細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)研究方法.doc

.細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑研究方法一、 蛋白質(zhì)表達(dá)水平和細(xì)胞內(nèi)定位研究1、 信號(hào)蛋白分子表達(dá)水平及分子量檢測(cè): Western blot analysis. 蛋白質(zhì)印跡法是將蛋白質(zhì)混合樣品經(jīng)SDS-PAGE后,分離為不同條帶，其中含有能與特異性抗體(或McAb)相應(yīng)的待檢測(cè)的蛋白質(zhì)(抗原蛋白)，將PAGE膠上的蛋白條帶轉(zhuǎn)移到NC膜上此過程稱為blotting，以利于隨后的檢測(cè)能夠的進(jìn)行，隨后,將NC膜與抗血清一起孵育，使第一抗體與待檢的抗原決定簇結(jié)合(特異大蛋白條帶)，再與酶標(biāo)的第二抗體反應(yīng),即檢測(cè)樣品的待測(cè)抗原并可對(duì)其定量?；玖鞒蹋簷z測(cè)示意圖：2、免疫熒光技術(shù) Immunofluorescence （IF） 免疫熒光技術(shù)是根據(jù)抗原抗體反應(yīng)的原理，先將已知的抗原或抗體標(biāo)記上熒光素制成熒光標(biāo)記物，再用這種熒光抗體（或抗原）作為分子探針檢查細(xì)胞或組織內(nèi)的相應(yīng)抗原（或抗體）。在細(xì)胞或組織中形成的抗原抗體復(fù)合物上含有熒光素，利用熒光顯微鏡觀察標(biāo)本，熒光素受激發(fā)光的照射而發(fā)出明亮的熒光（黃綠色或桔紅色），可以看見熒光所在的細(xì)胞或組織，從而確定抗原或抗體的性質(zhì)、定位，以及利用定量技術(shù)測(cè)定含量。 采用流式細(xì)胞免疫熒光技術(shù)（FCM）可從單細(xì)胞水平檢測(cè)不同細(xì)胞亞群中的蛋白質(zhì)分子，用兩種不同的熒光素分別標(biāo)記抗不同蛋白質(zhì)分子的抗體，可在同一細(xì)胞內(nèi)同時(shí)檢測(cè)兩種不同的分子（Double IF），也可用多參數(shù)流式細(xì)胞術(shù)對(duì)胞內(nèi)多種分子進(jìn)行檢測(cè)。二、 蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)相互作用的研究技術(shù)1、 免疫共沉淀 （Co- Immunoprecipitation, Co-IP） Co-IP是利用抗原蛋白質(zhì)和抗體的特異性結(jié)合以及細(xì)菌蛋白質(zhì)的“protein A”能特異性地結(jié)合到免疫球蛋白的FC片段的現(xiàn)象而開發(fā)出來的方法。目前多用精制的protein A預(yù)先結(jié)合固化在agarose的beads上，使之與含有抗原的溶液及抗體反應(yīng)后，beads上的prorein A就能吸附抗原抗體達(dá)到沉淀抗原的目的。 當(dāng)細(xì)胞在非變性條件下被裂解時(shí)，完整細(xì)胞內(nèi)存在的許多蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)間的相互作用被保留了下來。如果用蛋白質(zhì)X的抗體免疫沉淀X，那么與X在體內(nèi)結(jié)合的蛋白質(zhì)Y也能沉淀下來。進(jìn)一步進(jìn)行Western Blot和質(zhì)譜分析。這種方法常用于測(cè)定兩種目標(biāo)蛋白質(zhì)是否在體內(nèi)結(jié)合，也可用于確定一種特定蛋白質(zhì)的新的作用搭檔。缺點(diǎn)：可能檢測(cè)不到低親和力和瞬間的蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)相互作用。2、 GST pull-down assayGST pull-down assay是將谷胱甘肽巰基轉(zhuǎn)移酶（GST）融合蛋白（標(biāo)記蛋白或者餌蛋白，GST, His6, Flag, biotin ）作為探針，與溶液中的特異性搭檔蛋白(test protein或者prey被撲獲蛋白)結(jié)合，然后根據(jù)谷胱甘肽瓊脂糖球珠能夠沉淀GST融合蛋白的能力來確定相互作用的蛋白。