2010藥典微生物培訓資料.ppt

微生物的基本知識回顧 1 什么是微生物 微生物 microorganism microbe 是一類個體微小 結構簡單 肉眼不可見或看不清楚的微小生物的統(tǒng)稱 2 微生物的特點 個體微小 結構簡單 細胞大小以微米和納米計量 種類繁多 分布廣泛 一克沃土中含菌量高達幾億甚至幾十億生長繁殖快 代謝能力強 大腸桿菌 Escherichiacoli 在適宜的條件下 每20分鐘即繁殖一代 24小時即可繁殖72代 遺傳穩(wěn)定性差 容易發(fā)生變異 自發(fā)突變頻率為10 6左右 細菌的性質 1菌體形態(tài) 球 桿 螺旋 革蘭氏染色 1884年丹麥醫(yī)師Gram所發(fā)明 真細菌根據(jù)細胞壁結構分為革蘭氏陽性菌 革蘭氏陰性菌 約40層網狀肽聚糖覆蓋在細胞表面 磷壁酸貫穿于肽聚糖層 形成厚約20 80nm的細胞壁 磷壁酸貫穿其中 革蘭氏陽性菌 G 細胞壁結構 內壁層 靠近細胞膜 為1 2層網狀肽聚糖 外壁層 脂多糖 LPS 磷脂層和脂蛋白層 革蘭氏陰性菌 G 細胞壁結構 脂多糖的結構模型 O 特異側鏈核心多糖類脂A 內毒素 熱源質 細菌的特出結構 芽孢 在其生長的一定階段在細胞內形成圓形或橢圓形 圓柱形休眠體結構稱為芽孢 功能 對惡劣環(huán)境有很強的抵抗能力 有的芽孢 在一定條件下可保持活力數(shù)年甚至數(shù)十年之久 它本身具有一個細胞維持生命的所有功能 特點 耐高溫 抗熱性很強 抗化學藥物和酸類 對溶菌酶有抗性 細菌的特出物質 熱原質 特點 耐高溫 不具揮發(fā)性 重要疏水原理 易被強酸 強堿破壞 可濾過性 易吸附性 可稀釋性 水溶性 內毒素 細胞壁外層 屬于細胞壁的組成部分 脂質A 一般與細胞結合在一起不分泌到環(huán)境中 只有當細菌溶解 裂解 后才釋放出來 故稱內毒素 少量內毒素0 001 g入血即可引起發(fā)熱反應 內毒素被吞噬細胞吞飲后 細胞釋放出內源性致熱原 經血流到達下丘腦 體溫調節(jié)中樞引起發(fā)熱 作用特點 沒有組織器官的選擇性肌體發(fā)熱 腹瀉 出血性休克或其他組織損傷不能經甲醛脫毒 2 菌落 colony 單個 或聚集在一起的一團 微生物在適宜的固體培養(yǎng)基表面或內部生長 繁殖到一定程度可以形成肉眼可見的 有一定形態(tài)結構的子細胞生長群體 菌落單位為CFU Colony FormingUnits 眾多菌落連成一片 菌苔 lawn 通常情況下 純培養(yǎng)能較好地被研究 利用和重復結果 因此 把特定的微生物從自然界混雜存在的狀態(tài)中分離 純化出來的純培養(yǎng)技術是微生物學研究的基礎 3細菌純培養(yǎng)的群體生長規(guī)律 把一定微生物接種到一定量的液體培養(yǎng)基中 在一定條件下進行一次性培養(yǎng) 定時取樣測定活菌數(shù) 以活菌數(shù)的對數(shù)值為縱坐標 以培養(yǎng)時間為橫坐標 就可以畫出一條有規(guī)律的曲線 這就是微生物的典型生長曲線 繁殖曲線 一般把典型生長曲線劃分為適應期 對數(shù)增長期 指數(shù)期 穩(wěn)定期和衰亡期等四個時期 球菌 直徑 0 5 1mm桿菌 直徑 長度 0 2 1mm 1 5mm 青霉的分生孢子頭 根霉的孢子囊和孢囊孢子 酵母菌是對一類單細胞真菌的通稱 有球形 卵形 橢圓形 圓柱形等 大小在5 20 m 霉菌的細胞呈分枝或不分枝的絲狀 直徑約2 10 m 細菌菌落放線菌菌落霉菌菌落 酵母菌 2010年版中國藥典微生物檢驗主要增修訂內容 1 培養(yǎng)基的質量控制2 