「煙草遺傳轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)」.doc

實(shí)驗(yàn)八 植物細(xì)胞懸浮培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)?zāi)康模簩W(xué)習(xí)和掌握植物細(xì)胞懸浮培養(yǎng)的操作技術(shù)與方法。實(shí)驗(yàn)器材：超凈工作臺、恒溫培養(yǎng)室、高壓滅菌器、冰箱、恒溫培養(yǎng)箱、培養(yǎng)瓶、250 mL 、500 mL三角瓶、鑷子、酒精燈等。配置MS液體培養(yǎng)基（2，4-D 2 mg/L+1%甘露醇 +3% 蔗糖，pH 5.8）分裝于250ml的三角瓶中，每瓶50ml。實(shí)驗(yàn)材料：煙草葉片愈傷組織。實(shí)驗(yàn)方法：1.70%乙醇凈化工作臺并擦洗干凈，將所用的材料、工具、培養(yǎng)基等放入工作臺。打開紫外燈和風(fēng)機(jī)，15分鐘后關(guān)閉紫外燈開始方可操作。2. 在超凈臺上用無菌鑷子夾取出生長旺盛的松軟愈傷組織，放入150ml三角瓶中并輕輕夾碎,每個三角瓶加入培養(yǎng)基20-30ml，每瓶接種1-2g愈傷組織，按愈傷組織與液體培養(yǎng)基110的比例，以保證最初培養(yǎng)物中有足夠量的細(xì)胞。3.接種后的三角瓶用天平稱取重量并記載，然后置于搖床上，在轉(zhuǎn)速100-120rpm，25下培養(yǎng)以及散射光條件下，進(jìn)行振蕩懸浮培養(yǎng)。4.每周更換新鮮液體培養(yǎng)基兩次，每次更換1/3。每次更換新鮮培養(yǎng)基時(shí)稱取重量。5. 每個人接種懸浮培養(yǎng)細(xì)胞1瓶，觀察并記錄細(xì)胞生長情況。6. 培養(yǎng)7天后，制作細(xì)胞生長曲線：為了解縣浮培養(yǎng)細(xì)胞的生長動態(tài)，可用以下方法繪制生長曲線圖：鮮重法：在轉(zhuǎn)代培養(yǎng)的不同時(shí)間，取一定體積的懸浮培養(yǎng)物，離心收集后，稱量細(xì)胞的鮮重，以鮮重為縱座標(biāo)，培養(yǎng)時(shí)間為橫座標(biāo)，繪制鮮重增長曲線。 煙草遺傳轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)?zāi)康臒煵菔沁z傳轉(zhuǎn)化的模式植物，已經(jīng)建立了一套完善的轉(zhuǎn)化再生體系。本實(shí)驗(yàn)以煙草為實(shí)驗(yàn)材料，了解根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)法的基本原理和一般步驟，掌握遺傳轉(zhuǎn)化的基本操作技術(shù)。實(shí)驗(yàn)要求：掌握根癌農(nóng)桿菌侵染植物獲取轉(zhuǎn)基因材料的方法；理解農(nóng)桿菌介導(dǎo)途徑進(jìn)行基因轉(zhuǎn)化的機(jī)理；了解轉(zhuǎn)基因植物篩選的方法。實(shí)驗(yàn)原理 根癌農(nóng)桿菌是一種能誘發(fā)植物產(chǎn)生腫瘤的細(xì)菌，根癌農(nóng)桿菌中誘導(dǎo)植物產(chǎn)生腫瘤的質(zhì)粒，簡稱為Ti質(zhì)粒。野生型農(nóng)桿菌的Ti質(zhì)粒，含有兩個與致瘤有關(guān)的區(qū)域：一個是TDNA區(qū)，含致瘤基因；另一個是毒性區(qū)，在TDNA的切割、轉(zhuǎn)移與整合過程中起作用。用于植物基因轉(zhuǎn)化的農(nóng)桿菌Ti質(zhì)粒載體系統(tǒng)的構(gòu)建，是將野生Ti質(zhì)粒中的致瘤基因刪除，并在TDNA區(qū)域內(nèi)插入適當(dāng)?shù)倪x擇標(biāo)記和多克隆位點(diǎn)。p BI121載體是常用的植物表達(dá)載體，載體的骨架是pUC18，以CaMV35S啟動子驅(qū)動的新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因NPTII為卡那霉素（kan）抗性選擇標(biāo)記基因，含有卡那霉素抗性基因作為篩選基因。