利用酵母菌生產(chǎn)蛋白質(zhì).ppt

第5章 利用酵母菌生產(chǎn)蛋白質(zhì),概述 酵母菌的基因組結(jié)構(gòu)及其特點(diǎn) 酵母表達(dá)系統(tǒng) 影響酵母菌中外源基因表達(dá)的調(diào)控因子 外源基因的表達(dá)及產(chǎn)物分泌,酵母細(xì)胞模式圖,1、概述,細(xì)菌細(xì)胞,外源蛋白表達(dá)系統(tǒng),原核表達(dá)系統(tǒng),- 高水平表達(dá) 為還原性?xún)?nèi)環(huán)境，不能形成二硫鍵，某些蛋白不能進(jìn)行有效折疊,1,外源蛋白表達(dá)系統(tǒng),原核表達(dá)系統(tǒng),- 高水平表達(dá) 為還原性?xún)?nèi)環(huán)境，不能形 成二硫鍵，某些蛋白不能 進(jìn)行有效折疊,1,真核表達(dá)系統(tǒng),相對(duì)高水平表達(dá) 可發(fā)生一定程度的翻譯后修飾作 用，有利于實(shí)現(xiàn)完整蛋白功能,2,外源蛋白表達(dá)系統(tǒng),原核表達(dá)系統(tǒng),- 高水平表達(dá) 為還原性?xún)?nèi)環(huán)境，不能形 成二硫鍵，某些蛋白不能 進(jìn)行有效折疊,1,真核表達(dá)系統(tǒng),相對(duì)高水平表達(dá) 可發(fā)生一定程度的翻譯后修飾作 用，有利于實(shí)現(xiàn)完整蛋白功能,2,哺乳細(xì)胞系統(tǒng),- 完備的翻譯后修飾系統(tǒng) - 低表達(dá)水平,3,蛋白質(zhì)表達(dá)系統(tǒng)的選擇,細(xì)菌,哺乳動(dòng)物細(xì)胞,昆蟲(chóng)細(xì)胞,酵母菌,增加,人培養(yǎng)細(xì)胞,品質(zhì), 細(xì)菌 酵母菌 昆蟲(chóng)細(xì)胞 哺乳動(dòng)物細(xì)胞,產(chǎn)量,蛋白質(zhì)產(chǎn)品,一級(jí)結(jié)構(gòu),二級(jí)結(jié)構(gòu),三級(jí)結(jié)構(gòu),四級(jí)結(jié)構(gòu),螺旋,折疊,高級(jí)結(jié)構(gòu), 切割前體。 前體蛋白中的某些氨基酸序列如信號(hào)肽的切出，形成有功能的蛋白質(zhì)。 蛋白質(zhì)的糖基化。 是將寡糖連接到一個(gè)蛋白質(zhì)分子上，是真核生物細(xì)胞表達(dá)基因產(chǎn)物時(shí)最重要的一種翻譯后修飾作用。 作用： i. 有利于保證所表達(dá)的蛋白質(zhì)進(jìn)行適當(dāng)?shù)恼郫B； ii. 保護(hù)蛋白質(zhì)免受細(xì)胞蛋白酶的降解。 最常見(jiàn)的是O-糖基化（加在Ser, Thr上）和N-糖基化（加在A(yíng)sn上）。酵母菌中的寡糖通常含有大量的甘露糖殘基。,多糖和蛋白質(zhì)在細(xì)胞壁上的連接方式,2. O-glycosidic linkage,1. N-glycosidic linkage,一般酵母菌中的寡糖,1,2,酵母菌突變株mnn9中的寡糖,在酵母菌中的糖基化只能添加富含甘露糖的寡糖，而不形成象高等動(dòng)物細(xì)胞中普遍存在的那種糖蛋白復(fù)合物。這種糖基化有時(shí)會(huì)影響蛋白質(zhì)的折疊和對(duì)蛋白酶的敏感性，更重要的是會(huì)影響蛋白質(zhì)在生物體內(nèi)的半衰期。, 對(duì)氨基酸的修飾作用。 包括磷酸化、甲基化、乙酰化、硫酸化、丙烯酸化、羧酸化、豆蔻酸化及軟脂?；?。