菌種的質量控制 1 微生物檢驗培養(yǎng)基質量控制技術 培養(yǎng)基是微生物試驗的基礎 直接影響微生物試驗結果 適宜的培養(yǎng)基制備方法 貯藏條件和質量控制試驗是提供優(yōu)質培養(yǎng)基的保證 1 1培養(yǎng)基制備過程中的注意事項 1 1 1培養(yǎng)基的水化培養(yǎng)基水化時不得用銅鍋或鐵鍋 以防有離子混入培養(yǎng)基中 影響微生物的生長 配制培養(yǎng)基最常用的溶劑是純化水 不能含有任何可能抑制或影響微生物生長的物質 培養(yǎng)基制備過程中的注意事項 1 1 2培養(yǎng)基的溶解在培養(yǎng)基分裝滅菌前 各成分應溶解均勻 使用電爐等設備煮沸培養(yǎng)基時 應用小火加熱 并邊加熱邊攪拌 避免培養(yǎng)基焦化或爆沸溢出 培養(yǎng)基制備過程中的注意事項 1 1 3培養(yǎng)基的滅菌已配制好的培養(yǎng)基必須立即滅菌濕熱滅菌必須嚴格控制滅菌溫度和時間 培養(yǎng)基制備過程中的注意事項 1 1 4培養(yǎng)基的pH微生物必須在適宜的pH范圍內才能正常生長繁殖或體現(xiàn)其生物特性 調整培養(yǎng)基的pH 應用1mol LNaOH或1mol LHCl調整pH 一般滅菌前比最終pH高0 2 0 3 培養(yǎng)基制備過程中的注意事項 1 1 5培養(yǎng)基的保溫滅菌以后培養(yǎng)基應該迅速冷卻至所需溫度 避免長時間保存在滅菌鍋內 造成過度滅菌 影響培養(yǎng)基的營養(yǎng)成分或選擇性效果 1 2培養(yǎng)基質量控制 2010版藥典 培養(yǎng)基適用性檢查 計數(shù)培養(yǎng)基 控制菌檢查用培養(yǎng)基 1 2 1培養(yǎng)基適用性檢查的基礎 一 對照培養(yǎng)基系指按培養(yǎng)基處方特別制備 質量優(yōu)良的培養(yǎng)基 用于培養(yǎng)基適用性檢查 由中國藥品生物制品檢定所研制及分發(fā) 二 定量質控菌株 BioBall BioBall是由生物梅里埃BTF公司生產的定量質控標準菌株 其水溶性球狀物包含了數(shù)量精確的微生物個體 主要用于培養(yǎng)基生長能力驗證 無菌控制 微生物限度檢查 抑菌效力檢查 陽性對照 方法驗證 能力驗證和MOU測定等試驗 廣泛用于制藥工業(yè) 食品工業(yè) 水及廢水檢測和其他相關行業(yè)的微生物質控 目前 BioBall有超過25種常用的檢測標準菌種 可提供SingleShot MultiShot 550 HighDose 10K和MultiShot 10E8四類系列產品 分別含有28 30cfu 標準誤差小于或等于3cfu 500 600cfu 8000 12000cfu和0 7 1 5x108cfu數(shù)量的孢子 芽孢或細胞 1 2 2計數(shù)培養(yǎng)基適用性檢查 大腸埃希菌金黃色葡萄球菌枯草芽孢桿菌白色念珠菌黑曲霉白色念珠菌 營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基NutrientAgar NA 玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基 酵母浸出粉胨葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基 YPD YeastPeptoneDextroseAgar 50 100CFU 1 2 2計數(shù)培養(yǎng)基適用性檢查 