酵母雙雜交酵母單雜交酵母三雜交課件PPT課件

酵母雙雜交 是在真核模式生物酵母中進行的 研究活細胞內(nèi)蛋白質(zhì)相互作用 對蛋白質(zhì)之間微弱的 瞬間的作用也能夠通過報告基因的表達產(chǎn)物敏感地檢測得到 它是一種具有很高靈敏度的研究蛋白質(zhì)之間關系的技術 酵母雙雜交系統(tǒng)的建立是基于對真核生物調(diào)控轉(zhuǎn)錄起始過程的認識 細胞起始基因轉(zhuǎn)錄需要有反式轉(zhuǎn)錄激活因子的參與 反式轉(zhuǎn)錄激活因子結(jié)構(gòu)上是組件式的 即這些因子往往由兩個或兩個以上相互獨立的結(jié)構(gòu)域構(gòu)成 其中有DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域 DNAbindingdomain 簡稱為BD 和轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域 activationdomain 簡稱為AD 這兩個結(jié)合域?qū)⑺鼈兎珠_時仍分別具有功能 但不能激活轉(zhuǎn)錄 只有當被分開的兩者通過適當?shù)耐緩皆诳臻g上較為接近時 才能重新呈現(xiàn)完整的轉(zhuǎn)錄因子活性 并可激活上游激活序列 upstreamactivatingsequence UAS 的下游啟動子 使啟動子下游基因得到轉(zhuǎn)錄 酵母雙雜交 酵母雙雜交系統(tǒng)的另一個重要的元件報道株指經(jīng)改造的 含報道基因 reportergene 的重組質(zhì)粒的宿主細胞 最常用的是酵母細胞 酵母細胞作為報道株具有許多優(yōu)點 1 易于轉(zhuǎn)化 便于回收擴增質(zhì)粒 2 具有可直接進行選擇的標記基因和特征性報道基因 3 酵母的內(nèi)源性蛋白不易同來源于哺乳動物的蛋白結(jié)合 根據(jù)這個特性 將編碼DNA BD的基因與已知蛋白質(zhì)Baitprotein的基因構(gòu)建在同一個表達載體上 在酵母中表達兩者的BD Baitprotein融合蛋白 將編碼AD的基因和cDNA文庫的基因構(gòu)建在AD LIBRARY表達載體上 在酵母中表達兩者的融合蛋白 如果誘餌蛋白和靶蛋白能夠相互作用 那么GAL4DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域和GAL4激活結(jié)構(gòu)域就會相互作用 從而激活lacZ報道基因的表達 所以我們可以通過轉(zhuǎn)化的酵母的表型來確定誘餌蛋白和靶蛋白是否有相互作用 這種改造后的酵母細胞的基因組中既不能產(chǎn)生GAL4 又不能合成ADE HIS LEU TRP 因此 酵母在缺乏這些營養(yǎng)的培養(yǎng)基上無法正常生長 當上述兩種載體所表達的融合蛋白能夠相互作用時 功能重建的反式作用因子能夠激活酵母基因組中的報告基因ADE HIS LACZ MEL1 從而通過功能互補和顯色反應篩選到陽性菌落 將陽性反應的酵母菌株中的AD LIBRARY載體提取分離出來 從而對載體中插入的文庫基因進行測序和分析工作 綜上 酵母雙雜交系統(tǒng)通過兩個雜交蛋白在酵母細胞中的相互結(jié)合及對報告基因的轉(zhuǎn)錄激活來捕獲新的蛋白質(zhì) 其大致步驟為 1 視已知蛋白的cDNA序列為誘餌 bait 將其與DNA結(jié)合域融合 構(gòu)建成誘餌質(zhì)粒 2 將待篩選蛋白的cDNA序列與轉(zhuǎn)錄激活域融合 構(gòu)建成文庫質(zhì)粒 3 將這兩個質(zhì)粒共轉(zhuǎn)化于酵母細胞中 4 酵母細胞中 已分離的DNA結(jié)合域和轉(zhuǎn)錄激活域不會相互作用 但誘餌蛋白若能與待篩選的未知蛋白特異性地相互作用 則可激活報告基因的轉(zhuǎn)錄 反之 則不能 利用4種報告基因的表達 便可捕捉到新的蛋白質(zhì) 酵母雙雜交系統(tǒng)的應用1 利用酵母雙雜交發(fā)現(xiàn)新的蛋白質(zhì)和蛋白質(zhì)的新功能當我們將已知基因作為誘餌 在選定的cDNA文庫中篩選與誘餌蛋白相互作用的蛋白 從篩選到的陽性酵母菌株中可以分離得到AD LIBRARY載體 并從載體中進一步克隆得到隨機插入的cDNA片段 并對該片段的編碼序列在GENEBANK中進行比較 研究與已知基因在生物學功能上的聯(lián)系 另外 也可作為研究已知基因的新功能或多個篩選到的已知基因之間功能相關的主要方法 2 利用酵母雙雜交在細胞體內(nèi)研究抗原和抗體的相互作用利用酶聯(lián)免疫 ELISA 免疫共沉淀 CO IP 技術都是利用抗原和抗體間的免疫反應 可以研究抗原和抗體之間的相互作用 但是 它們都是基于體外非細胞的環(huán)境中研究蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)的相互作用 而在細胞體內(nèi)的抗原和抗體的聚積反應則可以通過酵母雙雜交進行檢測 3 利用酵母雙雜交篩選藥物的作用位點以及藥物對蛋白質(zhì)之間相互作用的影響酵母雙雜交的報告基因能否表達在于誘餌蛋白與靶蛋白之間的相互作用 對于能夠引發(fā)疾病反應的蛋白互作可以采取藥物干擾的方法 阻止它們的相互作用以達到治療疾病的目的 例如 Dengue病毒能引起黃熱病 肝炎等疾病 研究發(fā)現(xiàn)它的病毒RNA復制與依賴于RNA的RNA聚合酶 NS5 