（微生物學專業(yè)論文）acidithiobacillus+ferrooxidans+atcc23270硫活化相關(guān)胞外蛋白質(zhì)研究.pdf

碩士學位論文摘要 摘要 金屬硫化礦的生物浸出過程中，元素硫的累積形成鈍化膜，阻礙 了金屬離子的進一步浸出。嗜酸氧化亞鐵硫桿菌( a c i d i t h i o b a c i l l u s f e r r o o x i d a n s ，a f e r r o o x i d a n s ) 能通過生物氧化有效消解和利用硫化 礦分解過程中產(chǎn)生的元素硫，同時不斷補充浸出過程消耗的質(zhì)子促進 金屬離子的不斷浸出。嗜酸氧化亞鐵硫桿菌對元素硫的氧化是一個錯 綜復雜的過程，包括對元素硫的活化、轉(zhuǎn)運與生物氧化等。這里，嗜 酸硫桿菌的對元素硫的活化是硫氧化系統(tǒng)中的首要步驟，也是開展硫 氧化系統(tǒng)研究必須要解決的瓶頸問題。 因此本文開展嗜酸氧化亞鐵硫桿菌細胞胞外蛋白質(zhì)的篩選、鑒定 與活化功能驗證的研究。通過這些研究，找到嗜酸氧化亞鐵硫桿菌胞 外與元素硫作用的巰基蛋白，為闡明硫的生物氧化過程和金屬硫化礦 的生物浸出機理提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。具體內(nèi)容包括以下三個內(nèi)容： ( 1 ) 不同基質(zhì)( s o f e 2 + ) 中嗜酸氧化亞鐵硫桿菌胞外蛋白質(zhì)差異表 達譜研究： 通過水浴加熱法分別提取元素硫和亞鐵基質(zhì)中a f e r r o o x i d a n s 胞 外蛋白質(zhì)，利用2 d 電泳建立了元素硫和亞鐵能源基質(zhì)中彳 f e r r o o x i d a n s 胞外蛋白質(zhì)差異電泳圖譜，采用m a l d i t o f m s 鑒定 了1 8 個在元素硫中表達上調(diào)的胞外蛋白質(zhì)。通過與a f e r r o o x i d a n s a t c c2 3 2 7 0 基因庫中蛋白和基因信息比對發(fā)現(xiàn)其中1 2 個是屬于未 知蛋白質(zhì)，以及6 個分子量較小的多肽序列中含有相對豐富的半胱 氨酸殘基( c y s ) 。 ( 2 ) 嗜酸氧化亞鐵硫桿菌硫活化相關(guān)胞外蛋白質(zhì)基因的分析和 驗證： 結(jié)合已有的研究結(jié)果和a f e r r o o x i d a n s 全基因組基因信息，采用 實時定量p c r ( r e a l t i m ep c r ) 方法對l o 個可能與硫活化相關(guān)的基 因進行轉(zhuǎn)錄水平表達差異研究。結(jié)果表明，與亞鐵中生長的彳 f e r r o o x i d a n s 菌相比，元素硫中生長細菌硫活化相關(guān)基因的相對表達 量明顯上調(diào)，其中a f e2 5 3 7 和a f e0 9 2 7 的表達量分別達到1 4 1 1 和2 1 4 3 倍，其他基因的表達量也明顯有所上調(diào)。這證明了么 f e r r o o x i d a n s 中這些基因與元素硫的活化氧化的關(guān)聯(lián)性。 碩十學位論文摘要 ( 3 ) 嗜酸氧化亞鐵硫桿菌硫活化相關(guān)胞外蛋白質(zhì)表達純化及功 能驗證： 對a f e r r o o x i d a n s 與吸附相關(guān)的菌毛蛋白( a f e2 6 2 1 ：p i l i n ， p u t a t i v e ) 基因a f e2 6 2 1 進行克隆與原核表達。利用硫的k 邊x a n e s 光譜對胞外蛋白樣品及純化表達的菌毛蛋白樣品進行分析，結(jié)果表明 樣品中富含巰基的氨基酸主要是半胱氨酸。這是在國內(nèi)外首次從蛋白 質(zhì)和硫的化學形態(tài)層面證明了富含巰基蛋白在單質(zhì)硫的活化氧化過 程中扮演重要角色。 關(guān)鍵詞：嗜酸氧化亞鐵硫桿菌，硫活化，胞外蛋白質(zhì)組學，實時 定量p c r ，菌毛蛋白 i l 碩士學位論文 a b s t r a c t a bs t r a c t e l e m e n t a ls u l f u rm a ya c c u m u l a t ei nt h ec o u r s eo fm e t a ls u l f i d e d i s s o l u t i o na n dc a nf o r mal a y e ro nt h em e t a ls u l f i d es u r f a c e w h i c h c o n s e q u e n t l y r e d u c e sd i f f u s i o nr a t e sf o ri o n s a c i d o p h i l i c s u l f u r - o x i d i z i n gb a c t e r i ac a ne m c i e n t l ye l i m i n a t et h ei n s e r ts u l f u ra n d r e p l e n i s ht h es u p p l yo ft h ep r o t o n sr e q u i r e df o rb i o l e a c h i n gp r o c e s s e s ， a n ds oi m p r o v et h el e a c h i n gr a t eo fi r o n i nn a t u r a la c i d i ce n v i r o n m e n t t h ep a t h w a yf o