結果判定被檢培養(yǎng)基上的菌落平均數(shù)對照培養(yǎng)基上的菌落平均數(shù)菌落形態(tài)大小應與對照培養(yǎng)基上的菌落一致 70 菌落計數(shù)法證明培養(yǎng)基生長能力USP USP要求每批配制培養(yǎng)基作促生長能力測試菌種選擇 變化大 每個微生物單獨測試大豆酪蛋白消化培養(yǎng)基 金葡 銅綠 枯草沙堡葡萄糖培養(yǎng)基 白念 黑曲方法 在培養(yǎng)中加入少量中 不超過100cfu 的微生物 按要求培養(yǎng) 對于新鮮制備的菌液 生長與前批已通過測試的培養(yǎng)基的前次測試結果一致 標準 計數(shù)結果與標準接種物的計算量差別小于系數(shù)2 即計數(shù)結果在標準接種物數(shù)量的50 200 1 2 3控制菌檢查用培養(yǎng)基適用性檢查 促生長能力抑制能力指示能力 檢查項目 1 2 3控制菌檢查用培養(yǎng)基適用性檢查 促生長能力檢查 增菌培養(yǎng)基促生長能力檢查 分別接種不大于100cfu的試驗菌于被檢培養(yǎng)基和對照培養(yǎng)基中 在相應控制菌檢查規(guī)定的培養(yǎng)溫度及最短培養(yǎng)時間下培養(yǎng) 與對照培養(yǎng)基管比較 被檢培養(yǎng)基管試驗菌應生長良好 培養(yǎng)基基本要求 1 2 3控制菌檢查用培養(yǎng)基適用性檢查 促生長能力檢查 固體培養(yǎng)基促生長能力檢查 取試驗菌各0 1ml 含菌數(shù)50 100cfu 分別涂布于被檢培養(yǎng)基和對照培養(yǎng)基平板上 在相應控制菌檢查規(guī)定的培養(yǎng)溫度及最短培養(yǎng)時間下培養(yǎng) 被檢培養(yǎng)基與對照培養(yǎng)基生長的菌落大小形態(tài)特征應一致 培養(yǎng)基基本要求 USP控制菌檢查用固體培養(yǎng)基能力檢查 使用表面涂布法 在培養(yǎng)中加入少量中 不超過100cfu 的微生物 在規(guī)定溫度下培養(yǎng)不超過規(guī)定的最短時間 清楚的觀察到與前批已通過測試的培養(yǎng)基的前次測試結果一致 注 有生長就行 無數(shù)字上要求 1 2 3控制菌檢查用培養(yǎng)基適用性檢查 抑制能力檢查 培養(yǎng)基抑制能力檢查 接種不少于100cfu的試驗菌于被檢培養(yǎng)基中 在相應控制菌檢查規(guī)定的培養(yǎng)溫度及最長時間下培養(yǎng) 試驗菌應不得生長 針對選擇性培養(yǎng)基 膽鹽乳糖培養(yǎng)基 膽鹽乳糖發(fā)酵培養(yǎng)基 四硫磺酸亮綠培養(yǎng)基 金黃色葡萄球菌 溴化十六烷基三甲胺瓊脂培養(yǎng)基 亞碲酸鹽肉湯培養(yǎng)基 卵黃氯化鈉瓊脂培養(yǎng)基 甘露醇氯化鈉瓊脂培養(yǎng)基 念珠菌顯色培養(yǎng)基 大腸埃希菌 1 2 3控制菌檢查用培養(yǎng)基適用性檢查 指示能力檢查 固體培養(yǎng)基指示能力檢查 取試驗菌各0 1ml 含菌數(shù)不大于100cfu 分別涂布于被檢培養(yǎng)基和對照培養(yǎng)基平板上 在相應控制菌檢查規(guī)定的培養(yǎng)溫度及時間下培養(yǎng) 被檢培養(yǎng)基中試驗菌生長的菌落形態(tài) 大小 指示劑反應情況等應與對照培養(yǎng)基一致 針對鑒別培養(yǎng)基 1 2 3控制菌檢查用培養(yǎng)基適用性檢查 指示能力檢查 液體培養(yǎng)基指示能力檢查 分別接種不大于100cfu的試驗菌于被檢培養(yǎng)基和對照培養(yǎng)基中 