與拓撲異構(gòu)酶NS3 以及細胞核轉(zhuǎn)運受體BETA importin的相互作用有關 研究人員通過酵母雙雜交技術找到了這些蛋白之間相互作用的氨基酸序列 如果能找到相應的基因藥物阻斷這些蛋白之間的相互作用 就可以阻止RNA病毒的復制 從而達到治療這種疾病的目的 4 利用酵母雙雜交建立基因組蛋白連鎖圖眾多的蛋白質(zhì)之間在許多重要的生命活動中都是彼此協(xié)調(diào)和控制的 基因組中的編碼蛋白質(zhì)的基因之間存在著功能上的聯(lián)系 通過基因組的測序和序列分析發(fā)現(xiàn)了很多新的基因和EST序列 HUA等人利用酵母雙雜交技術 將所有已知基因和EST序列為誘餌 在表達文庫中篩選與誘餌相互作用的蛋白 從而找到基因之間的聯(lián)系 建立基因組蛋白連鎖圖 對于認識一些重要的生命活動 如信號傳導 代謝途徑等有重要意義 在酵母雙雜交的基礎上 又發(fā)展出了酵母單雜交 酵母三雜交和酵母的反向雜交技術 它們被分別用于核酸和文庫蛋白之間的研究 三種不同蛋白之間的互作研究和兩種蛋白相互作用的結(jié)構(gòu)和位點 酵母單雜交技術最早是從酵母雙雜交技術發(fā)展而來 酵母雙雜交技術通過對報告基因的表型進行檢測以實現(xiàn)對蛋白質(zhì)間相互作用的研究 而酵母單雜交技術則通過對報告基因的表型檢測 分析DNA 蛋白之間的相互作用 以研究真核細胞內(nèi)的基因表達調(diào)控 原理用于酵母單雜交系統(tǒng)的酵母GAL4蛋白即是一種典型的轉(zhuǎn)錄因子 研究表明GAL4的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域靠近羧基端 含有幾個鋅指結(jié)構(gòu) 可激活酵母半乳糖苷酶的上游激活位點 UAS 而轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域可與RNA聚合酶或轉(zhuǎn)錄因子TFIID相互作用 提高RNA聚合酶的活性 在這一過程中 DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域和轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域可完全獨立地發(fā)揮作用 據(jù)此 我們可將GAL4的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域置換為其他蛋白 只要他能與我們想要了解的目的基因相互作用 就照樣可以通過其轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域激活RNA聚合酶 從而啟動對下游報告基因的轉(zhuǎn)錄 正是基于這一理論 酵母單雜交系統(tǒng)由2部分組成 1 將文庫蛋白片段與GAL4轉(zhuǎn)錄激活域融合表達的cDNA文庫質(zhì)粒 2 含有目的基因和下游報告基因的報告質(zhì)粒 首先將報告質(zhì)粒整合入酵母基因組 產(chǎn)生帶有目的基因的酵母報告株 再將文庫質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入報告株 若存在文庫蛋白與目的基因的相互作用 可通過對報告基因的表達將文庫蛋白的基因篩選出來 酵母三雜交系統(tǒng)的原理與酵母雙雜交相似 利用了酵母細胞的GAL4蛋白調(diào)節(jié)目的基因 半乳糖苷酶基因及His3基因 轉(zhuǎn)錄的特點 GAL4蛋白具有兩個可分離的功能區(qū) N端是DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域 C端為轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域 只要這兩個相對獨立的結(jié)構(gòu)域能夠通過一定的方式在空間上足夠的靠近 如借助其他分子的相互結(jié)合使其足夠靠近 即使它們之間沒有共價結(jié)合也可激活轉(zhuǎn)錄 這為研究蛋白質(zhì)與其他分子的相互作用提供了可能 上圖顯示了酵母三雜交系統(tǒng)的原理 在酵母三雜交系統(tǒng) lexA啟動子調(diào)控下游LacZ基因和His3基因的表達 而lexA啟動子的激活取決于DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域和轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域能否在空間上相互靠近 其中第一個融合蛋白由兩部分組成 一部分為能結(jié)合lexA啟動子的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域 另一部分為噬菌體衣殼蛋白MS2 第二個融合蛋白也由兩部分組成 一部分為能激活lexA啟動子的轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域 另一部分為有待研究的RNA結(jié)合蛋白 Y 這兩個融合蛋白通過第三個融合的RNA分子相連 其一端為含有噬菌體衣殼蛋白MS2結(jié)合位點的MS2RNA 另一端為有待研究的RNA X 一旦 X 和 Y 能有相互作用就使得這個復合物形成一個功能性的轉(zhuǎn)錄激活因子 從而使得下游的LacZ基因和His3基因得以表達 LacZ