,在原核生物中，可分泌蛋白質(zhì)是由N末端信號(hào)序列控制合成的，然后通過(guò)細(xì)胞膜上的“SecY-SecD-SecE-SecF”組成的蛋白質(zhì)復(fù)合物分泌出去。,（3） 真核細(xì)胞與原核細(xì)胞的蛋白質(zhì)分泌途徑,在酵母菌中，分泌蛋白的信號(hào)序列為信號(hào)識(shí)別顆粒（SRF）所識(shí)別。SRF包含6種蛋白質(zhì)分子，并由一個(gè)小的RNA分子將其串連在一起。通過(guò)SRF與其在膜表面上的受體之間的識(shí)別與結(jié)合，引導(dǎo)新生蛋白到達(dá)蛋白質(zhì)的輸出結(jié)構(gòu)，該結(jié)構(gòu)位于粗糙內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的特異性位點(diǎn)上。,在原核生物中LPS的產(chǎn)生。LPS的毒性； 酵母菌：細(xì)胞組分和代謝物對(duì)人體是安全的。,（4） 安全性,選擇性標(biāo)記基因 啟動(dòng)子 轉(zhuǎn)錄、翻譯終止信號(hào) 給mRNA加上poly(A) 復(fù)制起始位點(diǎn),酵母菌表達(dá)系統(tǒng),2、釀酒酵母基因組結(jié)構(gòu)及其特點(diǎn) 1996年 完成全長(zhǎng)為12Mb釀酒酵母基因組的測(cè)序。 釀酒酵母是一種重要的模式生物，也是第一個(gè)被測(cè)序的真核生物。它有16條染色體，基因組全長(zhǎng)為12Mb，含有6000多個(gè)基因。它的基因組的測(cè)序是作為HGP的一部分于上世紀(jì)80年代末期啟動(dòng)，于1996年完成。1997年Nature專(zhuān)門(mén)為釀酒酵母基因組發(fā)行了增刊。,釀酒酵母的基因組很小，僅有16條染色體。,釀酒酵母細(xì)胞既可以作為單倍體存在，也可以作為二倍體存在有利于發(fā)現(xiàn)隱性基因。,12068 kb,5109bp,3.5109bp,1.8108bp,4106bp,基因組全長(zhǎng)12068kb，有5885個(gè)編碼專(zhuān)一性蛋白質(zhì)的開(kāi)放閱讀框。酵母基因組中平均每隔2kb就存在一個(gè)編碼蛋白質(zhì)的基因，即整個(gè)基因組有72的核苷酸順序由開(kāi)放閱讀框組成。 酵母基因組的基因間隔區(qū)較短，基因中內(nèi)含子稀少。其開(kāi)放閱讀框平均長(zhǎng)度為1450bp即483個(gè)密碼子，最長(zhǎng)的是位于XII號(hào)染色體上的一個(gè)功能未知的開(kāi)放閱讀框(4910個(gè)密碼子)，還有極少數(shù)的開(kāi)放閱讀框長(zhǎng)度超過(guò)1500個(gè)密碼子。 酵母基因組中還包含：約140個(gè)編碼RNA的基因，排列在XII號(hào)染色體的長(zhǎng)末端； 40個(gè)編碼snRNA的基因，散布于16條染色體； 屬于43個(gè)家族的275個(gè)tRNA基因也廣泛分布于基因組中。,2.1 釀酒酵母基因組的結(jié)構(gòu),釀酒酵母基因組的結(jié)構(gòu),6108,2.2 酵母菌基因組結(jié)構(gòu)的特征,酵母染色體由大范圍的GC豐富DNA序列和GC缺乏DNA序列鑲嵌組成。GC含量高的區(qū)域一般位于染色體臂的中部，這些區(qū)域的基因密度較高；GC含量低的區(qū)域一般靠近端粒和著絲粒，這些區(qū)域內(nèi)基因數(shù)目較為貧乏； 酵母基因組另一個(gè)明顯的特征是含有許多DNA重復(fù)序列，其中一部分為完全相同的DNA序列，如rDNA與CUP1基因、Ty因子及其衍生的單一LTR序列等。