在相應控制菌檢查規(guī)定的培養(yǎng)溫度及最短培養(yǎng)時間下培養(yǎng) 與對照培養(yǎng)基管比較 被檢培養(yǎng)基管試驗菌生長情況 指示劑反應等應與對照培養(yǎng)基一致 針對鑒別培養(yǎng)基 典型特征 大腸桿菌在伊紅美藍瓊脂 EMB 曙紅亞甲藍 上典型特征 典型特征 黑曲霉和白色念珠菌在玫瑰紅鈉瓊脂RoseBengalAgar上典型特征 典型特征 金黃色葡萄球菌在甘露醇氯化鈉MannitolSaltAgar瓊脂上典型特征 典型特征 沙門氏菌在SS瓊脂上 沙門氏菌在BS瓊脂 亞硫酸鉍瓊脂 上 培養(yǎng)基質量控制 2010版藥典 實驗室配制的培養(yǎng)基的常規(guī)監(jiān)控項目pH適用性檢查試驗定期的穩(wěn)定性檢查以確定有效期 2 菌種的質量控制2 1概念 標準菌株 由國內或國際菌種保藏機構保藏的 遺傳學特性得到確認和保證并可追溯的菌株 標準儲備菌株 由標準菌株經一次傳代得到的培養(yǎng)物 商業(yè)派生菌株 由供應商提供的所有特性與標準菌株等效的菌株 代 將活的微生物接種到新鮮培養(yǎng)基中進行培養(yǎng) 并希望獲取新的微生物培養(yǎng)物 這種操作方式 新培養(yǎng)物對接種培養(yǎng)物而言就稱為一代 工作菌株 由標準儲備菌株經傳代得到的培養(yǎng)物 中國醫(yī)學菌種保藏中心提供的標準菌株 美國國家菌種保藏中心提供的標準菌株 法國生物梅里埃公司提供的商業(yè)派生菌株 Bioball 低溫冷凍保藏的標準儲備菌株 低溫蠟封保藏的標準儲備菌株 我所制備的工作菌株 中國藥典2010年版在方法的附錄中對菌種的規(guī)定同2005年版在新增的 藥品微生物實驗室規(guī)范指導原則 中對菌種有了較為明確的規(guī)定允許使用標準菌株和商業(yè)派生菌株標準菌株應按保藏機構提供的說明進行復活標準儲備菌株應進行純度和特性確認標準儲備菌株建議采用低溫冷凍干燥 液氮貯存或超低溫冷凍保藏的方法標準儲備菌株可用于制備每月或每周一次轉種的工作菌株冷凍菌株解凍后不得重新冷凍和再次使用工作菌株不可替代標準菌株 商業(yè)派生菌株僅可用作工作菌株 菌種鑒定簡單的講可以采用目前比較成熟的商品化鑒定技術 如API鑒定條基本程序為 對疑似菌種進行純培養(yǎng)進行染色鏡檢根據(jù)染色情況 并結合顯色培養(yǎng)基等鑒定的初步信息 選擇合適的鑒定條根據(jù)操作說明書 得到各生化反應的鑒定結果 通過查閱檢索表 得到菌種鑒定的初步結果也可以采用半自動或全自動的微生物鑒定系統(tǒng) 菌種的管理 菌種的采購菌種的復蘇菌種的傳代菌種的保藏菌種的使用和銷毀 菌種的采購每年年底 由實驗室菌種管理人員提出下一年度菌種采購的計劃 計劃購置的菌種一般為藥典收載的標準菌種 填寫請購單 經批準后 由所采購部門向指定的菌種保藏機構購置 所購菌種均為冷凍干燥菌種 采購部門購入菌種后 應及時移交實驗室 實驗室菌種管理人員應仔細核對菌種發(fā)放單和冷凍干燥菌種管標簽等各項信息 確認無誤后 置4 6 暫存 浙江省食品藥品檢驗所菌種管理程序 菌種的復蘇菌種在打開前應仔細核對標簽上菌名 菌號 并注意一株菌種使用一套打開用具 嚴防交叉污染 菌種復蘇應在生物安全柜內操作 大腸埃希菌 金黃色葡萄球菌 銅綠假單胞菌 沙門菌 生孢梭菌和白色念珠菌可同時接種液體培養(yǎng)基和瓊脂培養(yǎng)基斜面 枯草芽孢桿菌 短小芽孢桿菌 藤黃微球菌和黑曲霉可接種瓊脂培養(yǎng)基斜面 取瓊脂培養(yǎng)基斜面上的菌苔按要求對菌種的純度進行鑒定 