re l e m e n ts u l f u rd i s s o l u t i o ni ss u l f u rb i o o x i d a t i o n t h e s u l f u rb i o o x i d a t i o ni sa c o m p l e xp r o c e s s t h a ti n v o l v e st h e a t t a c h m e n t a c t i v a t i o no fc e l l st os u lf u rp a r t i c l e s ，t h et r a n s p o r t a t i o no f s u l f u rt h r o u g ht h eo u t e rm e m b r a n ea n dt h eo x i d a t i o no fs u l f u ri nt h e p e r i p l a s m i cs p a c e s u l f u r - a c t i v a t e di s t h ep r i n c i p a ls t e po ft h es u l f u r b i o o x i d a t i o n ，h o w e v e r ，t h ee x a c tm e c h a n i s mu n d e r l y i n gs u l f u r a c t i v a t e d i sn o tw e l lu n d e r s t o o d t h ep r e s e n tw o r kf o c u s e so ni s o l a t i o n ，i d e n t i f i c a t i o na n df u n c t i o n a l i n v e s t i g a t i o n o fe x t r a c e l l u l a rp r o t e i n sa n d g e n e so fa c i d i t h i o b a c i l l u s f e r r o o x i d a n s ，i no r d e rt op r o v i d eb a s i cd a t ao ns u l f u rb i o o x i d a t i o n t h e p r i m a r ys u b j e c t so fw h i c hi n c l u d et h r e ep a n sa sf o l l o w s ： ( 1 ) r e s e a r c ho nc o m p a r a t i v ee x t r a c e l l u l a rp r o t e o m i c s o fa f e r r o o x i d a n sg r o w nu n d e rd i f f e r e n te n e r g y ( f e 2 + s o ) t h ee x t r a c e l l u l a rp r o t e i n sw e r ee x t r a c t e db ys t e a r m i n gm e t h o da n d t w o d i m e n s i o n a l e l e c t r o p h o r e s i sp r o f i l e s w a se s t a b l i s h e d b yu s i n g m a t r i x a s s i s t e dl a s e rd e s o r p t i o n i o n i z a t i o nt i m e o f - f l i g h t t i m e o f - f l i g h t m a s ss p e c t r o s c o p y ( m a l d i t o f m s ) a n a l y s i s ，w ei d e n t i f i e dat o t a lo f 18e x t r a c e l l u l a rp r o t e i n sw i t ha p p a r e n th i g h e ra b u n d a n c eg r o w ni n e l e m e n ts u l f u rt h a ni nf e r r o u ss u l f a t e 12o ft h e s ep r o t e i n sa r eu n k n o w n f u n c t i o n s i na d d i t i o n ，s i xh y p o t h e t i c a lp r o t e i n s ( o rp e p t i d e s ) o fw h i c h c o n t a i na b u n d a n to ft h ec y s t e i n er e s i d u e s ( 2 ) v a l i d a t et h es u l f u r - a c t i v a t e de x t r a c e l l u l a rp r o t e i n sa n dg e n e so f a f e r r o o x i d a n s a c c o r d i n gt ot h ei n f o r m a t i o no fa f e r r o o x i d a n sg e n o m ea n dt h e p u b l i s h e d r e s e a r c hr e s u l t s ，w ec h o s e10e x t r a c e l l u l a rp r o t e