理化生]高中生物 11DNA重組技術(shù)的基本工具課件 新人教版選修.ppt

藍(lán)色妖姬,藍(lán)色妖姬的產(chǎn)生,三色紫羅蘭,玫瑰,目的基因,受體細(xì)胞,基因工程,專題1,每100kg 豬或牛的胰腺中僅可提取45g。,1979年，美國(guó)將人的胰島素基因重組到大腸桿菌內(nèi)，實(shí)現(xiàn)了細(xì)菌生產(chǎn)胰島素，大大降低了生產(chǎn)成本。,治療糖尿病特效藥,據(jù)調(diào)查： 2005年全世界約有糖尿病患者1.8億人，我國(guó)約6000萬。,胰島素,思考：轉(zhuǎn)基因技術(shù)實(shí)現(xiàn)了一種生物的某些性狀 在另一種生物中表達(dá)。這些性狀的表達(dá)與我們學(xué)過的基因的什么過程有關(guān)？,密碼子在生物界是 的！,通用,基因工程的產(chǎn)物,什么叫基因工程？,基因工程，又叫DNA重組技術(shù)。通俗的說，就是按照人們的意愿，把一種生物的某種基因提取出來，加以修飾改造，然后放到另一種生物的細(xì)胞里，定向地改造生物的遺傳特性。,基因工程的概念,基因工程的概念,DNA重組技術(shù),生物體外,基因,DNA分子水平,剪切, 拼接, 導(dǎo)入, 表達(dá),問題探討：,蘇云金芽孢桿菌含有一種可以合成毒蛋白的基因。 讓細(xì)菌的毒蛋白基因在棉花細(xì)胞中表達(dá)，可培育出抵抗棉鈴蟲害的抗蟲棉。 想一想需要做哪些關(guān)鍵工作？,普通棉花 抗蟲棉,基因工程培育抗蟲棉的簡(jiǎn)要過程：,在以上過程中關(guān)鍵步驟或難點(diǎn)是什么？,普通棉花(無抗蟲特性),蘇云金芽孢桿菌,提取,抗蟲基因,通過運(yùn)載體導(dǎo)入,轉(zhuǎn)基因棉花含抗蟲基因,轉(zhuǎn)基因棉花產(chǎn)生伴胞晶體,轉(zhuǎn)基因棉花有抗蟲特性,基因工程培育抗蟲棉的關(guān)鍵步驟：,關(guān)鍵步驟一：,抗蟲基因從蘇云金芽孢桿菌細(xì)胞內(nèi)提取出來,關(guān)鍵步驟二：,抗蟲基因與棉花DNA“縫合”,關(guān)鍵步驟三：,抗蟲基因進(jìn)入棉花細(xì)胞,解決培育抗蟲棉的關(guān)鍵步驟需要哪些工具？,“分子手術(shù)刀” 限制性核酸內(nèi)切酶,“分子縫合針” DNA連接酶,“分子運(yùn)輸車” 基因進(jìn)入受體細(xì)胞的載體,1.1、DNA重組技術(shù)的基本工具,一、限制性核酸內(nèi)切酶“分子手術(shù)刀”,1.主要來源： 種類與命名： 作用特點(diǎn)（特異性） 4.限制酶識(shí)別序列 5.作用結(jié)果：,識(shí)別特定核苷酸序列，并且使每條鏈中特定部位的兩個(gè)核苷酸之間的磷酸二酯鍵斷開。,主要從原核生物中分離純化,產(chǎn)生黏性末端或平末端,大多數(shù)限制酶的識(shí)別序列由6個(gè)核苷酸組成 少數(shù)的識(shí)別序列由4、5或8個(gè)核苷酸組成,尋根問底,你能推測(cè)限制酶存在于原核生物中的作用是是什么嗎？,原核生物易受自然界外源DNA的入侵，但生物在長(zhǎng)期的進(jìn)化過程中形成了一套完善的防御機(jī)制，以防止外來病原物的侵害。限制酶就是細(xì)菌的一種防御性工具，當(dāng)外源DNA侵入時(shí)，會(huì)利用限制酶將外源DNA切割掉，以保證自身的安全。所以，限制酶在原核生物中主要起到切割外源DNA、使之失效，從而達(dá)到保護(hù)自身的目的。,思考與探究 P7 （2）,為什么限制酶不剪切細(xì)菌本身的DNA？