,S. cerevisiae基因組的測(cè)序被稱(chēng)為現(xiàn)代分子生物學(xué)歷史上最為分散的實(shí)驗(yàn)。包括美國(guó)、加拿大、歐洲、日本等國(guó)家在內(nèi)的100多個(gè)實(shí)驗(yàn)室，超過(guò)600多名科學(xué)家都參與了這項(xiàng)工作。 酵母菌研究社群(the yeast community)，在A(yíng)ndre Goffeau教授(the Universite Catholique de Louvain in Belgium)的領(lǐng)導(dǎo)下，樹(shù)立了一個(gè)效率，合作，組織的典范。這樣一種國(guó)際合作也是基因組學(xué)研究的一個(gè)重要特點(diǎn)。,3、釀酒酵母基因表達(dá)系統(tǒng) 釀酒酵母作為受體菌的優(yōu)勢(shì)： （1）為單細(xì)胞真核生物，對(duì)其遺傳學(xué)和生理學(xué)的研究較為深入； （2）能快速生長(zhǎng)； （3）具有啟動(dòng)活性強(qiáng)的酵母基因啟動(dòng)子； （4）具有內(nèi)源表達(dá)載體和眾多的商業(yè)化載體（如Invitrogen）； （5）可以對(duì)所表達(dá)的蛋白質(zhì)進(jìn)行多種翻譯后修飾； （6）其自然分泌的蛋白質(zhì)很少，產(chǎn)物處理方便簡(jiǎn)單； （7）具有較高的安全性。被美國(guó)食品和醫(yī)藥管理局（FDA）確認(rèn) 為一種安全的生物（generanlly recognized as safe, GRAS）。,3.1 酵母菌標(biāo)記基因leu2的克隆 leu2編碼-異丙基蘋(píng)果酸脫氫酶（ - isopropylmalate dehydrogenase），該酶在亮氨酸的合成途徑中有重要作用。 克隆步驟： （1）提取酵母菌染色體DNA，經(jīng)適當(dāng)酶切，建立基因文 庫(kù)（質(zhì)粒載體，在E. coli中可復(fù)制）； （2）將攜帶酵母菌基因的質(zhì)粒電轉(zhuǎn)化E. coli -異丙基蘋(píng)果 酸脫氫酶缺陷型突變株LeuB，用不含Leu的培養(yǎng)基進(jìn) 行篩選轉(zhuǎn)化子； （3）抽提轉(zhuǎn)化子質(zhì)粒DNA，酶切驗(yàn)證后，進(jìn)行序列分析； （4）leu2基因的結(jié)構(gòu)確認(rèn)（啟動(dòng)子、RBS、起始序列、終 止序列與堿基數(shù)等）。,釀酒酵母選擇性標(biāo)記基因leu2的克隆示意圖,3.2 酵母菌表達(dá)系統(tǒng)常用載體 釀酒酵母表達(dá)系統(tǒng)的常用載體通常有：質(zhì)粒載體、整合載體和酵母人工染色體。 3.2.1 質(zhì)粒載體 酵母質(zhì)粒載體通常又可以分為酵母附加型載體(Yeast episomal plasmid, YEp)、酵母復(fù)制質(zhì)粒（Yeast replicating plasmid, YRp）和酵母著絲粒質(zhì)粒（Yeast centromere plasmid, YCp）三類(lèi)。 （1）YEp 由酵母菌內(nèi)生性質(zhì)粒改造而成。 釀酒酵母存在一個(gè)內(nèi)生性質(zhì)粒，大小為6.3kb，長(zhǎng)約為2 m，因此又通常稱(chēng)為2 m質(zhì)粒。