E玫瑰花環(huán)形成實驗.ppt

E玫瑰花環(huán)形成實驗 中山醫(yī)學院免疫教研室2012 04 ERosetteFormingCellTest 掌握E花環(huán)形成的原理熟悉E花環(huán)形成實驗的步驟及光鏡下E花環(huán)的形態(tài)熟悉磁珠分離的原理 實驗目的 T細胞的表面分子是T細胞與其它細胞和分子間相互識別及作用的物質(zhì)基礎 它們在T細胞活化 增殖和分化等過程中起重要作用 TCR CD3復合物參與T細胞的抗原識別和信號轉導 CD2 CD28 CTLA 4 CD45 CD40L等膜蛋白參與T細胞活化及T細胞與其它細胞間相互作用 CD4 CD8分子輔助TCR識別結合抗原 參與信號轉導 根據(jù)CD4和CD8分子的表達將其分為CD4 T和CD8 T細胞 T細胞表面分子 依靠表面標記的分離方法 流式細胞術分離法 利用各種熒光素標記的表面標記特異性抗體 使不同表面標記的細胞結合上不同的熒光素 借助熒光活化細胞分選儀將各種細胞分離開來 免疫磁珠分離法 將針對細胞某種表面標記的特異性抗體包被在磁性微珠上 與磁珠交聯(lián)的抗體能夠特異性結合具有這種表面標記的細胞 然后用強磁場可將具有這種表面標記的細胞分離出來 磁珠 microbead 標記細胞上的磁珠在掃描電鏡下也幾乎看不到 磁珠分離策略 一 陽性分選 磁珠標記目的細胞 未標記細胞先行流出 移出磁場后收集目的細胞 CD4 T細胞 分離柱 CD4 T細胞 磁珠標記非目的細胞 目的細胞先行流出 二 陰性分選 成熟的人T細胞表面表達綿羊紅細胞 SRBC 受體 即CD2分子 能與SRBC結合形成玫瑰花環(huán)樣結構 可在光學顯微鏡下觀察計數(shù) 本法可用于分離外周血T細胞及檢測T細胞的數(shù)量和比例 E花環(huán)分離法原理 實驗材料 1 肝素抗凝血2 Hank s液3 淋巴細胞分離液4 綿羊紅細胞懸液5 滅活小牛血清6 水平離心機 37 溫箱 顯微鏡等 實驗方案 取外周血 綿羊紅細胞 淋巴細胞 分離 顯微鏡下觀察 實驗步驟 用Hank s液配成106細胞 0 1ml 加等量滅活小牛血清 0 1ml 取0 1ml 加入0 5 綿羊紅細胞0 2ml 混勻 37 溫箱放置5分鐘 1000rpm離心5min 加1小滴1 美藍 用毛細吸管輕輕混勻 取1滴于玻片上 加上蓋玻片 高倍鏡下觀察玫瑰花環(huán)形成細胞 置4 冰箱 5min 30 45min 結果判斷 凡能結合三個以上綿羊紅細胞者為玫瑰花形成陽性細胞 正常人的花環(huán)形成率50 70 大致可以代表周圍血中T細胞的百分數(shù) 左 甲紫染色 800 可見2個被綿羊紅細胞包圍而形成玫瑰環(huán)的T淋巴細胞 右 吖啶橙染色 圖中可見3個染成橙黃色熒光的T淋巴細胞被綿羊紅細胞所包圍 T淋巴細胞玫瑰花環(huán) T淋巴細胞玫瑰花環(huán)掃描電鏡 6500 測定外周血中的T細胞數(shù) 觀察受檢者的細胞免疫功能及免疫增強劑的療效 觀察免疫抑制劑的效果 協(xié)助進行惡性腫瘤療效的觀察及預后判斷等 臨床應用 注意事項 1