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文檔簡介

實驗七 聚合酶鏈式反應（PCR）技術(shù),1. 實驗目的 2. 實驗原理 3. 實驗儀器、材料與試劑 4. 實驗步驟 5. 實驗結(jié)果與討論,實驗目的,掌握PCR反應的原理及技術(shù)。,實驗原理,聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction）簡稱PCR技術(shù)，是一種體外擴增特異DNA片段的技術(shù)。 利用PCR技術(shù)可在短時間內(nèi)獲得數(shù)百萬個特異的DNA序列的拷貝。PCR技術(shù)在分子克隆、遺傳病的基因診斷等方面得到廣泛的應用。 PCR技術(shù)實際上是在模板DNA、引物和4種脫氧核苷酸存在的條件下依賴于DNA聚合酶的酶促合成反應。 PCR技術(shù)的特異性取決于引物和模板DNA結(jié)合的特異性。,PCR：變性退火延伸,PCR,反應分為三步： 1.變性：在高溫條件下，DNA雙鏈解離形成單鏈DNA； 2.退火：當溫度突然降低時引物與其互補的模板在局部形成雜交鏈； 3.延伸：在DNA聚合酶、dNTPs和Mg2+存在的條件下，聚合酶催化以引物為起始點的DNA鏈延伸反應。 以上三步為一個循環(huán)，每一循環(huán)的產(chǎn)物可以作為下一個循環(huán)的模板，幾十個循環(huán)之后，介于兩個引物之間的特異性DNA片段得到了大量復制，數(shù)量可達到1067個拷貝。,PCR技術(shù)的參數(shù)主要有7個： 聚合酶、引物、dNTPs、反應buffer、二價離子、模板、一價離子。,實驗儀器、材料與試劑,（一）儀器 1. PCR儀 2. 臺式離心機 3. 微量取液器,（二）材料 模板DNA,（三）試劑 1. 10x PCR buffer 2. dNTPs 2.5mM 3. Taq 酶 5u/l 4. 引物1和2( 2mol/L) (T3,T7) 5. 模板,實驗步驟,1. 在0.2ml Eppendorf管內(nèi)配制50l反應體系 ddH2O： 33.5ul 10x PCR buffer： 5ul dNTPs（2.5mM）： 4ul 引物1 (2uM)： 1ul 引物2 (2uM)： 1ul MgCl2 3ul Taq 酶： 0.5ul 模板： 2ul 共50ul 體系,2. 按下述循環(huán)程序進行擴增 94 5分鐘，1個循環(huán)； 94 30秒，52 30秒，72 30秒，30個循環(huán)； 72 延伸10 分鐘。 4保溫。,3. 擴增結(jié)束后取50l擴增產(chǎn)物，利用瓊脂糖電泳檢測DNA擴增情況,并切膠用于回收.,實驗結(jié)果與討論,PCR

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