浙江省食品藥品檢驗所菌種管理程序 菌種的傳代應在生物安全柜中進行菌種的傳代 取經過純度鑒定的第1代菌種管 瓊脂培養(yǎng)基斜面培養(yǎng)物 用于傳代制備第2代菌種 接種完畢 液體培養(yǎng)基或瓊脂培養(yǎng)基斜面應在規(guī)定的溫度下培養(yǎng)適宜的時間 芽孢桿菌宜培養(yǎng)5 6天 黑曲霉宜培養(yǎng)5 7天 其他菌種一般培養(yǎng)18 24小時 浙江省食品藥品檢驗所菌種管理程序 菌種的保藏保存的容器為無菌凍存管 保藏溫度為 70 在冷凍前 應貼上菌種標簽 標簽內容應包括菌名 菌號 傳代日期和有效期 所有凍存管應立即置低溫冰箱中 迅速冷凍 該方法保藏菌種的有效期規(guī)定為6個月 浙江省食品藥品檢驗所菌種管理程序 菌種的使用和銷毀本所保藏的菌種主要供本所檢驗工作使用并可對外提供給有關涉藥單位 本所提供的菌種為第二代低溫冷凍菌種 本所檢驗工作所需菌種 領用人應向菌種管理人員領取 并在 菌種領用記錄 上記錄菌名 數(shù)量 領用人等信息 外單位向我所購買菌種 應憑單位介紹信 并注明菌名 菌號 數(shù)量 必要時可預約購買 本所保藏的菌種 一般應每年更換原種 每年打開一套冷凍干燥菌種傳代制備第1代原種保存 過期菌種應及時銷毀 銷毀時應經121 20分鐘的生物滅活處理 浙江省食品藥品檢驗所菌種管理程序 通過制備工作菌種進行菌種保藏的方法優(yōu)點操作簡便成本低比較容易掌握缺點保存期比較短反復傳代有引起變異的可能 通過制備標準儲備菌種進行菌種保藏的方法優(yōu)點保存期較長反復傳代導致菌種變異的風險較小缺點操作相對復雜成本較高操作流程相對較長 受到污染的風險較高 菌種保藏方法舉例 申請?zhí)?專利號 200810124325本發(fā)明提供了一種菌種保藏方法 采用半固體 低溫密封培養(yǎng)的方法 將菌種接種于無菌的半固體培養(yǎng)基中 倒入無菌液體石蠟后豎直存放入 的環(huán)境溫度中保存 所述菌種為金黃色葡萄球菌 大腸埃希菌 銅綠假單胞菌 枯草芽孢桿菌 生孢梭菌 黑曲霉或白色鏈珠菌 具體過程為 制備半固體培養(yǎng)基 分裝 滅菌 然后培養(yǎng) 天 確定無菌后將菌種穿刺接種于半固體培養(yǎng)基中 平行于培養(yǎng)基平面穿刺接種不少于 點 倒入 高的無菌液體石蠟 用封口膜密封 豎直存放入 的電冰箱中保存 采用本發(fā)明可延長菌種的保存時間 同時菌種的濃度保持相對穩(wěn)定 為生產 試驗節(jié)約了大量的成本 減少了菌種使用后廢棄物的處理和排放 減少了對環(huán)境的危害 斜面保藏法 一般使用營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基 生孢梭菌使用液體硫乙醇酸鹽培養(yǎng)基 在30 35 培養(yǎng)18 24小時 存活時間1 3個月 斜面保藏的菌種在冰箱中放置應注意控制溫度 一般不宜低于4 也可以放置在室溫中 但應控制溫度不超過25 有關菌種的常見問題 陽性菌的制備 領取工作菌種 從斜面上取一定量的培養(yǎng)物 稀釋至系列梯度的菌懸液 分別測各梯度菌懸液的菌落數(shù) 臨用時 取相應稀釋菌懸液用于陽性試驗 同時用平皿法測定加入的菌液中的菌落數(shù) 是否可行 對照用菌液的制備應取工作菌種 接種置適宜的液體培養(yǎng)基中 經培養(yǎng)后獲得濃菌液 再進行稀釋和確定菌濃度 菌種傳代至第5代時 還能不能用該斜面菌種接種制備工作用菌液嚴格講 這種操作是不符合藥典規(guī)定的 藥典所指的傳代次數(shù)不超過5代 