克隆基因表達(dá)及基因干擾-修.ppt

克隆基因的表達(dá)及基因干擾,北京協(xié)和醫(yī)院檢驗(yàn)科 吳潔,1,克隆基因的表達(dá)及基因干擾,第一節(jié) 外源基因的表達(dá),第二節(jié) 表達(dá)產(chǎn)物的分離、純化與鑒定,第三節(jié) 基因表達(dá)干擾技術(shù),2,克隆基因的表達(dá)及基因干擾,第一節(jié) 外源基因的表達(dá),第二節(jié) 表達(dá)產(chǎn)物的分離、純化與鑒定,第三節(jié) 基因表達(dá)干擾技術(shù),3,第一節(jié) 外源基因的表達(dá),遺傳信息從DNA到蛋白質(zhì)的傳遞過程中心法則（central dogma）。,基因表達(dá),4,外源基因在宿主細(xì)胞中表達(dá)。,外源基因,表達(dá)載體,重組載體,導(dǎo)入宿主細(xì)胞,在宿主細(xì)胞中 表達(dá)出蛋白質(zhì),提取蛋白,宿主細(xì)胞：,原核細(xì)胞或真核細(xì)胞。,第一節(jié) 外源基因的表達(dá),克隆基因表達(dá),5,第一節(jié) 外源基因的表達(dá),一、原核生物表達(dá)體系 二、真核生物表達(dá)體系 酵母，哺乳動(dòng)物細(xì)胞,大腸桿菌,6,一、原核生物表達(dá)體系,（二）原核表達(dá)載體具有的特點(diǎn),（四）包涵體,（一）對(duì)外源目的基因的要求,（三）真核生物基因在原核細(xì)胞中的表達(dá),7,（一）對(duì)外源目的基因的要求 1、不應(yīng)具有5端非編碼區(qū)以及內(nèi)含子結(jié)構(gòu) 2、不能直接用真核基因組DNA. 3、常以cDNA為模板，設(shè)計(jì)引物，PCR擴(kuò)增目的基因.,一、原核生物表達(dá)體系,8,選擇標(biāo)志 啟動(dòng)子 ：乳糖啟動(dòng)子lac，色氨酸啟動(dòng)子trp等 翻譯調(diào)控序列，如核糖體結(jié)合位點(diǎn)(SD序列)，及 翻譯起始點(diǎn)和終止序列 多克隆位點(diǎn)(MCS),（二）原核表達(dá)載體具有的特點(diǎn),一、原核生物表達(dá)體系,9,原核啟動(dòng)子,大腸桿菌的所有啟動(dòng)子中都有兩段一致序列： -35box 和 -10box（Pribnow box）,TTGACA,10,consensus sequences,11,核糖體結(jié)合位點(diǎn)（ribosome binding site, RBS）,Shine-Dalgarno（SD） sequence：,mRNA上與核糖體16sRNA結(jié)合的序列。,SD,mRNA 5AGGAGGUAUG,16S rRNA3,UCCUCCA,S-D序列距離AUG的距離也影響翻譯,12,（三）真核生物基因在原核細(xì)胞中的表達(dá),1.非融合型表達(dá)蛋白,2.融合型表達(dá)蛋白,3.分泌型表達(dá)蛋白,一、原核生物表達(dá)體系,13,1.非融合型表達(dá)蛋白 載體表達(dá)出的外源基因蛋白質(zhì)不與細(xì)菌的任何蛋白 質(zhì)融合在一起。 優(yōu)點(diǎn)：表達(dá)的非融合蛋白與天然狀態(tài)下存在的蛋 白在結(jié)構(gòu)、功能以及免疫原等方面基本一致 缺點(diǎn)：易被細(xì)菌蛋白酶破壞,（三）真核生物基因在原核細(xì)胞中的表達(dá),一、原核生物表達(dá)體系,SD序列,ATG-外源基因-TAG,14,常用的非融合型表達(dá)蛋白原核表達(dá)載體pKK223-3 抗氨芐青霉素基因 tac啟動(dòng)子(trp-lac) SD序列 AUG起始密碼 轉(zhuǎn)錄終止序列T1和T2,一、原核生物表達(dá)體系,15,2.