i n sg e n e s i i i r e s p o n d i n gt os u l f u r - a c t i v a t e da n de x a m i n et h e i re x p r e s s i o na n a l y s i sb y r e a l _ t i m ep c r t h er e s u l t ss h o w e dt h a tt h ec o n s t i t u t i v ee x p r e s s i o no f a 1 1 t h o s e g e n e sw a sh i g h l yu p r e g u l a t e db yg r o w t ho ne l e m e n ts u l f u r c o m p o u n d s ( a n dd o w n r e g u l a t e db yg r o w t ho nf e r r o u si r o n ) w h a t sm o r e ， g e n e s a f e 一2 5 3 7 a n d a f e 一0 9 2 7 w e r eu p g r a d u l a t e d141 ，1a n d214 。3 f o l d 、 r e s p e c t i v e l y ( 3 ) e x p r e s s i o n ，p u r i f i c a t i o na n df u n c t i o n a li n v e s t i g a t i o no ft h e s u l f u r - a c t i v a t e de x t r a c e l l u l a rp r o t e i n sf r o m a f e r r o o x i d a n s t h eg e n ea f e 一2 6 2 1e n c o d i n gp u t a t i v ep i l i nf r o ma 佬r r o o x i d c l n s w a sc l o n e da n de x p r e s s e di ne c o l i t h ee x t r a c e l l u l a r p r o t e i n so fa ， j e r r o o x i d a n sg r o w no ne l e m e n t a is u l f u ra n dt h e p u r i f i e da f e2 6 21 ( p i n l i n ) w e r ec h a r a c t e r i z e dw i t hs u l f u rk - e d g ex a n e s s p e c t r o s c o p y t h e r e s u l t ss h o w e dt h a tt h et h i o l c o n t a i n i n ga m i n o a c i dm a i n l yc y s t e i n ep l a y a ni m p o r t a n tr o l ei ne l e m e n t a ls u l f u ra c t i v a t i o na n do x i d a t i o n k e yw o r d s ：a c i d i t h i o b a c i l l u sf e r r o o x i d a n s ，s u l f u ra c t i v a t i o n ， e x t r a c e l l u l a rp r o t e o m i c s ，r e a l t i m ep c r ，p i l i n p r o t e i n i v 原創(chuàng)性聲明 本人聲明，所呈交的學位論文是本人在導師指導下進行的研究 工作及取得的研究成果。盡我所知，除了論文中特別加以標注和致謝 的地方外，論文中不包含其他人已經(jīng)發(fā)表或撰寫過的研究成果，也不 包含為獲得中南大學或其他單位的學位或證書而使用過的材料。與我 共同工作的同志對本研究所作的貢獻均已在在論文中作了明確的說 明。 作者簽名：上吐遞西一 日期：業(yè)號一年月旦日 關(guān)于學位論文使用授權(quán)說明 本人了解中南大學有關(guān)保留、使用學位論文的規(guī)定，即：學校 有權(quán)保留學位論文并根據(jù)國家或湖南省有關(guān)部門規(guī)定送交學位論文， 允許學位論文被查閱和借閱；學?？梢怨紝W位論文的全部或部分內(nèi) 容，可以采用復印、縮印或其它手段保存學位論文。同時授權(quán)中國科 學技術(shù)信息研究所將本學位論文收錄到中國學位論文全文數(shù)據(jù)庫， 并通過網(wǎng)絡(luò)向社會公眾提供信息服務(wù)。 蘭望年月旦日 碩士學位論文 第一章緒論 第一章緒論 1 1 微生物冶金 1 1 1 微生物冶金的定義 微生物冶金，也叫生物浸出( b i o l e a c h i n g ) ，通常是指將礦物( 主要是指硫 化礦，包括原生硫化礦和次生硫化礦) 中所含有的各種非溶性有價金屬轉(zhuǎn)變成可 溶性的形式并加以回收利用【1 ，2 1 。盡管這個過程涉及到如生物學，表面化學，電 化學，物理化學，礦物學等各種學科的交叉聯(lián)系，但歸根結(jié)底離不開微生物對各 種金屬的氧化作用，因此，上述過程又叫做生物氧化作用( b i o o x i d a t i o n ) 。然而， 生物氧化作用這個術(shù)語，往往是指這樣一個過程，即通過微生物對礦物的分解作 用來提高各種目的金屬的回收率的過程。