植物生物工程實(shí)驗(yàn)二(植物DNA的提取).ppt

植物生物工程實(shí)驗(yàn),植物DNA提取、質(zhì)量檢測(cè) 及特定基因片段操作,綜合實(shí)驗(yàn)二,郝大海,實(shí)驗(yàn)?zāi)康?了解植物DNA提取方法，熟悉操作步驟 掌握植物大分子操作注意事項(xiàng)及試劑用具準(zhǔn)備方法 掌握DNA質(zhì)量紫外分光光度計(jì)檢測(cè)方法 了解PCR原理，熟悉操作步驟 掌握核酸的瓊脂糖電泳檢測(cè)方法,保證DNA一級(jí)結(jié)構(gòu)的完整性 排除其它分子的污染 RNA、蛋白質(zhì)、多糖等,DNA提取的原則,實(shí)驗(yàn)原理（DNA提?。?DNA存在部位,主要存在于細(xì)胞核中，線粒體和葉綠體中也少量存在,基因組DNA的提取 CTAB法 SDS法 質(zhì)粒DNA的提取 堿裂解法 煮沸法 線粒體、葉綠體DNA的提取 差速離心結(jié)合SDS裂解法,DNA提取的方法,在濃氯化鈉溶液(12mol/L)中,DNA核蛋白的溶解度很大,RNA核蛋白的溶解度很小;而在稀氯化鈉溶液(0.14mol/L)中,DNA核蛋白的溶解度很小,RNA核蛋白的溶解度很大.因此,可利用不同濃度的氯化鈉溶液將DNA核蛋白和RNA核蛋白從樣品中分別抽提出來(lái).,分離得到核蛋白后,需進(jìn)一步將蛋白等雜質(zhì)除去,常采用的去除蛋白的方法有3種: 用含辛醇或異戊醇的氯仿振蕩核蛋白溶液,使其乳化,然后離心除去變性蛋白質(zhì),此時(shí)蛋白質(zhì)凝膠停留在水相和氯仿相中間,而DNA溶于上層水相.用兩倍體積95%乙醇溶液將DNA鈉鹽沉淀出來(lái).如果用酸性乙醇或冰乙酸來(lái)沉淀,得到的是游離的DNA. 用十二烷基硫酸鈉(SDS)等去污劑使蛋白質(zhì)變性,與核酸分離,從而從材料中直接提取出DNA. 用苯酚處理,然后離心分層,DNA或溶于上層水相,或存在于中間殘留物中,蛋白變性后則停留在酚層內(nèi).吸出上面水層,將其注入兩倍體積的95%乙醇溶液中,得到白色纖維狀DNA沉淀,CTAB法原理,CTAB（十六烷基三甲基溴化銨），是一種陽(yáng)離子去污劑， 可溶解細(xì)胞膜，并與核酸形成復(fù)合物,高鹽溶液中（0.7mol/L NaCl），該復(fù)合物可溶的 有機(jī)溶劑抽提，去除蛋白、多糖、酚類(lèi)等雜質(zhì),上清加入乙醇沉淀DNA。,CTAB溶液在低于15 時(shí)會(huì)形成沉淀析出，因此在將其加入冰冷的 植物材料之前必須預(yù)熱，且離心時(shí)溫度不要低于15。,CTAB,CTAB提取緩沖液的經(jīng)典配方,SDS法,原理 SDS 陰離子去垢劑 高溫（5565）裂解細(xì)胞，蛋白變性，染色體離析 高鹽(KAc或NH4Ac) 或降低溫度（冰浴） 使蛋白質(zhì)及多糖雜質(zhì)沉淀 上清液中的DNA用酚/氯仿抽提 乙醇沉淀水相中的DNA,SDS,SDS提取緩沖液的配方,DNA提取基本步驟,材料準(zhǔn)備,細(xì)胞裂解,核酸分離純化,核酸沉淀,核酸溶解保存,基因組DNA 新鮮材料，低溫保存 細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)間不能過(guò)長(zhǎng),材料準(zhǔn)備,基因組DNA 材料過(guò)多影響裂解，導(dǎo)致DNA量少，純度低 針對(duì)不同材料，選擇適當(dāng)?shù)牧呀忸A(yù)處理方式： 植物材料液氮研磨 培養(yǎng)細(xì)胞蛋白酶K,細(xì)胞裂解,采用吸附材料吸附分離DNA，應(yīng)提供相應(yīng)的緩沖體系 采用有機(jī)溶劑（酚/氯仿）抽提時(shí)應(yīng)充分而輕柔的混勻 離心分離兩相時(shí)，應(yīng)保證一定的轉(zhuǎn)速和時(shí)間 針對(duì)不同材料的特點(diǎn)，在提取過(guò)程中輔以相應(yīng)的去雜質(zhì)的方法,核酸分離純化,多糖的去除： 