融合型表達(dá)蛋白 表達(dá)出的外源基因產(chǎn)物蛋白是與質(zhì)粒載體上的菌體蛋白連接在一起的。 優(yōu)點(diǎn)： 具有抗原性可作為抗原，可以抵御細(xì)菌蛋白酶的破壞。 便于融合蛋白的分離和純化。,一、原核生物表達(dá)體系,16,融合型表達(dá)系統(tǒng)主要有 GST系統(tǒng) His系統(tǒng) 金黃色葡萄球菌蛋白A系統(tǒng) -半乳糖苷酶系統(tǒng) 麥芽糖結(jié)合蛋白系統(tǒng),一、原核生物表達(dá)體系,17,啟動(dòng)子：tac 操縱基因：lacP 調(diào)節(jié)基因：lacI S-D序列 ori：pBR322 ori 融合肽：GST(谷胱甘肽巰基轉(zhuǎn)移酶）,GST系統(tǒng)-pGEX系列,1、載體組成結(jié)構(gòu):,lacI,tac,lac O,S-D/ATG,GST,插入位點(diǎn),TGA,lacP,18,GST融合蛋白用Glutathione Sepharose親和層析柱分離純化。,GST系統(tǒng)-pGEX系列,2、產(chǎn)物提純:,3、產(chǎn)物分離:,用凝血酶或Xa因子可以把外源蛋白從GST上切下來。,19,His-tag（組氨酸標(biāo)簽）：,在外源多肽的N端或C端接上6個(gè)組氨酸（6His）,His-tag能與Ni2+柱結(jié)合，但很容易被咪唑（或EDTA溶液）洗脫下來，可以純化蛋白質(zhì)。,His系統(tǒng),20,21,3.分泌型表達(dá)蛋白 載體表達(dá)出的外源蛋白質(zhì)與細(xì)菌的分泌信號(hào)肽連在一起，可被宿主菌分泌到細(xì)胞外。,一、原核生物表達(dá)體系,pIN III系列載體,pIN III-comA1, pIN III-comA2, pIN III-comA3,Ipp,lac P,lac O,S-D/ATG,ompa,插入位點(diǎn),22,（四）包涵體 (inclusion body),一、原核生物表達(dá)體系,大腸桿菌高效表達(dá)外源基因時(shí)形成的膜包裹的高密度、不溶性和無活性的蛋白質(zhì)顆粒。,23,（四）包涵體 (inclusion body),1.包涵體的形成 2.包涵體的分離與純化 3.包涵體的復(fù)性,一、原核生物表達(dá)體系,24,1.包涵體的形成,表達(dá)產(chǎn)率過高，超出細(xì)菌蛋白水解能力，產(chǎn)物積聚，與目的蛋白中含硫氨基酸含量呈正相關(guān)。 原核表達(dá)體系缺乏翻譯后修飾酶類和輔助因子，中間產(chǎn)物易大量積聚。 發(fā)酵溫度高或胞內(nèi)pH接近蛋白的等電點(diǎn),25,有利于目標(biāo)蛋白的富集，使重組蛋白易于分離、免受蛋白酶降解、不損害寄主細(xì)胞,以包涵體形式表達(dá)的重組蛋白喪失了原有的生物活性，必須通過有效的變性、復(fù)性操作才能回收得到具有正確空間構(gòu)象的目標(biāo)蛋白。, 缺點(diǎn), 優(yōu)點(diǎn),26,2.包涵體的分離與純化,超聲破碎菌體,離心,包涵體,溶解包涵體,強(qiáng)蛋白質(zhì)變性劑： 鹽酸胍、尿素（5-8mmol/L）,3.包涵體的復(fù)性,逐步降低變性劑濃度，使表達(dá)蛋白恢復(fù)其天然構(gòu)型,27,（一）酵母表達(dá)體系,（二）哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)體系,二、真核生物表達(dá)體系,真核或病毒啟動(dòng)子,MCS,PolyA信號(hào),終止子,外源基因,28,（一）酵母表達(dá)體系,1.酵母表達(dá)載體,2.