一個最典型的例子就是從含砷黃鐵礦中 提取貴重金屬金。金的提取往往要通過氰化物的預處理等一系列步驟。盡管砷、 鐵和硫在這個過程也被浸出，但對于金的整個回收過程來說，生物浸出這個術(shù)語 就顯得不太合適。因此，為適應(yīng)于上述兩個不同的概念，采用生物采礦 ( b i o m i n i n g ) 這個術(shù)語也許是比較合適的【3 1 。 1 1 2 微生物冶金的特點 現(xiàn)有的常規(guī)物理、化學選冶方法由于回收率低、資源損耗大、生產(chǎn)成本高和 對環(huán)境污染嚴重等問題已不適應(yīng)社會經(jīng)濟可持續(xù)發(fā)展要求。在此情況下，微生物 在礦物分離方面的作用逐漸引起人們的重視。 微生物冶金的特劇4 叫： 微生物冶金既可用于礦物的就地浸出，也可用于工廠礦物處理、廢水廢渣 處理。 微生物冶金具有生產(chǎn)成本低、投資少、工藝流程短、設(shè)備簡單、環(huán)境友好、 能處理復雜多金屬礦物等優(yōu)點，因此細菌浸礦的廣泛應(yīng)用，將引起傳統(tǒng)礦物加工 產(chǎn)業(yè)的重大變革，為人類、資源與環(huán)境的可持續(xù)發(fā)展開辟廣闊的前景。 細菌氧化處理難選冶硫化物金精礦的工藝與另兩種氧化( 焙燒、加壓) 法相 比，基建投資省( 設(shè)焙燒法的投資是1 0 0 ，則加壓法要6 6 ，而細菌法只需3 5 ) ，生 產(chǎn)成本低( 設(shè)焙燒法的生產(chǎn)成本為1 0 0 ，則加壓法為1 11 ，細菌法只需9 5 ) ，而金的 回收率與焙燒法相當或還高一點。 由于微生物冶金適合儲量小、低品位、成分復雜的硫化礦的冶金，而我國 的礦大多符合這個條件。所以，微生物冶金在我國有很大的發(fā)展前景。 碩士學位論文第一章緒論 微生物冶金的主要缺點是過程的反應(yīng)速度慢。在生物濕法冶金方面的主要 任務(wù)，是研究開發(fā)能提高反應(yīng)速度的菌種。工程的挑戰(zhàn)在于如何用最短的時間， 對大量的礦石同時進行固相、液相、氣相反應(yīng)，而且能控制其它的可變因素，特 別是把溫度控制在最佳水平上加速細菌的作用。即一個非常重要的任務(wù)就是通過 遺傳工程的技術(shù)，培育出對高含量的重金屬更有耐力，用于提取特定金屬的浸出 生物。 1 1 3 微生物冶金的反應(yīng)機理 學術(shù)界認為金屬硫化物的溶解存在兩種機制，即直接作用和間接作用。在直 接作用機制中，細菌與礦物直接發(fā)生氧化還原作用而溶出金屬，不需要鐵或鐵離 子的存在【7 1 ，目前，這種機制的合理性遭到了很大質(zhì)疑【8 1 ；而在間接作用機制中， 金屬硫化物在質(zhì)子攻擊和f e 3 + 氧化作用下，晶格受到破壞，繼而經(jīng)過硫代硫酸鹽 途徑或多聚硫化物途徑而溶解1 1 。 a 硫代硫酸鹽途徑b 多聚硫化物途徑 孵+ + 瓣 觸吶寸職鋤 s 。q _ 麓s 圖1 - 1 金屬硫化礦生物浸出的( a ) 硫代硫酸鹽途徑和( b ) 多聚硫化物途徑 f i g 1 - 1d i a g r a m so f t h i o s u l f a t ea n dp o l y s u l f i d ep a t h w a y si n v o l v e di nb i o l e a c h i n go f m e t a l s u l f i d em i n e r a l s 可從金屬硫化礦中浸出金屬元素的微生物種類雖然很多，包括古生菌和真細 菌中的許多嗜酸種類，但金屬元素從礦石中溶出的基本途徑只有兩條，即硫代硫 酸鹽途徑和多聚硫化物途徑【8 】。黃銅礦( c u f e s 2 ) 的微生物浸礦遵循多聚硫化物途 徑，它基于f e ”和礦的共同作用，將黃銅礦溶解。在這一過程中，從黃銅礦釋 放出來的硫，有9 0 以上經(jīng)由多聚硫化物，最后轉(zhuǎn)化成元素硫，只有少量的硫代 硫酸鹽、連多硫酸鹽和硫酸鹽生成( 圖1 1 ) ，如沒有硫氧化菌參與，這些元素硫 2 碩士學位論文第一章緒論 將累積在浸礦體系中，并很快在在礦物表面形成鈍化層，嚴重阻礙礦物的浸出。 浸礦微生物在這一途徑中的作用是氧化元素硫，生成硫酸，為礦物水解提供足夠 的曠，并及時消除元素硫?qū)ΦV物浸出的鈍化作用，保持氧化劑、茵體和礦物之 間的傳質(zhì)作用暢通；同時保證f e ”和f e 2 + 的正常循環(huán)，為礦物的氧化提供充足的 f e 3 + 氧化劑。因此，黃銅礦的浸出必須有硫氧化菌和鐵氧化菌的共同參與。 f e 3 + 從礦物中奪取電子，還原成f e 2 + ，礦物晶體釋放出會屬陽離子( m 2 + ) 和硫化物中間產(chǎn)物，f e 2 + 氧化菌在酸性溶液中將f e 2 + 氧化成f e 3 + ，保證f e 2 + 和f e 3 + 正常循環(huán)。在多聚硫化物途徑( 圖1 1 b ) ，除f e 3 + 外，h + 通過綁定礦物中的價電 子，也對礦物進行氧化。硫化物中間產(chǎn)物被非生物的化學氧化作用和硫氧化菌共 同氧化。圖中以化學氧化為主，生物氧化為輔的位置，硫氧化菌就標在括號內(nèi)， 主要的非f e ”電子受體標在箭頭右邊。沒有硫氧化菌參與時，累積的主要反應(yīng)產(chǎn) 物，在硫代硫酸鹽途徑( 圖1 1 a ) 是硫酸，在多聚硫化物途徑是s 8 ，分別標于 方格內(nèi)。當有硫氧化菌存在時，兩途徑的主要反應(yīng)產(chǎn)物均為硫酸。 硫代硫酸鹽溶解途徑適用于f e s 2 、m o s 2 和w s 2 等金屬硫化物的溶解，它完全 基于f e ”對元素s 的氧化作用直至元素硫中的六個電子全部被轉(zhuǎn)移，形成s 2 0 3 二， 將金屬元素分離到溶液中去。