多糖水解酶,蛋白質(zhì)的去除： 酚/氯仿抽提 使用變性劑（SDS、異硫氰酸胍等） 蛋白酶處理,多酚的去除： 加入還原劑：-巰基乙醇、抗壞血酸、半胱氨酸、二硫蘇糖醇等 加入易與酚類(lèi)結(jié)合的試劑：如PVP、PEG，可防止酚類(lèi)與DNA的結(jié)合 鹽離子的去除： 70的乙醇洗滌,預(yù)冷的乙醇或異丙醇更充分沉淀 加入1/10體積的NaAc（pH5.2，3M）更充分沉淀 晾干DNA，讓乙醇充分揮發(fā),核酸沉淀,若長(zhǎng)期儲(chǔ)存建議使用TE緩沖液溶解 pH值為8.0，可防止DNA發(fā)生酸解,DNA質(zhì)量檢測(cè),紫外分光光度計(jì)檢測(cè)法 嘌呤和嘧啶的母環(huán)含有共軛雙鍵，因此也有紫外吸收現(xiàn)象，且在260nm和280nm處也存在吸收峰。蛋白質(zhì)中含苯環(huán)的氨基酸在這兩個(gè)波長(zhǎng)下也會(huì)發(fā)生光吸收。因此，通過(guò)260nm和280nm下樣品的吸收值比率可判斷核酸純度,A：測(cè)DNA： 純的DNA樣品OD260/OD280應(yīng)為1.8，OD260mOD230應(yīng)大于2.0。 1) OD260/OD280大于1.9時(shí)，表明有RNA污染。 2) 小于1.6時(shí)，表明樣品中存在蛋白質(zhì)或酚污染； 3) OD260/OD230小于2.0時(shí)，表明溶液中有殘存的鹽和小分子雜質(zhì)，如核苷酸、氨基酸、酚等。 注： 可能出現(xiàn)既含蛋白質(zhì)又含RNA的DNA溶液比值為1.8的情況。,測(cè)定結(jié)果分析,瓊脂糖電泳,瓊脂糖凝膠電泳是常用的用于分離、鑒定DNA、RNA分子混合物的方法，這種電泳方法以瓊脂凝膠作為支持物，利用DNA分子在泳動(dòng)時(shí)的電荷效應(yīng)和分子篩效應(yīng)，達(dá)到分離混合物的目的。DNA分子在高于其等電點(diǎn)的溶液中帶負(fù)電，在電場(chǎng)中向陽(yáng)極移動(dòng)。在一定的電場(chǎng)強(qiáng)度下，DNA分子的遷移速度取決于分子篩效應(yīng)，即分子本身的大小和構(gòu)型是主要的影響因素。DNA分子的遷移速度與其相對(duì)分子量成反比。,DNA、RNA在熒光染料溴乙錠(EB)嵌入堿基平面之間后，DNA、RNA樣品在紫外光激發(fā)下，可發(fā)出紅色熒光，熒光強(qiáng)度與核酸含量成正比。使用一系列已知的不同濃度DNA溶液作標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照，可比較出被測(cè)DNA溶液濃度。 注意：此法的比較主要基于目測(cè)，是估計(jì)水平。 當(dāng)用低濃度的熒光嵌入染料溴化乙啶(Ethidium bromide, EB)染色，在紫外光下至少可以檢出1-10ng的DNA條帶，從而可以確定DNA片段在凝膠中的位置。此外，還可以從電泳后的凝膠中回收特定的DNA條帶，用于以后的克隆操作,根據(jù)OD260定量：,測(cè)定260nm吸光值，OD=1.0代表值如下： a. ds DNA (double stranded DNA) = 50 mg/ml b. ss DNA (single stranded DNA) = 40 mg/ml c. oligonucleotide = 33 mg/ml,PCR實(shí)驗(yàn)原理,聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerase chain reaction,PCR)，是一種在體外快速擴(kuò)增特定基因或DNA序列的方法，故又稱(chēng)為基因的體外擴(kuò)增法。 在待擴(kuò)增的DNA片斷兩側(cè)和與其兩側(cè)互補(bǔ)的兩個(gè)寡核苷酸引物，經(jīng)變性、退火和延伸若干個(gè)循環(huán)后，DNA擴(kuò)增2n倍。