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姜黃素對(duì)Hepa1-6肝癌細(xì)胞凋亡及ROS影響杜琴,鄧珊,沈克平,胡兵(上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬龍華醫(yī)院腫瘤科,中醫(yī)腫瘤研究所,上海20032)摘要目的:觀察姜黃素對(duì)小鼠肝癌Hepa1-6細(xì)胞凋亡及活性氧(Reactiveoxygenspecies,ROS)水平的影響。方法:不同濃度姜黃素處理Hepa1-6肝癌細(xì)胞,MTT比色法檢測(cè)細(xì)胞增殖,Hoechst33258染色檢測(cè)細(xì)胞凋亡形態(tài)變化,流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡,WesternBlot法檢測(cè)活化型caspase-3,2-7-二氯氫化熒光素乙二脂(DCFH-DA)染色法結(jié)合熒光酶標(biāo)儀檢測(cè)姜黃素對(duì)胞內(nèi)ROS產(chǎn)生的影響。結(jié)果:240mol/L姜黃素作用24h、48h均可抑制肝癌Hepa1-6細(xì)胞增殖,并呈現(xiàn)一定的時(shí)間與劑量依賴性。520mol/L姜黃素作用48h后Hepa1-6細(xì)胞呈現(xiàn)凋亡形態(tài)變化,細(xì)胞凋亡率呈一定程度劑量依賴性,同時(shí)可檢測(cè)到活化型caspase-3、以及ROS產(chǎn)生。結(jié)論:姜黃素可以抑制Hepa1-6細(xì)胞增殖,促使Hepa1-6細(xì)胞凋亡,可能與活化caspase-3及提高細(xì)胞內(nèi)ROS水平相關(guān)。關(guān)鍵詞肝癌;姜黃素;細(xì)胞凋亡;caspase-3;ROSEffectsofCurcuminonROSproductionandapoptosisinMurineHepatocarcinomaHepa1-6CellsDuQin,DengShan,ShenKeping,HuBing(DepartmentofOncologyandInstituteofTraditionalChineseMedicineinOncology,LonghuaHospital,ShanghaiUniversityofTraditionalChineseMedicine,Shanghai,20032)Objective:Toobservetheeffectsofcurcuminonapoptosisandreactiveoxygenspecies(ROS)productioninmurinehepatocarcinomaHepa1-6cellsinvitro.Methods:Hepa1-6cellsweretreatedwithdifferentdoseofcurcumin.CellproliferationwasdetectedwithMTTassay.Apoptoticmorphologywasvisualizedbyhoechst33258staining.Cellapoptosiswasdetectedbyflowcytometryanalysis.Caspase-3wasdetectedbywesternblot.IntracellularROSproductionwasdetectedby2,7-dichlorofluorescindiacetate(DCFH-DA)staining.Results:Comparedwiththecontrols,upontreatmentwith240mol/Lofcurcuminfor24hto48h,Hepa1-6cellsproliferationwassignificantlyinhibitedinatimeanddosedependentmanner.520mol/LofcurcuminalsoinducedapoptosisandapoptoticmorphologychangeinHepa1-6cells.Aftertreatmentwith520mol/Lcurcumin,caspase-3wasactivatedaccompaniedbygenerationofROS.Conclusion:Curcuminmayinhibitcellproliferation,induceapoptosisinmurinehepatocarcinomaHepa1-6cells,andmayinvolvementofcaspase-3activationandROSproduction.KeyWordsHepatocarcinoma;Curcumin;Apoptosis;Caspases-3;Reactiveoxygenspecies姜黃素(Curcumin)是從姜科植物姜黃、郁金等根莖中提取的一種有效組分,具有抗炎、抗突變及抗腫瘤等作用1,已證實(shí)姜黃素可抑制乳腺癌、肺癌及胃腸道腫瘤等多種腫瘤細(xì)胞基金資助:上海市基礎(chǔ)研究重點(diǎn)項(xiàng)目(09JC1413600);龍華醫(yī)院國(guó)家中醫(yī)臨床研究基地“龍醫(yī)團(tuán)隊(duì)、龍醫(yī)學(xué)者”項(xiàng)目(LYTD-04)。通訊作者:胡兵(1971-),男,博士,副研究員,碩士生導(dǎo)師。研究方向:腫瘤生物學(xué)、功能基因組與抗癌中藥作用及配伍E-mail:生長(zhǎng)24,本研究在Hepa1-6細(xì)胞模型中觀察了姜黃素對(duì)肝癌細(xì)胞的作用及可能機(jī)制。1材料與方法1.1試驗(yàn)用藥姜黃素(Curcumin)購(gòu)于sigma(Cat.C7727-100MG,純度94%),用二甲基亞砜(DMSO)溶解配制成10mmol/L儲(chǔ)備液,0.22m濾器過(guò)濾除菌,-20保存?zhèn)溆?。?shí)驗(yàn)前用DMEM稀釋成工作液,DMSO終濃度0.1%。1.2細(xì)胞株小鼠肝癌Hepa1-6細(xì)胞購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù)。培養(yǎng)于含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基(含青、鏈霉素各100U/ml)中,37,5%CO2飽和濕度環(huán)境的條件下連續(xù)培養(yǎng)。1.3試劑MTT(美國(guó)Amresco產(chǎn)品),DMEM高糖培養(yǎng)基(ThermoFisher產(chǎn)品),胎牛血清(SAFCBiosciences公司),caspase-3、-Tubulin抗體(CellSignalingTechnology公司),AnnexinV-FITC凋亡檢測(cè)試劑盒(Invitrogen公司),細(xì)胞凋亡熒光Hoechst33258檢測(cè)試劑盒(南京凱基生物),活性氧檢測(cè)試劑盒(江蘇碧云天生物技術(shù)研究所),其他試劑均為分析純。1.4儀器細(xì)胞培養(yǎng)箱(美國(guó)NAPCO-5410型),酶標(biāo)儀(美國(guó)ThermoVarioskan),倒置顯微鏡(日本NikonDXM1200),流式細(xì)胞儀(美國(guó)BDcalibur公司),電泳和轉(zhuǎn)膜裝置(美國(guó)BIO-RAD公司),Odyssey雙色紅外熒光成像系統(tǒng)掃描儀(美國(guó)LI-COR)。1.5方法1.5.1細(xì)胞增殖檢測(cè)取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期Hepa1-6細(xì)胞,常規(guī)胰酶消化、計(jì)數(shù),按3103/100L/孔接種于96孔板中,過(guò)夜貼壁后實(shí)驗(yàn)組加入不同濃度姜黃素(2mol/L、5mol/L、10mol/L、20mol/L、40mol/L),對(duì)照組加入等體積DMSO,空白組不做處理。每組3個(gè)復(fù)孔;分別繼續(xù)培養(yǎng)24h、48h每孔加入新鮮配制的濃度為5mg/mL的MTT溶液20l,繼續(xù)培養(yǎng)4h后棄培養(yǎng)基,每孔加DMSO150l,輕輕振蕩10min,用酶標(biāo)儀于490nm處檢測(cè)各孔光密度值(opticaldensity,OD)值,按公式計(jì)算細(xì)胞存活率:存活率=(實(shí)驗(yàn)組OD值-空白組OD值)/(對(duì)照組OD值-空白組OD值)100%。細(xì)胞實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。