這個化學反應(yīng)中還伴隨單質(zhì)s 的產(chǎn)生，金屬硫化物 中大約有2 0 的硫變成單質(zhì)s 。 多聚硫化物溶解途徑則適用于z n s 、p b s 、f e a s s 、c u f e s 2 、m n s 2 、c u s 、 c u 2 s 、n i s 、c o s 署i c d s 等眾多金屬硫化物的溶解，它基于f e ”在h + 的協(xié)助下的對 金屬硫化物的氧化作用，將金屬硫化物溶解，其中金屬硫化物中大約9 0 硫元素 轉(zhuǎn)變?yōu)槎嗑哿? 圖1 2 ) ，其余則生成少量的s 2 0 3 2 。和單質(zhì)s 【1 1 , 1 2 】。 m f 蓮肚s t 2 s 穴嶼一嘲 f e 3 + f e t h s 。h 2 sf 圖l - 2 多聚硫化物溶解途徑示意圖 f i g 1 - 2d i a g r a mo fp o l y s u l f i d ed i s s o l u t i o np m h w a y 圖l 一2 中強酸h 2 s ”電離產(chǎn)生自由基h s ，后者容易形成h 2 s 2 及后續(xù)的多聚硫 化氫；多聚硫化氫不穩(wěn)定，大多數(shù)分解產(chǎn)生單質(zhì)s 8 ，少量被0 2 或f e 3 + 氧化成h 2 s 2 0 3 和單質(zhì)s 【1 2 1 。這個氧化反應(yīng)在沒有f e 3 + 存在的情況下也能進行，電子經(jīng)過導電的 硫化物m s 傳遞到0 2 ，0 2 通過形成超氧自由基和過氧化氫而被還原成h 2 0 【1 3 】。然 而，在浸礦生物群落t 辛f 0 3 + 的存在，v e 3 + 更容易從m s 晶格中奪取電子。 3 碩十學位論文第一章緒論 上述兩種反應(yīng)機制都是屬于化學反應(yīng)的范疇，但是，在有微生物參與的情況 下，f e 3 + 主要由細菌胞外的多聚體供應(yīng)，這種多聚體附合在葡萄醛酸殘基上【9 1 ， 亞鐵氧化細菌( 如么 e r r o o x i d a n s ，l e p t o s p i r i l l u mf e r r o o x i d a n s 等) 能夠保持f e ” 氧化狀態(tài)，硫氧化細菌( 如彳f e r r o o x i d a n s ，a t h i o o x i d a n s 等) 能夠參與單質(zhì)元素 s 和其他還原性硫化合物的氧化，產(chǎn)生一保持溶液的酸性環(huán)境。 1 2 元素硫的化學特性與生物浸出的關(guān)聯(lián)性 金屬硫化礦微生物浸出過程中，嗜酸亞鐵氧化細菌是浸礦溶液氧化還原電位 的主導者，嗜酸硫氧化微生物負責著轉(zhuǎn)化各種含硫化合物為硫酸，保持酸性浸礦 環(huán)境。但在酸性環(huán)境下，元素硫的化學性質(zhì)十分穩(wěn)定，其消解的唯一途徑是通過 嗜酸硫氧化細菌對它的氧化【1 4 1 。在這里，嗜酸硫氧化細菌能夠通過對各種形態(tài) 的含硫化合物的氧化產(chǎn)生多聚硫途徑所消耗的質(zhì)子，以這種獨特的方式來影響生 物浸出的動力學。當環(huán)境中缺少嗜酸硫氧化細菌或嗜酸硫氧化細菌的生長活性受 到抑制時，金屬硫化礦分解產(chǎn)生的元素硫以晶態(tài)或聚集體懸浮在溶液中，或進而 累積在浸礦體系中，并在礦物表面形成鈍化層，導致金屬硫化礦表面的電化學性 質(zhì)發(fā)生改變，阻礙高價鐵離子對礦物的氧化攻擊，減慢金屬離子的溶出速度。 s c h i p p e r s a 等f 1 5 1 采用l f e r r o o x i d a n s 浸出黃鐵礦時，發(fā)現(xiàn)積累的中間硫化合物主 要是元素硫，但采用l f e r r o o x i d a n s 和a t h i o o x i d a n s 混合培養(yǎng)浸出黃鐵礦時，黃 鐵礦中的硫全被氧化，轉(zhuǎn)化為硫酸鹽。f o w l e rt a 和c r u n d w e l lf k l l 6 】研究了a f e r r o o x i d a n s 對高鐵溶液浸出閃鋅礦效果的影響，發(fā)現(xiàn)接種細菌的體系中，鋅離 子的浸出率明顯高于未接種細菌的體系；而未接種細菌的體系，隨著鋅離子的浸 出，礦物表面形成一層多孔硫膜，該膜的存在阻止了f e 3 + 對閃鋅礦的氧化攻擊和 鋅離子浸出。f a l c ol 和p o g l i a n ic t r 7 j 用化學浸出或l f e r r o o x i d a n s 浸出靛銅礦時， 發(fā)現(xiàn)礦物表面均有硫?qū)有纬?，影響浸出效果；而利用f e ”和a t h i o o x i d a n s 組合 浸出靛銅礦卻得到了較好的浸出效果。這些研究結(jié)果表明，金屬硫化礦浸出過程 中，如果有元素硫累積形成的硫?qū)?，將會阻礙了金屬離子的浸出，而嗜酸硫氧化 細菌對元素硫的消解能夠明顯提高浸出效率。嗜酸硫氧化細菌對元素硫的有效消 解和利用，既能預防元素硫?qū)有纬桑材艽龠M嗜酸硫氧化細菌自身生長，為浸礦 環(huán)境提供更多質(zhì)子，對優(yōu)化金屬硫化礦生物浸出動力學、保證金屬離子的高效浸 出具有十分重要的作用。 1 3 嗜酸硫氧化細菌系統(tǒng)多樣性 盡管自然界能夠氧化元素硫的微生物種類十分豐富，硫氧化細菌在能量生 產(chǎn)、硫元素循環(huán)以及維持環(huán)境中微生物群落多樣性等方面起著重要作用。但是到 目前為止只知道為數(shù)不多的微生物種屬在極端酸性環(huán)境下氧化元素硫。這些嗜酸 4 碩士學位論文第一章緒論 硫氧化微生物可以通過它們各自的最適生長溫度而得以區(qū)別。