,DNA復(fù)制（replication）,起始 解旋 引物酶結(jié)合 延伸 連接 終止,5,3,5,3,PCR反應(yīng)的溫度循環(huán)周期 PCR 反應(yīng)的每一個(gè)溫度循環(huán)周期都是由DNA變性、引物退火和反應(yīng)延伸三個(gè)步驟完成的。圖中設(shè)定的反應(yīng)參數(shù)是94變性1min， 60 退火1min， 72 延伸1.5min。如此周而復(fù)始，重復(fù)進(jìn)行，直至擴(kuò)增產(chǎn)物的數(shù)量滿足實(shí)驗(yàn)需求為止。,一般PCR反應(yīng)條件,儀器藥品,1.5ml離心管；5ml離心管；研磨棒；5ml吸頭；1000ul吸頭（盒）；200ul吸頭（盒）；10ul吸頭（盒）；5ml移液器；1000ul移液器；200ul移液器；30ul移液器；2ul移液器；試劑瓶；量筒 恒溫水浴鍋；高速離心機(jī)；紫外分光光度計(jì)；電泳儀；電泳槽；酸度計(jì)；電子天平；PCR儀 CTAB；NaCl；Tris；HCl；H3BO4；EDTA；NaOH；PVP；瓊脂糖；EB；引物；dNTP；Taq酶；EB,實(shí)驗(yàn)步驟,試劑配制,1M Tris HCl, pH 8.0,先用蒸餾水溶解加至90ml左右，再用HCl調(diào)整pH至8.0，定容至100ml,0.5M EDTA, pH 8.0,先用蒸餾水，再加入NaOH（固體）調(diào)pH至8.0，定容至100ml,5M NaCl,2CTAB,10% CTAB,T10E1,5TBE,異丙醇；70%乙醇；90%乙醇；10mg/ml EB,抽提液,1M Tris HCl；0.5M EDTA；5M NaCl；T10E1以及所有需使用的離心管，各種吸頭均需滅菌,操作流程,操作規(guī)程 1. 稱(chēng)取100mg新鮮葉片，置于預(yù)冷1.5ml離心管中，加入液氮，研為細(xì)粉。加入350l新鮮2CTAB緩沖液，再仔細(xì)研磨。（CTAB用于抽提DNA） 2. 用350l新鮮2CTAB緩沖液，沖洗研磨棒，加入2l巰基乙醇，混勻。65水浴45分鐘，每15分鐘搖動(dòng)一次。冷卻至室溫，靜置2分鐘。 3. 每支離心管加入700l氯仿：異戊醇（24：1）（672氯仿:28異戊醇）混合液。輕柔短暫地混和，避免DNA斷裂。顛倒幾次。（氯仿、異戊醇、苯酚都用于沉淀蛋白質(zhì)） 4. 在微型離心機(jī)中，以14，000rpm離心5分鐘。移取上層水層，置于新的、標(biāo)識(shí)好的1.5ml離心管中。注意避免取到中層物質(zhì)。將氯仿：異戊醇廢液倒入廢液缸。 5. 加入50l 10CTAB（溶于0.7M NaCl），輕柔混和，并保證混和完全。,6. 重復(fù)第3、第4步。 7. 每支離心管中加入等體積異丙醇（400500l）。上下顛倒幾次，4靜置20分鐘（或20，15分鐘）。（異丙醇用于沉淀DNA） 8. 14，000rpm離心20分鐘。小心倒出上清夜，避免DNA顆粒丟失。倒置離心管，空氣干燥（12分鐘）。 9. 用1ml70乙醇清洗DNA（3分鐘），14,000rpm離心30分鐘。小心倒出70%乙醇，用1ml 90乙醇清洗DNA，14,000rpm離心30分鐘，小心地倒去乙醇。倒置離心管，空氣中干燥，或用真空泵干燥15分鐘。（乙醇用于去除低分子量寡核苷酸和核苷三磷酸） 10. 以150l T10E1或蒸餾水溶解DNA，加入12l不含DNA酶的RNA酶A（10mg/ml）。37反應(yīng)1小時(shí)。 11. 4保存（20長(zhǎng)期保存）。,冷卻至 室 溫,冷卻至 室 溫,瓊脂糖凝膠電泳,取5TBE緩沖液20mL加水至100mL，配制成1TBE稀釋緩沖液，待用。 膠液的制備：稱(chēng)取0.4g瓊脂糖，置于200mL錐形瓶中，加入50mL 1TBE稀釋緩沖液，放入微波爐里加熱至瓊脂糖全部熔化，取出搖勻，此為1瓊脂糖凝膠液。加熱過(guò)程中要不時(shí)搖動(dòng)，使附于瓶壁上的瓊脂糖顆粒進(jìn)入溶液。,3. 膠板的制備：將有機(jī)玻璃膠槽兩端分別用橡皮膏緊密封住。