,通過長(zhǎng)期的進(jìn)化，細(xì)菌中含有某種限制酶的細(xì)胞，其DNA分子中或者不具備這種限制酶的識(shí)別切割序列；或者通過甲基化酶將甲基轉(zhuǎn)移到所識(shí)別序列的堿基上，使限制酶不能將其切開。這樣，盡管細(xì)菌中含有某種限制酶也不會(huì)使自身的DNA被切斷，并且可以防止外源DNA的入侵。,種類與命名：,現(xiàn)在已經(jīng)從約300種微生物中分離出了約4000種限制性內(nèi)切酶(限制酶)。,EcoR,Sma,粘質(zhì)沙雷氏桿菌 （Serratia marcesens）,大腸桿菌 （Escherichia coli R）,練習(xí)：流感嗜血桿菌的d菌株( Haemophilus influenzae d )中先后分離到3種限制酶，則分別命名為:,Hind、Hind和Hind,磷酸二酯鍵,H2O +,限制性內(nèi)切酶與DNA解旋酶的區(qū)別,切割特定的核苷酸序列的磷酸二酯鍵,將DNA兩條鏈的氫鍵打開形成兩條單鏈,限制性內(nèi)切酶與DNA水解酶的區(qū)別,切割特定的核苷酸序列的磷酸二酯鍵，形成片段的DNA.,切割磷酸二酯鍵，形成單個(gè)的脫氧核苷酸。,限制酶的識(shí)別序列：,能被限制性內(nèi)切酶特異性識(shí)別的切割部位都具有回文序列：在切割部位，一條鏈正向讀的堿基順序與另一條鏈反向讀的順序完全一致。,EcoR,黏性末端,黏性末端,EcoR,黏性末端,黏性末端,重復(fù)演示,什么叫黏性末端？,被限制酶切開的DNA兩條單鏈的切口，帶有幾個(gè)伸出的核苷酸，它們之間正好互補(bǔ)配對(duì)，這樣的切口叫黏性末端。,Sma,平末端 平末端,限制酶所識(shí)別的序列，無論是6個(gè)堿基還是4個(gè)堿基，都可以找到一條中軸線（如圖），中軸線兩側(cè)的雙鏈DNA上的堿基是反向?qū)ΨQ、重復(fù)排列的。,想一想限制酶所識(shí)別的序列有什么特點(diǎn)？,要想獲得某個(gè)特定性狀的基因必須要用限制酶切幾個(gè)切口？可產(chǎn)生幾個(gè)黏性(平)末端？,要切兩個(gè)切口，產(chǎn)生四個(gè)黏性(平)末端。,如果把兩種來源不同的DNA用同一種限制酶來切割，會(huì)怎樣呢？,會(huì)產(chǎn)生相同的黏性(平)末端，然后讓兩者的黏性(平)末端黏合起來，就似乎可以合成重組的DNA分子了。,思考?,GAATTC CTTAAG,GAATTC CTTAAG,EcoR,不同來源的DNA片段混合,將不同種來源的DNA片段連接起來,生物A基因片段,生物B基因片段,G AATTC CTTAA G,酶切,GAATTC CTTAAG,同一種,尋根問底,DNA連接酶與DNA聚合酶是一回事嗎?為什么?,1)只能將單個(gè)核苷酸連接到已有的核酸片段上，形成磷酸二酯鍵,形成磷酸二酯鍵,1)在兩個(gè)DNA片段之間形成磷酸二酯鍵,2)以一條DNA鏈為模板，將單個(gè)核苷酸通過磷酸二酯鍵連接成一條互補(bǔ)的DNA鏈,2)將DNA雙鏈上的兩個(gè)缺口同時(shí)連接起來，不需要模板,二、“分子縫合針” DNA連接酶,作用:,把切下來的DNA片段拼接成新的DNA，即將脫氧核糖和磷酸連接起來.,作用原理：,催化磷酸二酯鍵形成,類型：,EcoliDNA連接酶,T4DNA連接酶,來源,功能,大腸桿菌,T4噬菌體,恢復(fù) 磷酸 二酯鍵,只能連接黏性末端,能連接黏性末端和平末端(效率較低),相同點(diǎn),差別,可把黏性末端之間的縫隙“縫合”起來，,Ecoli DNA連接酶 或T4DNA連接酶,即恢復(fù)被限制酶切開的兩個(gè)核苷酸之間的磷酸二酯鍵,T4 DNA連接酶還可把平末端之間的縫隙“縫合”起來，但效率較低,T4DNA連接酶,三、“分子運(yùn)輸車” 