葡萄糖苷酶gus基因作為報(bào)告基因，轉(zhuǎn)化的獲得的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞、組織或植株，具有抗卡那霉素的特性，經(jīng)組織化學(xué)染色呈藍(lán)色。實(shí)驗(yàn)器材搖床、超凈工作臺、小型離心機(jī)、冰箱、移液搶、鑷子、手術(shù)刀、酒精燈、棉球、培養(yǎng)皿、三角瓶、濾紙、牛皮紙、牙簽。實(shí)驗(yàn)材料植物材料：煙草無菌苗農(nóng)桿菌與載體：農(nóng)桿菌LBA4404 p BI121YEB培養(yǎng)基：牛肉膏(5 g/L)、蛋白胨(5 g/L)、酵母提取物(1 g/L)、蔗糖(5 g/L)、MgSO4 (0.5 g/L)、pH 7.0煙草分化培養(yǎng)基：MS + 2mg/L 6-BA + 0.5mg/L IAA 煙草生根培養(yǎng)基：MS + 0.5mg/L IAA 卡那霉素（Kan）母液：50mg/ml，過濾除菌，分裝，20保存。頭孢霉素（cef）母液：300mg/ml，過濾除菌，分裝，20保存。利福平(rif): 50mg/ml，過濾除菌，分裝，20保存。實(shí)驗(yàn)步驟1. 農(nóng)桿菌感受態(tài)的制備：1) 接菌于5 ml YEB液體培養(yǎng)基(Rif 50 mg/L)中，28，200轉(zhuǎn)/分鐘，培養(yǎng)12天；2) 取1mL活化的菌液接種于50mlYEB液體培養(yǎng)基中，同樣條件下培養(yǎng)至OD600值為0.40.6左右。3) 將菌液倒入50mL的離心管中，冰浴20分鐘。4) 4，5000g離心10分鐘，收集菌體。5) 用0.15M NaCl /0.1M CaCl2中懸浮細(xì)胞。6) 5000 rpm離心5分鐘，去上清；7) 用冰預(yù)冷20mM CaCl2重懸沉淀，如不是馬上使用，加入甘油分裝，液氮速凍后，-70保存。2. 農(nóng)桿菌感受態(tài)細(xì)胞的轉(zhuǎn)化：1) 取200 l感受態(tài)細(xì)胞于Eppendorf管；2) 加入1 g質(zhì)粒DNA，混勻，冰浴30分鐘；3) 立即放入液氮中冰凍5分鐘；(-70放置10min)4) 取出Eppendorf管，立即放入37 oC水浴5分鐘；5) 加入YEB培養(yǎng)基l ml，28oC，150 rpm搖床培養(yǎng)23小時(shí)；6) 離心1分鐘，懸浮細(xì)胞在100ul YEB培養(yǎng)基中。7) 在YEB固體培養(yǎng)基(Kan 50 mg/L, Rif 50 mg/L)涂板；8) 28 oC下暗培養(yǎng)23天；9) 挑單菌落，提取質(zhì)粒，酶切，電泳檢查。10) 取轉(zhuǎn)化菌株培養(yǎng)液于1.5 ml的離心管中，加15%的無菌甘油，貯存在-70 oC長期保存。3. 農(nóng)桿菌活化1）挑取攜帶植物表達(dá)載體質(zhì)粒的農(nóng)桿菌單菌落，接種在35ml含50mg/L rif 和50mg/L Kan的YEB液體培養(yǎng)基中，28，180rpm振蕩培養(yǎng)過夜,直至對數(shù)生長OD600為0.6-0.8。2）活化過夜的農(nóng)桿菌按1：1001：50的比例接種在相同的20-50ml YEB液體培養(yǎng)基中，繼續(xù)培養(yǎng)至對數(shù)生長期。4. 外植體的侵染及共培養(yǎng)1）取煙草無菌葉片，切成46mm的葉盤到無菌瓶中，加入農(nóng)桿菌菌液，感染10min，期間輕微振蕩，取出外植體用無菌濾紙吸去附著的菌液。2）將浸染過的外植體接種在分化培養(yǎng)基上，暗培養(yǎng)2d4d。5篩選培養(yǎng)將共培養(yǎng)的外植體轉(zhuǎn)移到含cef 300mg/l和50mg/L Kan分化培養(yǎng)基上，25，光照培養(yǎng)。每隔3-4周繼代一次,，待轉(zhuǎn)化后的外植體長出大量叢生芽。6生根培養(yǎng)：培養(yǎng)篩選的抗性芽長11.5cm時(shí)，從基部將