1.5.2細(xì)胞凋亡形態(tài)觀察常規(guī)消化、接種Hepa1-6細(xì)胞于24孔板,貼壁24小時(shí)后加入終濃度5mol/L、10mol/L、20mol/L姜黃素干預(yù)Hepa1-6細(xì)胞,對(duì)照組加入等體積DMSO,48h后棄培養(yǎng)基,PBS洗滌2次,加入4%甲醛溶液,4固定10min,PBS洗滌2次,滴加Hoechst33258熒光染色液100L,室溫染色10min,熒光顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)并隨機(jī)拍照。1.5.3流式細(xì)胞儀檢測(cè)收集終濃度5mol/L、10mol/L、20mol/L姜黃素作用后細(xì)胞,PBS洗滌三次,調(diào)細(xì)胞濃度3105/ml,4,1500rpm,離心5min,加入100L結(jié)合緩沖液重懸細(xì)胞,加入0.5LAnnexinV-FITC混勻后,加入5LPI混勻,室溫、避光、反應(yīng)10min,上機(jī),流式細(xì)胞儀檢測(cè)各組細(xì)胞凋亡率。1.5.4ROS活性檢測(cè)終濃度為5mol/L、10mol/L、20mol/L姜黃素作用Hepa1-6細(xì)胞48h后,更換含DCF-DA10mol/L無(wú)血清DMEM培養(yǎng)液,37孵育20min后,棄培養(yǎng)液,無(wú)血清DMEM培養(yǎng)液洗滌3次,鏡下觀察;同時(shí)收獲細(xì)胞,調(diào)整細(xì)胞濃度2106/mL,黑色96孔板每孔100L細(xì)胞懸液,每組設(shè)3復(fù)孔,熒光酶標(biāo)儀測(cè)DCFOD值,488nm激發(fā)波長(zhǎng),525nm發(fā)射波。1.5.5Westernblot收集藥物作用后Hepa1-6細(xì)胞,常規(guī)裂解,離心去除DNA,加入蛋白質(zhì)上樣緩沖液100變性15min,用10%的SDS聚丙烯酰胺凝膠中電泳,濕轉(zhuǎn)法將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移至硝酸纖維膜,5%脫脂奶粉封閉1h后,加入Caspase-3或-Tubulin抗體4孵育過(guò)夜,PBST洗膜后與熒光標(biāo)記二抗(1:2500)37孵育1h,PBST反復(fù)洗滌34次后Odyssey雙色紅外熒光成像系統(tǒng)掃描圖像入計(jì)算機(jī)。1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)處理數(shù)據(jù)以xs表示,采用SPSS16.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,組間差異比較采用單向方差分析,按=0.05的檢驗(yàn)水準(zhǔn),P0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。2結(jié)果2.1姜黃素對(duì)Hepa1-6細(xì)胞增殖作用MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,240mol/L姜黃素可以不同程度地抑制Hepa1-6細(xì)胞增殖,濃度在5mol/L或以上與對(duì)照組比較,差異顯著(P0.05),并隨姜黃素濃度增加和作用時(shí)間延長(zhǎng)抑制作用明顯增強(qiáng)。見(jiàn)表1。表1姜黃素對(duì)Hepa1-6肝癌細(xì)胞增殖影響(xs,n=3)組別劑量(mol/L)存活率(%)24h48h對(duì)照組0100.002.12100.001.93姜黃素296.343.8195.424.47姜黃素591.170.59*87.711.57*姜黃素1087.022.45*82.960.05*姜黃素2079.882.21*62.572.98*姜黃素4042.010.81*13.381.39*注:與對(duì)照組比較,:*P0.05,*P0.012.2姜黃素對(duì)Hepa1-6細(xì)胞凋亡形態(tài)觀察研究采用Hoechst33258染色觀察姜黃素對(duì)Hepa1-6細(xì)胞凋亡形態(tài)的影響,結(jié)果如圖1所示,對(duì)照組Hepa1-6細(xì)胞呈弱熒光染色,不同濃度姜黃素作用后Hepa1-6細(xì)胞可以吸收Hoechst33258,發(fā)出較強(qiáng)烈的藍(lán)色熒光,細(xì)胞核或細(xì)胞質(zhì)內(nèi)可見(jiàn)濃染致密的藍(lán)色熒光顆粒,染色質(zhì)凝聚、邊緣化及細(xì)胞核裂解等凋亡細(xì)胞核形態(tài)。