酵母表達(dá)外源性基因的形式,二、真核生物表達(dá)體系,Dividing Saccharomyces cerevisiae (bakers yeast) cells,29,1、酵母表達(dá)載體 選擇性標(biāo)志 大腸桿菌： Ampr、Tetr 酵母： Leu2+、His+、Ura3+、Trp1+; 復(fù)制子 啟動(dòng)子 上游活性序列 轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)上游，可促進(jìn)轉(zhuǎn)錄 終止序列 蛋白結(jié)構(gòu)域 如：信號(hào)肽序列、核定位序列,二、真核生物表達(dá)體系,（一）酵母表達(dá)體系,30,2.酵母表達(dá)外源性基因的形式 非分泌型 分泌型,二、真核生物表達(dá)體系,分泌信號(hào)序列,31,Leu- 酵母,原生質(zhì)體,感受態(tài),酶去壁,CaCl2、 PEG,整合到染色體上或 獨(dú)立在酵母細(xì)胞內(nèi),轉(zhuǎn)化,Leu營養(yǎng)缺陷型培養(yǎng)基篩選,轉(zhuǎn)化子克隆生長,酵母載體,大腸桿菌,提取,插入外源基因,鑒定克隆,發(fā)酵表達(dá),外源基因產(chǎn)物,分離、 純化,酵母轉(zhuǎn)化和表達(dá)的一般過程,32,（二）哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)體系,1.哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)載體,2.常用的外源基因轉(zhuǎn)染哺乳動(dòng)物細(xì)胞的方式,3.哺乳動(dòng)物細(xì)胞的瞬時(shí)表達(dá)和穩(wěn)定表達(dá)系統(tǒng),二、真核生物表達(dá)體系,33,（二）哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)體系,1.哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)載體 (1)原核DNA序列 (2)啟動(dòng)子 (3)增強(qiáng)子 (4)剪接信號(hào) (5)遺傳標(biāo)記 (6)終止信號(hào)和多聚腺苷化的信號(hào),二、真核生物表達(dá)體系,34,2.常用的外源基因轉(zhuǎn)染哺乳動(dòng)物細(xì)胞的方式,二、真核生物表達(dá)體系,35,3.哺乳動(dòng)物細(xì)胞的瞬時(shí)表達(dá) 和穩(wěn)定表達(dá)系統(tǒng) （1）COS細(xì)胞瞬時(shí)表達(dá)系統(tǒng) （2）CHO細(xì)胞穩(wěn)定表達(dá)系統(tǒng),二、真核生物表達(dá)體系,36,用復(fù)制起點(diǎn)有缺陷的SV40病毒侵染的猴細(xì)胞株CV-1得到的。所以稱COS（CV-1，Origin, SV40）,COS細(xì)胞,37,利用COS細(xì)胞表達(dá)外源基因,38,克隆基因的表達(dá)及基因干擾,第一節(jié) 外源基因的表達(dá),第二節(jié) 表達(dá)產(chǎn)物的分離、純化與鑒定,第三節(jié) 基因表達(dá)干擾技術(shù),39,第二節(jié) 表達(dá)產(chǎn)物的分離、純化與鑒定,二、酵母重組表達(dá)蛋白的分離與純化,三、表達(dá)產(chǎn)物的鑒定,一、大腸桿菌重組表達(dá)蛋白的分離與純化,40,一、大腸桿菌重組表達(dá)蛋白的分離與純化,1.粗制品的分離純化,2.精制品的分離純化,離心收集菌體,超聲波破碎,離心收集上清,熱處理變性,離心,上清用硫酸銨沉淀,凝膠層析、離子交換層析,41,二、酵母重組表達(dá)蛋白的分離與純化,1.