應該是指用于實驗的工作用菌液 因此 從保藏的角度看 制備成的斜面保藏菌種只能到第4代 陽性對照是否必須購買菌種 有效期一般為多長時間 對照用菌種應采用標準菌種 一般應外購有效期根據(jù)不同菌種 不同的保藏方法而異 如采用斜面移植保藏法 不能形成芽孢的細菌有效期一般為1個月 能形成芽孢的細菌有效期一般為3個月 真菌的有效期為3個月 如何對菌種進行復壯 傳代之前是否一定要做微生物學鑒定 確認是否有變異 復壯的方法應根據(jù)待復壯的菌種的保藏形式來確定 對凍干菌種 復壯操作較為繁瑣微生物傳代中的菌種確認是必須的 以短小芽孢桿菌為例說說細菌鑒定通過顯微鑒別 為不呈鏈狀排列的桿菌 革蘭氏染色為陽性 營養(yǎng)瓊脂斜面上菌苔光滑 薄 閃光 蔓延 不粘著 常常是淺黃色 生化試驗可選做明膠穿刺 淀粉水解和硝酸鹽還原 結果為明膠緩慢液化 淀粉水解陰性 硝酸鹽還原陰性 采用API鑒定條 結合染色鏡檢和接觸酶實驗等結果 微生物基本操作 1 純培養(yǎng)技術2 微生物的計數(shù)3 微生物形態(tài)的觀察4 微生物生理生化特性測定 干熱滅菌 160 180 2h 高壓蒸汽滅菌 濕熱滅菌 121 15 30min 試管 瓶子 培養(yǎng)皿等 常用的滅菌方法 常用的器具 一 純培養(yǎng)技術1 微生物培養(yǎng)的常用器具及其滅菌 無菌環(huán)境的保證 無菌室 萬及潔凈區(qū)凈化工作臺 萬及潔凈區(qū)下的局部百級酒精燈 外焰溫度最高 r 5cm的球形區(qū)為無菌區(qū) 1 無菌環(huán)境 微生物的環(huán)境器皿及培養(yǎng)基的無菌 操作者的外界環(huán)境及操作過程的無菌 環(huán)境及操作的無菌 2 無菌操作 火焰附近 酒精燈 煤氣燈 進行 2 接種 3分離純培養(yǎng)平板劃線法 streakplatemethod 2 劃線接種 分離純化 Inoculatinganagarplatetoobtainsinglecolonies 二 細菌 霉菌 酵母菌的計數(shù) 菌落總數(shù)的測定方法 活菌計數(shù)法 主要步驟為 將樣品制作成10倍梯度的稀釋液 選擇3個合適的稀釋度 吸取1mL于平皿 傾注培養(yǎng)基后 培養(yǎng)觀察 計數(shù) 對霉菌的計數(shù) 還可以采用顯微鏡直接鏡檢計數(shù)的方法 使用郝氏計測玻片 酵母菌的總數(shù)測定 可采用血球計數(shù)板進行顯微鏡直接鏡檢計數(shù) 酵母菌的死活鑒定可以通過0 1 的美蘭染液染色2 3min完成 活菌不著色 USP對菌落計數(shù)方法分析 菌落數(shù)的回收率可變范圍大 可能在 0 5log10單位左右 即真實值為A時 結果在100 5A A 100 5 100 5 3 16 菌落計數(shù)結果一般不均勻 其對數(shù)值 log10 近似正態(tài)分布 平皿技術的相對標準偏差 RSD 一般在15 35 與平皿上CFU的數(shù)量有關 可以用于評價實驗結果是否有效 或是藥典替代方法精密度判定標準之一 應用過程中的相關規(guī)定比較 與CP一致 固體培養(yǎng)基可計數(shù)范圍 通過牛奶中大腸埃希菌的計數(shù) 驗證 CP規(guī)定細菌 酵母菌 30 300CFUUSP推薦 25 250CFU不包括膜法對于黑曲霉建議 8 80CFU當加菌量過大時 加菌量越大回收率越低當加菌量極少時 加菌量越少誤差越大 CP2005菌數(shù)報告原則 1要求每片濾膜上的菌落數(shù)應不超過100個 2平皿法菌數(shù)報告規(guī)則宜選取細菌 酵母