一般根據(jù)生存環(huán)境 溫度，它們可分為中溫( 6 0 ) 嗜酸硫氧化菌3 ，1 9 】。如表1 一l 所示，在極端酸性環(huán)境下，盡管能源物質(zhì)相 對貧瘠，生存p h 一般低于3 ，但微生物群落同樣具有多樣性。 在生物浸出酸性環(huán)境或酸性礦坑水中，中溫硫氧化細菌主要是嗜酸硫桿菌屬 ( a c i d i t h i o b a c i l l u s ) 細菌，包括a f e r r o o x i d a n s 、a t h i o o x i d a n s 、a a l b e r t e n s i s 2 0 】 等。這類菌中，除a f e r r o o x i d a n s 能利用亞鐵和還原性硫化合物外，其余的細菌 只能利用還原性性化合物生長。a f e r r o o x i d a n s 是最早分離到的嗜酸硫氧化細 菌。早期研究人員認為該細菌是主要浸礦功能菌，因此相關(guān)研究比較全面；目前 關(guān)于a f e r r o o x i d a n s 亞鐵和硫代謝途徑正成為研究熱點【2 1 , 2 2 1 。 生物浸出過程中，由于微生物生長代謝和礦物氧化分解，浸礦體系不斷放熱， 溫度可快速上升至4 0 以上，一些中溫嗜酸細菌難以生存，而高溫嗜酸細菌卻 可以很好生長。這些細菌主要是一些亞鐵或硫氧化專性或兼性自養(yǎng)細菌，其中亞 鐵氧化細菌主要為l f e r r o o x i d a n s 和鐵質(zhì)菌屬( f e r r o p l a s m a ) 1 2 3 】。硫氧化菌則主 要包括硫化桿菌( 勛帕b a c i l l u ss p p ) 和喜溫嗜酸硫桿菌( ac a l d u s ) 。s u l f o b a c i l l u s 屬的細菌為革蘭氏陽性桿狀菌，好氧，嗜酸，無機化能營養(yǎng)型，在混合營養(yǎng)條件 下生長良好，在一定的生長階段和環(huán)境條件下產(chǎn)生內(nèi)孢子，不僅夠能以亞鐵、金 屬硫化物等還原性硫化合物化能自養(yǎng)生長，還能夠利用有機底物進行兼性異養(yǎng)生 長【2 們6 1 。a c a l d u s 是a c i d i t h i o b a c i l l u s 屬中唯一的嗜熱浸礦菌種，根據(jù)其生長溫 度( 4 5 左右) 而和其它硫桿菌分別開來。a c a l d u s 好氧生長，能氧化元素硫和 其它還原性含硫化合物，具有多種生理類型，部分菌株在有酵母提取物存在的情 況下，生長速度和硫氧化活性會大大增加。一般認為，a c a l d u s 不能單獨浸出有 價金屬，是重要的金屬浸出輔助菌，和其它菌株的有效組合，能有效促進金屬硫 化礦的生物浸1 ： i 2 7 , 2 8 】。 5 碩士學位論文第一章緒論 表1 1 目前分離純化到能夠利用還原性硫化合物的嗜酸硫氧化細菌 t a b l el - lt h ei s o l a t e da c i d o p h i l i cs u l f u r - o x i d i z i n gb a c t e r i a 6 碩士學位論文第一章緒論 極端酸熱條件下生長的多為古細菌，它們能夠在厭氧或需氧條件下利用還原 性硫化合物或元素硫。目前已分離純化到五個菌屬，如表1 1 所示，它們分別是 硫化葉菌( s u t f o l o b u s ) 、金屬球菌( m e t a l l o s p h a e r a ) 、嗜酸兩面菌( a c i d i a n u s ) 、 憎葉菌屬( s t y g i o l o b u s ) 和硫磺球形菌屬( s u t f u r i s p h a e r a ) 。硫化葉菌s u l f o l o b u s 屬革蘭氏陰性菌，細胞壁缺失肽聚糖，兼性自養(yǎng)，嚴格好氧，生存溫度5 5 , 、- , 8 0 ， 生存p h0 9 5 8 ，能利用亞鐵和或還原性硫化合物作能源化能自養(yǎng)，也可以利 用酵母提取物、胰蛋白胨和數(shù)種糖類作為碳源和能源進行異養(yǎng)生長【5 叭。 嗜酸兩面菌a c i d i a n u s 為典型的嗜熱喜酸古細菌，該屬的各種古細菌的生長 溫度范圍為5 0 9 5 ，生長p h 為1 0 - 6 0 ，最適生長p h 為1 2 2 5 。其中a c i d i a n u s b r i e r l e y i 具有較好的工業(yè)應(yīng)用前景【4 1 , 5 1 j 。它不但能通過氧化亞鐵或元素硫進行自 養(yǎng)生長，而且也能夠在復雜的有機基質(zhì)上進行異養(yǎng)生長。 s t y g i o l o b u s 和s u l f u r i s p h a e r a 目前均僅有一個種，分別為a z o r i c u s 和 o h w a k u e n s i s ，其中s t y g i o l o b u sa z o r i c u s 為專性厭氧生長，而砌珈r i s p h a e r a o h w a k u e n s i s 能夠進行兼性厭氧生長，并且厭氧條件下必須添加元素硫 4 2 , 4 8 】。 1 4 嗜酸硫氧化細菌的硫氧化系統(tǒng) 1 4 1 硫的化學形態(tài) 硫在自然界的存在形式有無機硫和有機硫。如表1 2 和圖1 3 所示，無機硫 形式多樣，以元素硫和含硫化合物等多種不同的形態(tài)存在。有機硫則主要是含硫 氨基酸：如半胱氨酸、甲硫氨酸、蛋氨酸、谷胱苷肽及其衍生物，主要分布在原 油、煤和生物體內(nèi)。 嗜酸硫氧化細菌在所處環(huán)境( 如高溫溫泉、酸性礦水和深海熱噴口中) 的硫 循環(huán)中發(fā)揮著重要作用。