具有以下特點(diǎn)： 在酵母菌穩(wěn)定存在，自主復(fù)制與分配； 在酵母細(xì)胞中的copy數(shù)可達(dá)500100個(gè)；, 含有一段長(zhǎng)度為599 bp的反向重復(fù)序列。該序列將該質(zhì)粒分成2部分，每一部分均含有一個(gè)啟動(dòng)子和該啟動(dòng)子控制下的2個(gè)基因，其中一個(gè)基因稱(chēng)為FLP，編碼一個(gè)位點(diǎn)特異性的重組酶（recombinase）。 2 m質(zhì)粒結(jié)構(gòu)示意圖,2 m質(zhì)粒的進(jìn)一步改造： 酵母菌-大腸桿菌穿梭質(zhì)粒（YEp）：加入部分酵母菌核DNA序列和大腸桿菌的質(zhì)粒復(fù)制子； 位點(diǎn)特異性重組質(zhì)粒載體：將E. coli的DNA插入到重組酶識(shí)別序列的正向重復(fù)序列中，經(jīng)過(guò)重組后該序列可以被丟失。,帶polyA序列的磷酸甘油醛 脫氫酶終止子,磷酸甘油醛脫氫酶啟動(dòng)子,外源蛋白,篩選標(biāo)記,（2）YRp 由大腸桿菌質(zhì)粒載體pBR322改造而成：加入一段來(lái)自于酵母菌的自主復(fù)制序列，從而使YRp能在酵母菌中復(fù)制，但是具有不穩(wěn)定性，容易丟失。 （3）YCp 含有酵母著絲粒序列的質(zhì)粒載體，能夠自主復(fù)制，穩(wěn)定遺傳。但是對(duì)酵母菌受體菌本身具有較大不利影響。,3.2.2 整合載體（YIp） 整合載體不含有酵母菌自主復(fù)制序列，不能在酵母菌中復(fù)制分配，但含有轉(zhuǎn)座子序列或者酵母菌染色體同源序列，可使其攜帶的外源基因通過(guò)轉(zhuǎn)座子的轉(zhuǎn)座作用或者同源交換作用而整合到酵母菌的染色體上。 酵母菌基因組中含有3040拷貝的轉(zhuǎn)座子，稱(chēng)為T(mén)y。Ty與反轉(zhuǎn)錄病毒在結(jié)構(gòu)和功能上具有很多相似之處：包含由兩個(gè)長(zhǎng)的ORF和兩個(gè)長(zhǎng)末端重復(fù)序列（LTR)。 外源基因插入位點(diǎn),畢赤酵母整合表達(dá)載體,AOX1p乙醇脫氫酶啟動(dòng)子； AOX1t帶有polyA序列的乙醇 脫氫酶終止子； HIS4組氨醇脫氫酶基因； oripp畢赤酵母復(fù)制區(qū)； oriE大腸桿菌復(fù)制區(qū)； Amp氨芐青霉素抗性基因； 3-AOX1為乙醇脫氫酶基因3 端的一段DNA序列； 箭頭處指示發(fā)生染色體整合 的位點(diǎn)。,3.2.3 酵母人工染色體（YAC） 為一種線(xiàn)狀DNA載體，最初由酵母菌復(fù)制質(zhì)粒 pSZ213發(fā)展而來(lái)，含有選擇性標(biāo)記leu2、自主復(fù)制序列和端粒序列。 現(xiàn)有多種商品化的酵母人工染色體，用于大片段DNA的克隆與序列分析。,酵母人工染色體克隆系統(tǒng),YAC質(zhì)粒（pYAC）包括以下元件： （1）Ampr (大腸桿菌抗性標(biāo)記) （2）oriE（大腸桿菌復(fù)制子） （3）酵母菌DNA序列，包括：CEN，具有著絲粒功能；ARS，酵母自主復(fù)制序列，相當(dāng)于酵母菌復(fù)制子；URA3，尿嘧啶生物合成基因；TRP1，色氨酸生物合成基因。,酵母人工染色體克隆系統(tǒng),YAC質(zhì)粒（pYAC）包括以下元件： （1）Ampr (大腸桿菌抗性標(biāo)記) （2）oriE（大腸桿菌復(fù)制子） （3）酵母菌DNA序列，包括：CEN，具有著絲粒功能；ARS，酵母自主復(fù)制序列，相當(dāng)于酵母菌復(fù)制子；URA3，尿嘧啶生物合成基因；TRP1，色氨酸生物合成基因。