酵母細(xì)胞內(nèi)表達(dá)的重組蛋白質(zhì)的分離純化 以-蛋白酶抑制劑的純化為例：,2.酵母表達(dá)分泌型重組蛋白的分離與純化 以酵母表達(dá)干擾素純化為例：,收集酵母細(xì)胞,玻璃珠破碎,離心取上清,DEAE Sepharose柱層析,梯度洗脫,收集活性部分,濃縮,葡聚糖凝膠G75柱層析,收集、濃縮,SDS-PAGE 純度鑒定,發(fā)酵液用0.45m孔徑濾膜過濾濃縮,DEAE-Trisacryl柱層析,梯度洗脫,收集干擾素部分,葡聚糖凝膠G75柱層析,洗脫,收集干 擾素,稀釋,層析聚焦緩沖液洗脫,電泳鑒定,42,三、表達(dá)產(chǎn)物的鑒定,Western印跡（Western blotting） 1.蛋白質(zhì)樣品的制備 2.SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳 (SDS-PAGE) 3.蛋白質(zhì)的電轉(zhuǎn)移(膠 膜),43,三、表達(dá)產(chǎn)物的鑒定,44,三、表達(dá)產(chǎn)物的鑒定,4.靶蛋白的免疫學(xué)檢測 封閉 脫脂奶粉或BSA 靶蛋白與第一抗體反應(yīng) 與第二抗體反應(yīng) HRP標(biāo)記 顯色,45,三、表達(dá)產(chǎn)物的鑒定,46,第七章 克隆基因的表達(dá)及基因干擾,第一節(jié) 外源基因的表達(dá),第二節(jié) 表達(dá)產(chǎn)物的分離、純化與鑒定,第三節(jié) 基因表達(dá)干擾技術(shù),47,第三節(jié) 基因表達(dá)干擾技術(shù),二、核酶與脫氧核酶,三、小干擾RNA( small interference RNA, siRNA),四、微RNA( microRNA),一、反義核酸技術(shù),48,一、反義核酸技術(shù),（二）反義RNA技術(shù),（三）反義核酸技術(shù)的應(yīng)用,（一）反義寡核苷酸技術(shù)（反義DNA技術(shù)）,49,（一）反義寡核苷酸技術(shù),1.反義寡核苷酸的作用機(jī)制,2.反義寡核苷酸的設(shè)計(jì)與合成,3.反義寡核苷酸的修飾,4.反義寡核苷酸的給藥途徑,一、反義核酸技術(shù),50,（一）反義寡核苷酸技術(shù) 1.反義寡核苷酸的作用機(jī)制 (1) 抑制mRNA的翻譯 (2) 抑制復(fù)制或轉(zhuǎn)錄 (3) 抑制蛋白質(zhì)的加工、修飾及功能表達(dá),一、反義核酸技術(shù),51,2、反義寡核苷酸的設(shè)計(jì)與合成 1）設(shè)計(jì) 計(jì)算機(jī)軟件預(yù)測RNA的二級(jí)結(jié)構(gòu) 利用寡核苷酸隨機(jī)文庫鑒別mRNA上的RNaseH切割位點(diǎn)、寡核苷酸芯片的掃描分析、隨機(jī)寡核苷酸庫結(jié)合逆轉(zhuǎn)錄分析法等對(duì)自然折疊的mRNA進(jìn)行設(shè)計(jì),一、反義核酸技術(shù),52,2）合成 長度一般為1525個(gè)核苷酸 G-C含量為60%65%,一、反義核酸技術(shù),53,3.反義寡核苷酸的修飾 最常見的是對(duì)ASON的骨架中的磷酸基團(tuán)進(jìn)行修飾 （1）硫原子代替磷酸二酯中的氧原子 （2）甲基修飾磷酸骨架 （3）聚酰胺鍵代替磷酸骨架,一、反義核酸技術(shù),54,4.反義寡核苷酸的給藥途徑 （1）直接作用于培養(yǎng)細(xì)胞 （2）結(jié)合L-多聚賴氨酸或脂質(zhì)體進(jìn)入細(xì)胞 （3）動(dòng)物模型則可通過靜脈、腹腔、皮下、肌肉、瘤體內(nèi)注射或氣霧吸入等途徑,一、反義核酸技術(shù),55,（二）反義RNA技術(shù),1.反義RNA的作用機(jī)制,2.反義RNA的設(shè)計(jì),一、反義核酸技術(shù),56,（二）反義RNA技術(shù),1.