一般在發(fā)現(xiàn)抗體干擾蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)之間的相互作用時(shí)，可以啟用GST沉降技術(shù)。該方法只是用于確定體外的相互作用。示意圖：3、 酵母雙雜交系統(tǒng) 酵母雙雜交系統(tǒng)（Yeast two-hybrid system）的建立是基于對(duì)真核生物調(diào)控轉(zhuǎn)錄起始過程的認(rèn)識(shí)。細(xì)胞起始基因轉(zhuǎn)錄需要有反式轉(zhuǎn)錄激活因子的參與。反式轉(zhuǎn)錄激活因子，例如酵母轉(zhuǎn)錄因子 GAL4在結(jié)構(gòu)上是組件式的（modular），往往由兩個(gè)或兩個(gè)以上結(jié)構(gòu)上可以分開，功能上相互獨(dú)立的結(jié)構(gòu)域（domain）構(gòu)成，其中有DNA結(jié)合功能域（DNA binding domain,DNA-BD）和轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域（activation domain，DNA-AD）。這兩個(gè)結(jié)合域?qū)⑺鼈兎珠_時(shí)仍分別具有功能，但不能激活轉(zhuǎn)錄，只有當(dāng)被分開的兩者通過適當(dāng)?shù)耐緩皆诳臻g上較為接近時(shí)，才能重新呈現(xiàn)完整的GAL4轉(zhuǎn)錄因子活性，并可激活上游激活序列（upstream activating sequence,UAS）的下游啟動(dòng)子，使啟動(dòng)子下游基因得到轉(zhuǎn)錄。將編碼某一蛋白X的DNA序列與DNA結(jié)合域BD的編碼序列融合形成一個(gè)雜交體(“誘餌”bait)，將編碼另一蛋白Y的DNA序列與DNA激活域AD的編碼序列融合形成另一個(gè)雜交體(“獵物”或靶蛋白prey or target protein)，當(dāng)兩個(gè)雜交體共轉(zhuǎn)化酵母細(xì)胞（此酵母細(xì)胞含有上游有DNA結(jié)合位點(diǎn)的報(bào)告基因），若X和Y沒有相互作用，則單獨(dú)不能激活報(bào)告基因的轉(zhuǎn)錄；若X和Y可相互作用，則使BD和AD靠近形成一個(gè)有效的轉(zhuǎn)錄激活子，激活報(bào)告基因的轉(zhuǎn)錄。因此可通過檢測(cè)報(bào)告基因的轉(zhuǎn)錄來研究蛋白質(zhì)X和Y的相互作用。過程示意圖： 4、 熒光共振能量轉(zhuǎn)移 熒光共振能量轉(zhuǎn)移(FRET)是對(duì)生物大分子之間相互作用定性、定量檢測(cè)的一種有效方法，是在活體細(xì)胞中實(shí)時(shí)地對(duì)生物大分子之間的相互作用進(jìn)行動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè).兩個(gè)攜帶不同熒光基團(tuán)（如GFP、YFP、CFP等）的大分子在相互間距離足夠近時(shí)會(huì)發(fā)生激發(fā)態(tài)能量非放射性地由一個(gè)熒光基團(tuán)（供體）向另一個(gè)熒光基團(tuán)（受體）轉(zhuǎn)移的現(xiàn)象。如果發(fā)生FRET，則供體信號(hào)將淬滅而受體信號(hào)將激活或增強(qiáng). FRET 檢測(cè)系統(tǒng)可以快速高效地捕獲來自標(biāo)定分子間相互作用的短暫微弱的熒光信號(hào)，而以分子尺度分辨出供體-受體的平均距離，并能顯示出受體-供體的相互作用。過程示意圖：以光線激發(fā)后，供體熒光基因(ECFPX)會(huì)將激發(fā)能量轉(zhuǎn)移至距離10100 以內(nèi)的受體熒光基因(EGFPY)，進(jìn)而使之發(fā)出熒光。研究人員即可通過檢測(cè)受體熒光基因激發(fā)的熒光確認(rèn)兩蛋白質(zhì)間的相互作用。ECFP：強(qiáng)化型藍(lán)熒光蛋白質(zhì)(enhanced cyan fluorescent protein)；EGFP：強(qiáng)化型綠熒光蛋白質(zhì)(enhanced green fluorescent protein)。