,T 位點(diǎn)是酵母菌染色體的端粒. SmaI 為克隆插入位點(diǎn). pYAC質(zhì)粒先用 SmaI和BamHI進(jìn)行酶切, 然后經(jīng)堿性磷酸酶處理（防止自連）后連接入外源DNA片段。,4、酵母中外源基因表達(dá)的調(diào)控因子 在酵母中表達(dá)外源基因受到很多調(diào)控因子的影響，包括有以下因素： 4.1 質(zhì)?？截悢?shù) 一般應(yīng)考慮適用高拷貝數(shù)的YEp質(zhì)粒作為載體，但應(yīng)注意過(guò)高量的外源蛋白表達(dá)對(duì)酵母菌具有毒害作用，反而導(dǎo)致最終表達(dá)量的降低。低拷貝數(shù)的YEp質(zhì)粒，甚至YIp能穩(wěn)定地獲得較高外源蛋白表達(dá)量。 質(zhì)粒載體的不穩(wěn)定性也是影響外源蛋白表達(dá)的限制因素，因此在商業(yè)生產(chǎn)中必須使用具有很高穩(wěn)定性能的質(zhì)粒載體。,4.2 啟動(dòng)子序列 大腸桿菌啟動(dòng)子與酵母啟動(dòng)子的比較： 序列：E. coli: TATAAT Yeast：TATATAA 啟動(dòng)子與轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)的距離： E. coli: 10 bps Yeast：40120 bps 酵母菌啟動(dòng)子的上游存在一個(gè)上游激活序列（UAS）， 一般距轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)1001000 bps，因此一般酵母菌表 達(dá)載體具有很長(zhǎng)的“啟動(dòng)子序列”，通常達(dá)到1 kb。 一般使用可調(diào)控的啟動(dòng)子，可以增加外源蛋白的表達(dá)量。,酵母菌中幾種適用的可調(diào)控啟動(dòng)子： gal1、gal7和gal10等基因的啟動(dòng)子：受葡萄糖阻遏， 而受半乳糖誘導(dǎo)；另一正調(diào)控物為gal4的表達(dá)產(chǎn)物 GAL4； ADH2（乙醇脫氫酶）啟動(dòng)子：受乙醇和葡萄糖調(diào)節(jié)； PHO5（酸性磷酸酶）啟動(dòng)子：由磷酸鹽調(diào)節(jié)； CUP1（Cu2+結(jié)合蛋白）啟動(dòng)子：Cu2+水平調(diào)節(jié)； 溫度調(diào)控啟動(dòng)子：升溫誘導(dǎo),4.3 轉(zhuǎn)錄終止子和mRNA的聚腺苷?；?在高等動(dòng)物中，轉(zhuǎn)錄終止子一般出現(xiàn)在編碼序列下游很遠(yuǎn)處（幾百bp），然后再進(jìn)行聚腺苷酰化作用，而在酵母菌中，聚腺苷?；饔猛l(fā)生在緊靠轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的3端。其終止子序列的精確結(jié)構(gòu)往往還不很清楚。 在構(gòu)建酵母菌表達(dá)載體時(shí)，往往需要從已了解的酵母基因轉(zhuǎn)錄終止的下游序列中克隆一大段終止序列片斷，將其放到需要表達(dá)的基因編碼序列的下游。 4.4 mRNA的穩(wěn)定性 在需要表達(dá)的外源基因編碼序列的下游有必要克隆一個(gè)有效的酵母終止序列，才能增加mRNA的穩(wěn)定性。,4.5 起始密碼子AUG的識(shí)別 除了高效轉(zhuǎn)錄外，高效翻譯也是決定外源蛋白表達(dá)量的影響因素。