反義RNA的作用機(jī)制 (1) 與引物RNA前體互補(bǔ)結(jié)合，抑制DNA復(fù)制 (2) 阻止目的mRNA的成熟及向胞漿內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn) (3) 抑制mRNA翻譯 (4) 使mRNA更易被核酸酶識(shí)別而降解,一、反義核酸技術(shù),57,2.反義RNA的設(shè)計(jì) 與ASON相比，反義RNA的設(shè)計(jì)較為簡單,一、反義核酸技術(shù),58,（三）反義核酸技術(shù)的應(yīng)用,需要完善或解決的問題： 防止被核酸酶降解 需要進(jìn)一步了解寡核苷酸進(jìn)入細(xì)胞的確切機(jī)制 很多寡核苷酸易發(fā)生序列特異性和非序列特異性的結(jié)合 ASON是否會(huì)影響正常細(xì)胞的基因表達(dá) 用載體導(dǎo)入反義RNA在體內(nèi)表達(dá)時(shí)，存在安全性和轉(zhuǎn)染效率不高等問題,一、反義核酸技術(shù),59,二、核酶與脫氧核酶,（一）核酶：能夠催化RNA剪接的由RNA組成的酶。Cech與Altman分享了1989年諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)。,（二）脫氧核酶：1994年Breaker發(fā)現(xiàn)具有催化功能的DNA分子。,60,（一）核酶,1.核酶的分類,2.核酶的結(jié)構(gòu),3.核酶的設(shè)計(jì)與修飾 4.核酶轉(zhuǎn)移方法 5.核酶的應(yīng)用,二、核酶與脫氧核酶,61,（一）核酶 1.核酶的分類 （1）大分子核酶： 第類內(nèi)含子、第類內(nèi)含子、核糖核酸酶P （2）小分子核酶 ： 錘頭狀RNA、發(fā)夾形RNA、肝炎D病毒RNA和 neurospora Varkud satellite核酶,二、核酶與脫氧核酶,62,2.核酶的結(jié)構(gòu) （1）錘頭狀核酶： 二級(jí)結(jié)構(gòu)有三個(gè) 螺旋環(huán)結(jié)構(gòu)區(qū)和 一個(gè)催化中心,二、核酶與脫氧核酶,H：除G以外的任一核苷酸,不可逆的自切割反應(yīng),63,（2）發(fā)夾形核酶： 二級(jí)結(jié)構(gòu)分成兩個(gè)結(jié)構(gòu)域，每個(gè)結(jié)構(gòu)域由 螺旋-環(huán)-螺旋組成,二、核酶與脫氧核酶,可逆的自切割反應(yīng),BNGUC,B：除A以外的任一核苷酸 N：任意核苷酸,64,二、核酶與脫氧核酶,3.核酶的設(shè)計(jì)與修飾,設(shè)計(jì) 三要素：高效、特異、穩(wěn)定 兩方面：核酶核心與結(jié)合臂的設(shè)計(jì) 在底物RNA中選擇最佳剪切位點(diǎn) 化學(xué)修飾 主要是對(duì)核酶的磷酸二酯骨架的修飾、戊糖環(huán) 的修飾和堿基的修飾。,65,二、核酶與脫氧核酶,外源性轉(zhuǎn)移 物理方法：裸露DNA直接注射、電脈沖介導(dǎo)、 顯微注射微粒轟擊等。 化學(xué)方法：磷酸鈣共沉淀、DEAE-葡聚糖、 脂質(zhì)體等。 內(nèi)源性轉(zhuǎn)移 病毒載體（逆轉(zhuǎn)錄病毒或腺病毒載體）,4.核酶轉(zhuǎn)移方法,66,二、核酶與脫氧核酶,5.核酶的應(yīng)用,已利用組合篩選法得到抑制乙肝病毒復(fù)制的發(fā)夾核酶、抑制丙肝病毒復(fù)制的錘頭核酶、能在體外抑制艾滋病毒復(fù)制的核酶。,為將核酶作為基因工程藥物的開發(fā)奠定了基礎(chǔ)。,67,（二）脫氧核酶,1.脫氧核酶的結(jié)構(gòu)種類及特征,2.脫氧核酶的催化特性,3.