還原性硫化合物在硫氧化細菌( 包括光合硫氧化細菌， 7 碩士學位論文 第一章緒論 嗜酸硫氧化細菌等) 作用下，會產(chǎn)生大量的元素硫和含硫化合物。這些含硫物質(zhì) 賦存形態(tài)多樣，有的直接以硫球形式形成聚集體存在于細菌體內(nèi)或體外；有的在 金屬硫化礦表面形成疏水的硫?qū)?；大部分硫元素以各種離子形式進入溶液中。 表1 - 2 元素硫和主要無機化合物及其化合價 t a b l el 一2e l e m a n t a ls u l f u ra n dt h em a i ns u l f u rc o m p o u n d sa n dt h e i ro x i d a t i o ns t a t e s s 2 0 a 2 - - 一0 3 s ( s ) n s 0 3 。 s 2 二。冬上s 圖1 - 3 無初蕊化學存在形式的轉(zhuǎn)變 f i g 1 - 3t h es c h e m a t i co ft r a n s f o r m a t i o na m o n ge l e m e n t a ls u l f u ra n ds u l f i d ec o m p o u n d s 1 4 2 嗜酸硫氧化細菌硫氧化系統(tǒng)的特點 硫在氧化過程中化學形態(tài)的多樣性，決定了元素硫及含硫化合物的生物化學 氧化過程中，硫代謝底物作用酶的多樣性和整個過程的復雜性。盡管中性菌如光 合細菌中關(guān)于硫的氧化系統(tǒng)s o x 系統(tǒng)已經(jīng)得到較為詳細的闡釋，s o x 系統(tǒng)中相應(yīng) 的酶的性質(zhì)和在硫氧化過程中的分子機理基本確定f 5 2 1 。但研究表明，嗜酸硫氧 化細菌硫氧化系統(tǒng)與中性菌如光合細菌中的硫氧化系統(tǒng)( s o x 系統(tǒng)) 完全不同， 這就使得在開展同功同源基因研究硫氧化系統(tǒng)方面沒有借鑒性。 自從1 9 8 6 年以前分離到嗜酸氧化硫硫桿菌t h i o b a c i l l u st h i o o x i d a n s ( 現(xiàn)在改名 8 碩士學位論文第一章緒論 為a c i d i t h i o b a c i l l u st h i o o x i d a n s ) 以來，關(guān)于嗜酸硫氧化細菌的研究一直沒有間斷， 但是關(guān)于中常溫嗜酸硫氧化細菌硫氧化的生物化學過程有待進一步的補充和完 善。在嗜酸硫氧化細菌的作用下，元素硫通過硫氧化酶系的作用氧化分解并生成 最終產(chǎn)物硫酸。元素硫必須經(jīng)過嗜酸硫氧化細菌的有效吸附和轉(zhuǎn)運，進入細胞周 質(zhì)空間后，才能有效地被細菌氧化。這里，嗜酸硫氧化細菌的胞外物質(zhì)介導著細 菌對元素硫的吸附與活化過程，外膜蛋白擔當著對硫轉(zhuǎn)運的作用，細胞周質(zhì)空間 的硫氧化首步反應(yīng)的酶硫雙加氧酶則起著關(guān)鍵氧化酶的作用，承擔著對轉(zhuǎn)運到 細胞周質(zhì)區(qū)域的元素硫進行分流以及為硫氧化酶系中的其它酶提供底物的雙重 功能f 5 3 1 。顯然，嗜酸硫氧化細菌對元素硫的有效利用，取決于嗜酸硫氧化細菌 對元素硫的有效吸附活化、轉(zhuǎn)運和首步氧化反應(yīng)。 1 4 3 嗜酸硫氧化細菌對元素硫的吸附 嗜酸硫氧化細菌對元素硫的氧化，首先要求細菌和元素硫之間相互接觸吸 附。g o u r d o nr 和f u n t o w i c zn 【5 4 】以及k o n i s h iy 等f 5 5 】通過對a f e r r o o x i d a n s 和 a t h i o o x i d a n s 在元素硫基質(zhì)中的生長動力學研究，發(fā)現(xiàn)元素硫的氧化由吸附在其 表面的細菌來完成，細菌吸附的有效性決定了其氧化利用硫微粒的高效性。 s a m p s o n m i 等以及g e h r k et 等【5 6 ，5 7 】的研究表明，胞外多聚物的形成和成份 取決于細菌所處的生長環(huán)境，屬于誘導表達。比較元素硫與黃鐵礦培養(yǎng)基質(zhì)中細 菌胞外多聚物成份，發(fā)現(xiàn)前者含有較高的脂肪酸和油脂類化合物，但糖和糖醛酸 含量較少，這種胞外多聚物的組成可能有利于細菌通過疏水作用吸附在元素硫表 面；而在可溶性無機含硫化合物基質(zhì)培養(yǎng)的細菌表面幾乎沒有胞外多聚物的形 成。 s h a r m ap k 等【5 8 】把從亞鐵基質(zhì)中生長的a f e r r o o x i d a n s 轉(zhuǎn)移到元素硫和黃鐵 礦中生長時，發(fā)現(xiàn)細菌細胞表面蛋白質(zhì)的含量明顯提高，這些蛋白質(zhì)可能作為有 機表面活性成分參與細菌與固體之間的界面反應(yīng)。另有研究發(fā)現(xiàn)，以元素硫為能 源基質(zhì)的硫氧化細菌細胞表面釋放出大量的外膜泡【1 4 , 5 9 】，該外膜泡可能在細菌與 元素硫之間起到“橋梁”作用。根據(jù)硫的生物活化模式推測，元素硫是在與細菌外 膜蛋白發(fā)生鍵合作用后被轉(zhuǎn)運至細胞周質(zhì)空間，其中，細菌外膜蛋白分子中的巰 基在硫鍵合中發(fā)揮著重要作用。o h m u r an 等1 6 0 1 發(fā)現(xiàn)在硫基質(zhì)中生長的彳 f e r r o o x i d a n s 的鞭毛上有一種硫結(jié)合蛋白，該蛋白可與元素硫形成二硫鍵，它可 能在a f e r r o o x i d a n s 特異地吸附到元素硫表面上起作用。 