起始密碼AUG必須容易被起始因子和核糖體準(zhǔn)確識(shí)別，而起始密碼附近序列決定翻譯啟動(dòng)的效率。一般在緊靠AUG密碼前2040個(gè)堿基中G出現(xiàn)的頻率很低（大約5），而如果G在這個(gè)區(qū)域大量出現(xiàn)，就會(huì)抑制翻譯的啟動(dòng)。 4.6 酵母菌密碼子的偏愛(ài)性 在酵母菌中表達(dá)的外源基因可能攜帶有酵母菌很少使用的密碼子，這樣就會(huì)減緩翻譯過(guò)程，若這些密碼子成串排列，則對(duì)翻譯特別有害。 解決辦法：使用酵母菌偏愛(ài)密碼子，可以通過(guò)分析哪些連續(xù)高水平表達(dá)內(nèi)源基因所采用的密碼加以確定。,4.7 外源蛋白的折疊 許多外源基因在酵母菌中得到高水平表達(dá)，并能進(jìn)行正確折疊，而在細(xì)菌中往往形成包含體（Inclusion body）。 原因： 細(xì)菌細(xì)胞為一個(gè)還原環(huán)境，不能形成二硫鍵； 酵母細(xì)胞內(nèi)存在多種分子伴侶。 4.8 蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性 在酵母菌中表達(dá)單一外源蛋白也會(huì)受到酵母菌蛋白酶的降解，尤其是N端裸露的單一蛋白。 解決辦法：改變N末端的序列，或者和內(nèi)源蛋白構(gòu)建融合蛋白，這樣在后處理中再設(shè)法去除非必需的融合成分。,4.9 外源蛋白的糖基化作用 通過(guò)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)-高爾基體分泌的動(dòng)物蛋白一般都會(huì)在分泌過(guò)程中發(fā)生糖基化作用，這一過(guò)程可能有助于蛋白質(zhì)的正確折疊，增強(qiáng)它們對(duì)于蛋白酶的抗性。 但是，在酵母菌中發(fā)生的糖基化只會(huì)添加富含甘露糖的寡糖，而不會(huì)形成象在高等動(dòng)物細(xì)胞中普遍存在的那種糖蛋白復(fù)合物，這種糖基化作用有時(shí)會(huì)影響到蛋白質(zhì)的折疊和對(duì)蛋白酶的敏感性，更重要的是會(huì)影響蛋白質(zhì)在生物體內(nèi)的半衰期。 另外，在酵母菌中表達(dá)的外源蛋白也可能發(fā)生超糖基化，即每個(gè)N-寡糖鏈上都含有100個(gè)以上的甘露糖，而正常的高甘露糖寡糖鏈僅含有813個(gè)甘露糖。過(guò)多的甘露糖可能會(huì)影響蛋白質(zhì)的生物活性及其免疫原性。,5、酵母中外源基因表達(dá)及產(chǎn)物分泌 5.1 乙肝病毒表面抗原（HBsAg）在巴斯德畢赤酵母（Pichia pastoris）中的表達(dá) 構(gòu)建過(guò)程（Merck）： （1）將HBsAg編碼基因克隆到乙醇氧化酶基因（aox1）啟動(dòng)子的下游；下游加上該基因的終止子和加poly(A)信號(hào)； （2）加入可在巴斯德畢赤酵母中復(fù)制的復(fù)制子、大腸桿菌pBR322的復(fù)制子、大腸桿菌的選擇標(biāo)記、一段幫助該質(zhì)粒整合到特定染色體位點(diǎn)的序列（3-aox1）以及His合成過(guò)程中所需的His脫氫酶基因（his4）。 （3）受體菌采用His脫氫酶缺陷型（His4-），經(jīng)過(guò)雙交換后，染色體上的aox1丟失，而整合入aox1啟動(dòng)子-HBsAg-aox1終止子及加poly(A)信號(hào)序列、his4和3-aox1。