三、磷酸化蛋白質(zhì)研究方法磷酸化蛋白質(zhì)研究方法主要有：1、激酶活性的測(cè)定信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過程中往往涉及多種激酶的活化，因而對(duì)這些激酶活性的測(cè)定在信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)研究中具有重要意義。常見激酶活性的測(cè)定有PTK、PKC、PKC及PI-3K等。均有商品化的試劑盒。其它還有：2、Western blot with phospho-specific antibodies.3、Changes in mobility in SDS-PAGE4、Phosphopeptide and phospho amino acid analysis by mass spectrophotometric analysis.四、基因表達(dá)或轉(zhuǎn)錄活性檢測(cè)1、 信號(hào)蛋白轉(zhuǎn)錄水平表達(dá)（mRNA）的檢測(cè):（1） RT- PCR / Realtime RT- PCR （2） Northern blot analysis.（3） RNase protection assay (RPA).（4） “gene chip” to measure changes in gene expression at larger scales 2、 基因啟動(dòng)子/增強(qiáng)子轉(zhuǎn)錄活性的檢測(cè):（1）Transient or stable reporter assayluciferase (Luc) or choramphenicolacetyl- transferase (CAT，氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶基因)（2）Nuclear run-on assay 五、蛋白質(zhì)與DNA相互作用的研究技術(shù)1、 凝膠遷移或電泳遷移率實(shí)驗(yàn)（EMSA-electrophoretic mobility shift assay） 是一種研究DNA結(jié)合蛋白和其相關(guān)的DNA結(jié)合序列相互作用的技術(shù)，可用于定性和定量分析。 2、染色質(zhì)免疫沉淀技術(shù)（chromatin immunoprecipitation assay, CHIP）真核生物的基因組DNA以染色質(zhì)的形式存在。因此，研究蛋白質(zhì)與DNA在染色質(zhì)環(huán)境下的相互作用是闡明真核生物基因表達(dá)機(jī)制的基本途徑。CHIP是用于研究體內(nèi)DNA與蛋白質(zhì)相互作用的方法。它的基本原理是在活細(xì)胞狀態(tài)下固定蛋白質(zhì)DNA復(fù)合物，并將其隨機(jī)切斷為一定長(zhǎng)度范圍內(nèi)的染色質(zhì)小片段，然后通過免疫學(xué)方法沉淀此復(fù)合體，特異性地富集與目的蛋白結(jié)合的DNA片段，通過對(duì)目的片斷的純化與檢測(cè)，從而獲得蛋白質(zhì)與DNA相互作用的信息。過程示意圖：六、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中第二信使含量的測(cè)定 第二信使含量的高低同信號(hào)傳遞密切相關(guān)。1、Ca2+的測(cè)定：原子光譜法、離子微電極測(cè)定法、放射示蹤法及標(biāo)記示蹤法等。目前常用標(biāo)記示蹤法，即用熒光探針標(biāo)記靶細(xì)胞。常用的熒光探針有quin-2/Am、Fura-2/Am及Indo-1等，后二者較為敏感。2、IP3的測(cè)定：采用3H-TdR標(biāo)記的肌醇標(biāo)記靶細(xì)胞后，用不同的刺激劑刺激細(xì)胞，分離磷脂酰肌醇混合物，通過陰離子交換層析柱分離洗脫，收集IP3洗脫峰后進(jìn)行液閃測(cè)定。此外，還可以使用Amersham公司生產(chǎn)的D-myo-IP33H分析系統(tǒng)直接測(cè)定粗提物中的IP3含量，此方法簡(jiǎn)易、敏感。