見(jiàn)圖1。圖1姜黃素對(duì)Hepa1-6細(xì)胞凋亡形態(tài)影響(100)2.3姜黃素對(duì)Hepa1-6細(xì)胞凋亡率影響AnnexinV-FITC/PI雙標(biāo)流式細(xì)胞儀檢測(cè)顯示,終濃度5mol/L、10mol/L、20mol/L姜黃素作用48h,Hepa1-6細(xì)胞凋亡率分別為(6.031.08)%、(11.390.24)%、(16.550.94)%,其中10mol/L、20mol/L組細(xì)胞凋亡率與對(duì)照組比較有明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.01)。見(jiàn)圖2。Cur10mol/LControlCur5mol/LCur20mol/LControlCur5mol/LCur10mol/LCur20mol/L圖2姜黃素對(duì)Hepa1-6細(xì)胞凋亡影響2.4姜黃素對(duì)Hepa1-6細(xì)胞內(nèi)ROS影響DCFH-DA熒光染色后,姜黃素組細(xì)胞可見(jiàn)綠色熒光,ROS熒光強(qiáng)度隨姜黃素濃度增加而增強(qiáng),熒光酶標(biāo)儀檢測(cè)顯示終濃度5mol/L、10mol/L、20mol/L姜黃素作用后ROS熒光強(qiáng)度分別為對(duì)照組1.21、2.09、11.73倍(P0.05)。見(jiàn)圖3。圖3姜黃素對(duì)Hepa1-6細(xì)胞ROS影響(100)2.5Caspase-3活化蛋白的表達(dá)Caspase-3是細(xì)胞凋亡過(guò)程中關(guān)鍵執(zhí)行分子,caspase-3以酶原形式存在于胞漿中,在細(xì)胞凋亡早期階段,caspase-3被激活剪切后產(chǎn)生的17kD和12kD片斷,Hepa1-6細(xì)胞經(jīng)5、10、20mol/L姜黃素作用48h后可以檢測(cè)到caspase-317kD產(chǎn)物,提示姜黃素可以活化caspase-3,見(jiàn)圖4。圖4姜黃素對(duì)Hepa1-6細(xì)胞caspase-3活化作用3討論原發(fā)性肝癌(簡(jiǎn)稱肝癌)是全球最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一,其發(fā)病率居全球第7位,我國(guó)及東南亞國(guó)家發(fā)病率尤高,預(yù)后極差,5年生存率為3%5%5,6。肝癌隱匿,進(jìn)展迅速,大多肝癌患者就診時(shí)已失去手術(shù)機(jī)會(huì),同時(shí)由于肝癌對(duì)放射及細(xì)胞毒性藥物治療不敏感或因肝功能異常不能耐受常規(guī)治療,亟待尋找高效、低毒的新的治療手段。目前國(guó)內(nèi)外多項(xiàng)研究已證實(shí),姜黃素可通過(guò)抑制微管的動(dòng)態(tài)不穩(wěn)定性、激活有絲分裂點(diǎn)、誘導(dǎo)凋亡及阻滯細(xì)胞周期等多種途徑抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)2,7,本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)姜黃素對(duì)Hepa1-6肝癌細(xì)胞增殖有顯著的抑制作用,提示姜黃素對(duì)肝癌細(xì)胞具有一定程度抗癌作用。細(xì)胞凋亡或程序性細(xì)胞死亡(Programmedcelldeath),是細(xì)胞在一定的生理或病理?xiàng)l件下,受內(nèi)在基因調(diào)控的自動(dòng)結(jié)束生命的過(guò)程,是腫瘤藥物治療主要效應(yīng)機(jī)制之一;凋亡細(xì)胞可以呈現(xiàn)特殊的形態(tài)學(xué)改變,如染色質(zhì)濃縮、凝聚,細(xì)胞核碎裂,產(chǎn)生凋亡小體等8。本研Cur20mol/LCur10mol/LCur5mol/LControl-TubulinCleavedcaspase-3Curcumin(mol/L)020105究顯示姜黃素作用后Hepa1-6細(xì)胞可吸收Hoechst33258,發(fā)出強(qiáng)烈的藍(lán)色熒光,細(xì)胞核或細(xì)胞質(zhì)內(nèi)可見(jiàn)濃染致密的藍(lán)色熒光顆粒及明顯核形態(tài)變化;同時(shí)AnnexinV-FITC/PI,流式細(xì)胞儀檢測(cè)顯示不同濃度姜黃素作用后Hepa1-6細(xì)胞出現(xiàn)明顯凋亡,提示姜黃素可誘導(dǎo)Hepa1-6細(xì)胞發(fā)生凋亡,細(xì)胞凋亡可能參與姜黃素抗肝癌作用。