設(shè)計(jì)合成脫氧核酶的原則,4.脫氧核酶的應(yīng)用,二、核酶與脫氧核酶,68,（二）脫氧核酶 1.脫氧核酶的結(jié)構(gòu)種類及特征 （1）10-23型脫氧核酶：,二、核酶與脫氧核酶,嘌呤-嘧啶連接處,69,（2）8-17型脫氧核酶：,二、核酶與脫氧核酶,70,2.脫氧核酶的催化特性 （1）RNA切割活性 （2）DNA連接酶活性 （3）卟啉金屬化酶和過氧化酶活性 （4）DNA切割活性 （5）N-糖基化酶活性 （6）DNA激酶活性 （7）DNA戴帽活性,二、核酶與脫氧核酶,71,3.設(shè)計(jì)合成脫氧核酶的原則 （1）總核苷酸數(shù)不超過50 （2）催化效率不低于核酶 （3）具有廣泛的RNA切割功能 （4）能通過堿基配對(duì)與底物結(jié)合 （5）具有可重復(fù)性,二、核酶與脫氧核酶,72,4.脫氧核酶的應(yīng)用 為治療RNA病毒感染的疾病提供了一條新途徑,二、核酶與脫氧核酶,73,三、小干擾RNA(siRNA),（二）RNAi的作用機(jī)制,（三）siRNA的設(shè)計(jì)原則,（四）siRNA的制備方法,（六）RNAi沉默效果的檢測,（一）一般研究路線,（七）RNAi的應(yīng)用,（五）siRNA的導(dǎo)入,74,（一）一般研究路線,三、小干擾RNA,75,（二）RNAi的作用機(jī)制 1.起始階段 2.效應(yīng)階段 3.倍增階段,三、小干擾RNA,76,三、小干擾RNA,77,（三）siRNA的設(shè)計(jì)原則 1.siRNA中G+C堿基含量 30% -70%，50%沉默效應(yīng)較高。 2.siRNA作用位點(diǎn) 避免起始密碼下游50-100堿基處、終止密碼上游100bp處及5端非編碼區(qū)。 3.siRNA序列 避免連續(xù)4個(gè)以上A及3個(gè)G/C，須經(jīng)BLAST(hppt://BLAST)比對(duì)。,三、小干擾RNA,78,（三）siRNA的設(shè)計(jì)原則 4.siRNA堿基數(shù) 選擇以A或G開始的21-23bp的目的mRNA。 5.環(huán)堿基數(shù) 一般為9個(gè)堿基，TTCAAGAGA 6.對(duì)照系統(tǒng) 將已設(shè)計(jì)siRNA堿基序列隨機(jī)排列，且與其他基因無同源性。,三、小干擾RNA,79,（四）siRNA的制備方法 1.化學(xué)合成法 2.體外轉(zhuǎn)錄法 3.RNase 消化法 4.siRNA表達(dá)載體法 5.siRNA表達(dá)框架法,三、小干擾RNA,80,三、小干擾RNA,81,小發(fā)夾RNA(Small hairpin RNA, shRNA),siRNA的合成方式及特點(diǎn),三、小干擾RNA,（五）siRNA的導(dǎo)入 1.脂質(zhì)體或電穿孔 2.病毒攜帶 3.細(xì)胞穿透肽,三、小干擾RNA,83,（六）RNAi沉默效果的檢測 mRNA水平 RT-PCR、realtime RT-PCR、 Northern blotting 蛋白質(zhì)水平 Western blotting、ELISA、 免疫熒光、流式細(xì)胞,三、小干擾RNA,84,Kumar PP et al NCB, 2007,RT-PCR,85,stable 14-fold CD8 knockdown by lentivirus siRNAs,Rubinson et al Nature Genetics, 2003,Western blotting,86,（七）RNAi的應(yīng)用 1.基因功能的研究 2.基因剔除 3.基因治療 4.細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)途徑分析 5.藥物開發(fā),三、