1 4 4 元素硫活化轉(zhuǎn)運模式的提出 p r a n g ea 等【6 1 】報道a v i n o s u m 在氧化硫化物和硫代硫酸鹽的過程中，元素硫 9 碩士學位論文第一章緒論 和有些蛋白質(zhì)形成中間產(chǎn)物r s 。r 或r s n h ，這些中間體短時間的存在于細胞 周質(zhì)空間。 已有的研究工作認為元素硫的活化依賴于低分子量硫醇( 如谷胱苷肽：g s h ) 的作用，硫醇將元素硫活化為g s n h ( g s h + s 8 _ g s 9 h _ _ g s n h ) ，以作為硫 雙加氧酶的底物1 6 z , 6 3 1 。 r o h w e r e rt 和s a n dw f 5 3 】用嗜酸細菌a f e r r o o x i d a n s ，a t h i o o x i d a n s 和 a c i d i p h i l i u ma c i d o p h i l i u m 細胞提取物研究依賴于g s h 的硫雙加氧酶的真正底物， 發(fā)現(xiàn)g s n h 能作為酶反應(yīng)底物，但是g s n h 十分的不穩(wěn)定，能快速分解為元素硫 和較穩(wěn)定的g s 2 h 。g s 2 h 在酶促( 細胞提取物) 條件下或非酶促條件下發(fā)生如 下反應(yīng)： g s s h + 0 2 + h 2 0 _ g s h + s 0 3 2 + 2 w( 酶促反應(yīng)) 2 g s s h g s 3 g + h 2 s ( 自發(fā)反應(yīng)) g s n g 單獨不能作為酶反應(yīng)底物，但是g s n g 在有g(shù) s h 的情況下能作為底物， 原因是發(fā)生了如下反應(yīng)； g s n g + g s h - g s x h + g s y g ( n 2 ，x l ，y 1 ) 早期s u g i ot 6 4 1 的試驗結(jié)果表明h 2 s 在g s 2 g 存在的情況下也能直接氧化成 s 0 3 厶。其原因是因為h 2 s 和g s 2 g 發(fā)生反應(yīng)產(chǎn)生了g s s h ( h 2 s + g s s g g s s h + g s h ) ，g s s h 為硫雙加氧酶的底物而被催化氧化生成s 0 3 玉。 這些研究結(jié)果肯定了g s n h ( 或g s 2 h ) 而非g s n g 是酶促反應(yīng)底物。既然 g s s h 中含有硫烷硫，是不是所有含有硫烷硫的物質(zhì)都能發(fā)生此反應(yīng)呢? 但研究 發(fā)現(xiàn)如$ 2 0 3 2 。，s n 0 3 2 - 等都不能替代g s n h ( 或g s 2 h ) 作為酶促反應(yīng)底物。 依據(jù)試驗結(jié)果，r o h w e r e rt 和s a n dw t 5 3 1 提出了元素硫先被活化然后被催化 氧化的模式，其中，活化反應(yīng)首先由親核反應(yīng)試劑打開環(huán)狀結(jié)構(gòu)的s 8 ，即細胞 外的元素硫與外膜蛋白上的硫醇基團r s h ( 功能類似于大量的g s h ) 相互接觸 后被活化，形成線狀的無機硫與有機物結(jié)合的r s n h ( n 2 ) ，然后轉(zhuǎn)運到細胞周質(zhì) 后被硫雙加氧酶氧化，產(chǎn)物為s 0 3 厶。 但是，到目前為止，真正的硫轉(zhuǎn)運外膜蛋白還仍然在尋找的過程中。 r a m i r e zp 等【6 5 】比較研究af e r r o o x i d a n sa t c c19 8 5 9 在元素硫和f e 2 + 基質(zhì)中 生長時細胞體內(nèi)總蛋白質(zhì)表達的差異，發(fā)現(xiàn)在元素硫基質(zhì)中生長的細胞內(nèi)有一分 子量為4 4k d a 的外膜蛋白明顯表達上調(diào)。b u o n f i g l i ov 等【6 6 】將a f e r r o o x i d a n s 從 1 0 碩+ 學位論文第一章緒論 f e 2 + 生長基質(zhì)轉(zhuǎn)入到以元素硫或硫代硫酸鹽基質(zhì)中時，發(fā)現(xiàn)彳f e r r o o x i d a n s 特異 性地表達一分子量為5 5k d a 的外膜蛋白，同時另有一分子量為4 7k d a 的組成性 表達外膜蛋白表達上調(diào)，說明這兩種外膜蛋白都可能與a f e r r o o x i d a n s 元素硫基 質(zhì)的氧化相關(guān)，但這兩種蛋白與元素硫或硫代硫酸鹽轉(zhuǎn)運的關(guān)系仍未能確定。 b u o n f i g l i ov 掣6 7 】通過單向電泳發(fā)現(xiàn)a f e r r o o x i d a n sm s r 外膜蛋白中有一分子量 為5 0k d a 的外膜蛋白只在元素硫基質(zhì)中生長的細菌細胞中高度表達，但在f e 2 + 基質(zhì)中生長的細菌細胞中不表達，該研究仍然未能確定該蛋白便是硫轉(zhuǎn)運蛋白， 更重要的是，該作者前后分離到的表達上調(diào)的外膜蛋白分子量互不相同，與 r a m i r e zp 等【6 5 】分離到的表達上調(diào)蛋白的分子量也不一致。 盡管目前嗜酸硫桿菌屬中一些硫氧化相關(guān)基因和蛋白已經(jīng)被鑒定或者分離 純化得到，其中一些蛋白的功能也得到驗證，但仍然存在許多懸而未決的問題， 如：細菌胞外多聚物和元素硫之間的相互接觸時具體的分子機制；細胞外膜結(jié)合 酶是否參與各種含硫化合物的催化氧化；單質(zhì)硫及其它代謝中間產(chǎn)