caspase-3是細(xì)胞凋亡執(zhí)行蛋白酶,正常情況下,caspase-3以酶原形式存在于胞漿中,在細(xì)胞凋亡過(guò)程中,多種凋亡信號(hào)最終引起caspase-3活化,被剪切后產(chǎn)生的17kD和12kD片斷,進(jìn)而裂解下游蛋白底物,誘發(fā)細(xì)胞凋亡,因此,細(xì)胞凋亡研究常以檢測(cè)caspase-3活化產(chǎn)生的17kD產(chǎn)物的形式來(lái)鑒定其活化8,9。本研究結(jié)果顯示姜黃素作用后Hepa1-6細(xì)胞可以檢測(cè)到caspase-3剪切產(chǎn)生17kD產(chǎn)物,提示姜黃素可以活化caspase-3,參與誘導(dǎo)Hepa1-6細(xì)胞凋亡。目前研究廣泛地證實(shí)ROS與細(xì)胞凋亡、細(xì)胞生長(zhǎng)抑制之間有密切關(guān)系,細(xì)胞內(nèi)ROS水平的變化可以引起腫瘤細(xì)胞一系列與細(xì)胞增殖、凋亡相關(guān)信號(hào)通路的變化,如NF-B、ASK1/JNK等信號(hào)通路,活化caspase-3;ROS產(chǎn)生先于caspase-3的活化,提高結(jié)腸癌細(xì)胞或肝癌細(xì)胞內(nèi)ROS水平能抑制癌細(xì)胞生長(zhǎng)1014。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)姜黃素可以顯著提高細(xì)胞內(nèi)ROS水平,提示ROS可能參與姜黃素誘導(dǎo)Hepa1-6細(xì)胞生長(zhǎng)抑制及細(xì)胞凋亡,具體的凋亡信號(hào)通路有待進(jìn)一步研究。參考文獻(xiàn)1.GodA,KunnumakkaraAB,AggarwalBB.CurcuminasCurecuminFromkitchentoclinic.BiochemicalPharmaeo,2008;5(4):7878092.BanerjeeM,SinghP,PandaD.Curcuminsuppressesthedynamicinstabilityofmicrotubules,activatesthemitoticcheckpointandinducesapoptosisinMCF-7cells.FEBSJ,2010;277(16):343734483.SahaA,KuzuharaT,EchigoN,eta1.Apoptosisofhumanlungcancercellsbycurcuminmediatedthroughup-regulationofgrowtharrestandDNAdamageinduciblegenes45and153.BiolPharmBull,2010;33(8):129112994.PatelBB,GuptaD,ElliottAA,eta1.CurcumintargetsFOLFOX-survivingcoloncancercellsviainhibitionofEGFRsandIGF-1R.AnticancerRes,2010;30(2):319325.5.JemalA,BrayF,CenterMM,eta1.Globalcancerstatistics(2011).CACancerJClin,2011;61(2):69906.HagymsiK,TulassayZ.Epidemiologyriskfactorsandmolecularpathogenesisofprimarylivercancer.OrvHetil,2008;149(12):5415487.TeitenMH,GaaschtF,CronauerM,eta1.Anti-proliferativepotentialofcurcumininandrogen-dependentprostatecancercellsoccursthroughmodulationoftheWinglesssignalingpathway.IntJOncol,2010;38(3):6036118.deBruinEC,MedemaJP.Apoptosisandnon-apoptoticdeathsincancerdevel
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