基因進(jìn)入受體細(xì)胞的載體,載體需要的條件： 有1多個(gè)限制酶切點(diǎn) 對(duì)受體細(xì)胞無害 導(dǎo)入基因能在受體細(xì)胞中復(fù)制、表達(dá) 有某些標(biāo)記基因，便于篩選 常用運(yùn)載體： 細(xì)菌的質(zhì)粒 噬菌體衍生物或某些動(dòng)植物病毒,假如目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞后不能復(fù)制或不能轉(zhuǎn)錄，轉(zhuǎn)基因生物能有預(yù)想的效果嗎？,作為分子運(yùn)輸車載體，如果沒有切割位點(diǎn)將會(huì)怎樣？,霍亂菌的質(zhì)粒多個(gè)限制酶切點(diǎn)，你會(huì)用它來做分子運(yùn)輸車嗎？,目的基因有沒有進(jìn)入受體細(xì)胞，如何去發(fā)現(xiàn)？,常用的載體：質(zhì)粒,能復(fù)制并帶著插入的目的基因一起復(fù)制,有切割位點(diǎn),有標(biāo)記基因的存在，可用含氨芐青霉素的培養(yǎng)基鑒別,2,7,4,8,3,6,1,5,CTGCAG GADGTC,ACGT TGCA,GCGC CGCG,GAATTC CTTAAG,思考與探究 P7,2、為什么限制酶不剪切細(xì)菌本身的DNA？,通過長(zhǎng)期的進(jìn)化，細(xì)菌中含有某種限制酶的細(xì)胞，其DNA分子中或者不具備這種限制酶的識(shí)別切割序列；或者通過甲基化酶將甲基轉(zhuǎn)移到所識(shí)別序列的堿基上，使限制酶不能將其切開。這樣，盡管細(xì)菌中含有某種限制酶也不會(huì)使自身的DNA被切斷，并且可以防止外源DNA的入侵。,3、天然的DNA分子可以直接用做基因工程載體嗎？為什么？,提示： 基因工程中作為載體使用的DNA分子很多都是質(zhì)粒（plasmid），即獨(dú)立于細(xì)菌擬核染色體DNA之外的一種可以自我復(fù)制、雙鏈閉環(huán)的裸露的DNA分子。 是否任何質(zhì)粒都可以作為基因工程載體使用呢？ 不是，作為基因工程使用的載體必需滿足以下條件：,思考與探究 P7,1） 載體DNA必需有一個(gè)或多個(gè)限制酶的切割位點(diǎn)，以便目的基因可以插入到載體上去。這些供目的基因插入的限制酶的切點(diǎn)所處的位置，還必須是在質(zhì)粒本身需要的基因片段之外，這樣才不至于因目的基因的插入而失活。 2） 載體DNA必需具備自我復(fù)制的能力，或整合到受體染色體DNA上隨染色體DNA的復(fù)制而同步復(fù)制。 3） 載體DNA必需帶有標(biāo)記基因，以便重組后進(jìn)行重組子的篩選。 4） 載體DNA必需是安全的，不會(huì)對(duì)受體細(xì)胞有害，或不能進(jìn)入到除受體細(xì)胞外的其他生物細(xì)胞中去。 5） 載體DNA分子大小應(yīng)適合，以便提取和在體外進(jìn)行操作，太大就不便操作。 實(shí)際上自然存在的質(zhì)粒DNA分子并不完全具備上述條件，都要進(jìn)行人工改造后才能用于基因工程操作。,4、DNA連接酶有連接單鏈DNA的本領(lǐng)嗎？,迄今為止，所發(fā)現(xiàn)的DNA連接酶都不具有連接單鏈DNA的能力，至于原因，現(xiàn)在還不清楚，也許將來會(huì)發(fā)現(xiàn)可以連接單鏈DNA的酶。,思考與探究 P7,1.在基因工程中，切割運(yùn)載體和含有目的基因的DNA片段，需使用（ ） 同種限制酶 B. 兩種限制酶 同種連接酶 D. 兩種連接酶,A,課堂