜上泳動時的毛細(xì)管作用。 5.尿樣滴管不可混用，以免交叉污染 每一類檢測卡的抗體 都具有獨特的特異性選擇，但性質(zhì)相同或結(jié)構(gòu)相似的樣品組 成會產(chǎn)生干擾。 6.加樣量為70-80l左右（垂直加三滴） 如果加樣量太大或太小，將會影響實驗結(jié)果。如樣品非常 粘稠，有可能導(dǎo)致樣品爬不上去，此時可適當(dāng)多滴12滴。 7.以T線的條帶為觀測點,C線為質(zhì)量控質(zhì)線 由于動物個體的差異使尿樣樣本中的成分組成不同，檢測 時，有的檢測線可能偏淡或顏色偏灰，但只要條帶出現(xiàn)，就 可判定為陰性結(jié)果。 培訓(xùn)資料 8. 如果尿樣出現(xiàn)沉淀或渾濁物，請離心后或靜置后再檢測； 9.試紙條應(yīng)常溫保存，防止溫度過高或過低 放在冰箱中要防止溫度過低，檢測卡受潮，一般風(fēng)泠冰箱 最好，溫度控制在8左右較為理想。避免在炎熱高濕的環(huán)境 中保存。 10.陽性疑似樣品應(yīng)在0 -4冷凍保存 冷藏和常溫條件下 ，尿中的瘦肉精在尿酸和酶的作用下易發(fā)生降解，含量會大幅 下降，表出現(xiàn)最為突出的是鹽酸克倫特羅和萊克多巴胺，因此 需確證的尿樣必須冷凍保