將封好的膠槽置于水平支持物上，插上樣品梳子，注意觀察梳子齒下緣應(yīng)與膠槽底面保持1mm左右的間隙。 向冷卻至50-60的瓊脂糖膠液中加入溴化乙錠(EB)溶液使其終濃度為0.5g /mL。用移液器吸取少量融化的瓊脂糖凝膠封橡皮膏內(nèi)側(cè)，待瓊脂糖溶液凝固后將剩余的瓊脂糖小心地倒入膠槽內(nèi)，使膠液形成均勻的膠層。待膠完全凝固后撥出梳子，注意不要損傷梳底部的凝膠，然后向槽內(nèi)加入1TBE稀釋緩沖液至液面恰好沒(méi)過(guò)膠板上表面。,加樣：取10L DNA樣品與2L 6上樣液混勻，用微量移液槍小心加入樣品槽中。若DNA含量偏低，則可依上述比例增加上樣量，但總體積不可超過(guò)樣品槽容量。每加完一個(gè)樣品要更換tip頭，以防止互相污染，注意上樣時(shí)要小心操作，避免損壞凝膠或?qū)悠凡鄣撞磕z刺穿。 電泳：加完樣后,合上電泳槽蓋，立即接通電源?？刂齐妷罕３衷?0-80V，電流在40mA以上。當(dāng)溴酚藍(lán)條帶移動(dòng)到距凝膠前沿約2cm時(shí)，停止電泳。 染色：未加EB的膠板在電泳完畢后移入0.5g/mL的EB溶液中，室溫下染色20-25min。 觀察和拍照：在波長(zhǎng)為254nm的長(zhǎng)波長(zhǎng)紫外燈下觀察染色后的或已加有EB的電泳膠板。,紫外分光光度計(jì)測(cè)定核酸濃度的操作步驟,a吸取一定量的DNA樣品或RNA樣品，加水至特定體積后，轉(zhuǎn)入分光光度計(jì)的石英比色杯中。 b分光光度計(jì)先用一定量的水校正零點(diǎn)。 c測(cè)定待測(cè)樣品在230nm、260nm和280nm的OD值。 d計(jì)算濃度。 雙鏈DNA樣品濃度(g/l) = OD260核酸稀釋倍數(shù) 50/1000； e分析純度。,PCR反應(yīng)體系,PCR反應(yīng)程序,EB是強(qiáng)誘變劑并有中等毒性，配制和使用時(shí)都應(yīng)戴手套，并且不要把EB灑到桌面或地面上。凡是沾污了EB的容器或物品必須經(jīng)專(zhuān)門(mén)處理后才能清洗。沾染了EB的垃圾要專(zhuān)門(mén)處理后才可丟棄。 當(dāng)EB太多, 膠染色過(guò)深，DNA帶看不清時(shí)，可將膠放入蒸餾水沖泡，30min后再觀察。 制備凝膠時(shí)，倒膠的溫度不可太低，否則凝固不均勻：速度也不可太快，否則容易出現(xiàn)氣泡。,實(shí)驗(yàn)注意事項(xiàng),CTAB(hexadecyltrimethylammonium bromide,十六烷基三甲基溴化銨)，是一種陽(yáng)離子去污劑,具有從低離子強(qiáng)度溶液中沉淀核酸與酸性多聚糖的特性。在高離子強(qiáng)度的溶液中(0.7mol/L NaCl),CTAB與蛋白質(zhì)和多聚糖形成復(fù)合物，只是不能沉淀核酸.通過(guò)有機(jī)溶劑抽提，去除蛋白、多糖、酚類(lèi)等雜質(zhì)后加入乙醇沉淀即可使核酸分離出來(lái)。 注：CTAB溶液在低于15 時(shí)會(huì)形成沉淀析出，因此，在將其加入冰冷的植物材料之前必須預(yù)熱，且離心時(shí)溫度不要低于15。,(1) PVP(聚乙烯吡咯烷酮)是酚的絡(luò)合物，能與多酚形成一種不溶的絡(luò)合物質(zhì)，有效去除多酚，減少DNA中酚的污染；同時(shí)它也能和多糖結(jié)合，有效去除多糖； (2) 蛋白質(zhì)的去除：酚/氯仿抽提使用變性劑變性(SDS、異硫氰酸胍等)高鹽洗滌蛋白酶處理核酸分離，純化； (3)多糖的去除：高鹽法：用乙醇沉淀時(shí)，在待沉淀溶液中加入1/2體積的5M NaCl，高鹽可溶解多糖。用多糖水解酶將多糖降解。在提取緩沖液中加一定量的氯苯(1/2體積)，氯苯可以與多糖的羥基作用，從而去除多糖。用PEG8000代替乙醇沉淀DNA：在500 L DNA液中加入200l 20% PEG8000 (含1.2 M NaCl)，冰浴20min.核酸分離，純化； (4) 多酚的去除:在抽提液中加