分子生物學-轉錄ppt課件

第十六章 RNA的生物合成RNABiosynthesis 掌握 DNA復制和轉錄的區(qū)別掌握 轉錄模板的特點和所需的酶理解 原核和真核生物轉錄的過程及二者間的差異熟悉 真核生物mRNA的加工過程 掌握斷裂基因 內含子 外顯子的概念 了解 tRNA和rRNA的加工 學習目標 在生物界 RNA合成有兩種方式 一是DNA指導的RNA合成 也叫轉錄 此為生物體內的主要合成方式 也是本章介紹的主要內容 另一種是RNA指導的RNA合成 RNA dependentRNAsynthesis 也叫RNA復制 RNAreplication 由RNA依賴的RNA聚合酶 RNA dependentRNApolymerase 催化 常見于病毒 是逆轉錄病毒以外的RNA病毒在宿主細胞以病毒的單鏈RNA為模板合成RNA的方式 轉錄 transcription 生物體以DNA為模板合成RNA的過程 原料 原則 酶 方向 轉錄 復制和轉錄的相同點 酶促的核苷酸聚合 DNA為模板 依賴DNA的聚合酶 生成3 5 磷酸二酯鍵 5 3 方向聚合 遵從堿基配對規(guī)律 復制和轉錄的區(qū)別 引物需要不需要 參與轉錄的物質 原料 NTP ATP UTP GTP CTP 模板 DNA酶 RNA聚合酶 RNApolymerase RNA pol 其他蛋白質因子 模板和酶TemplatesandEnzymes 第一節(jié) 5 3 3 5 模板鏈 編碼鏈 編碼鏈 模板鏈 一 轉錄模板 不對稱轉錄 不對稱轉錄 asymmetrictranscription 在DNA分子雙鏈上某一區(qū)段 一股鏈用作模板指引轉錄 另一股鏈不轉錄 模板鏈并非永遠在同一條單鏈上 DNA分子上能轉錄出RNA的區(qū)段 稱為結構基因 structuralgene DNA雙鏈中按堿基配對規(guī)律能指引轉錄生成RNA的一股單鏈 稱為模板鏈 templatestrand 也稱作無意義鏈或Watson鏈 相對的另一股單鏈是編碼鏈 codingstrand 也稱為有意義鏈或Crick鏈 5 GCAGTACATGTC 3 3 cgtgatgtacag 5 5 GCAGUACAUGUC 3 N Ala Val His Val C 編碼鏈 模板鏈 mRNA 蛋白質 轉錄 翻譯 RogerKornbergWonNobelPrizeforchemistry2006 二 RNA聚合酶 一 RNA聚合酶催化RNA鏈合成的機制 RNA合成的化學機制與DNA依賴的DNA聚合酶催化DNA合成相似 NMP n NTP NMP n 1 PPi RNA 延長的RNA DNA聚合酶在啟動DNA鏈延長時需要引物存在 而RNA聚合酶不需要引物就能直接啟動RNA鏈的延長 二 原核生物的RNA聚合酶 1種 核心酶 coreenzyme 全酶 holoenzyme 參與轉錄延伸 參與轉錄起始 利福平和 亞基結合抑制RNA聚合酶 三 真核生物的RNA聚合酶 3種 均由多個亞基構成 抑制劑 鵝膏蕈堿 毒蘑菇 死亡之傘 Amanitaphalloides deathcap amanitin 真核生物RNA聚合酶的結構比原核生物復雜 所有真核生物的RNA聚合酶都有兩個不同的大亞基和十幾個小亞基 RNA聚合酶 由12個亞基組成 其最大的亞基稱為RBP1 RNA聚合酶 最大亞基的羧基末端有一段共有序列 consensussequence 為Tyr Ser Pro Thr Ser Pro Ser的重復序列片段 稱為羧基末端結構域 carboxyl terminaldomain CTD CTD對于維持細胞的活性是必需的 原核生物的轉錄過程TheProcessofTranscriptioninProkaryote 第二節(jié) 一 轉錄起始 一 原核生物的轉錄過程 起始延長終止 2 DNA雙鏈局部解開 形成開放轉錄復合體 opentranscriptioncomplex 1 RNA聚合酶全酶 2 與模板結合 形成閉合轉錄復合體 closedtranscriptioncomplex 3 在RNA聚合酶作用下發(fā)生第一次聚合反應 形成轉錄起始復合物 RNApol 2 DNA pppGpN OH3 轉錄起始復合物 5 pppG OH NTP 5 pppGpN OH3 ppi 轉錄起始過程 4 亞基脫落 1 模板上酶的辨認 結合 調節(jié)序列 轉錄是不連續(xù) 分區(qū)段進行的 每一轉錄區(qū)段可視為一個轉錄單位 稱為操縱子 operon 操縱子包括若干個結構基因及其上游 upstream 的調控序列 調控序列中的啟動子是RNA聚合酶最先結合模板DNA的部位 也是控制轉錄的關鍵部位 原核生物以RNA聚合酶全酶結合到DNA的啟動子上而起動轉錄 其中由 亞基辨認啟動子 其他亞基相互配合 對啟動子的研究 常采用一種巧妙的方法即RNA聚合酶保護法 RNA聚合酶保護法 Footprinting 開始轉錄 TTGACAAACTGT 35區(qū) Pribnowbox TATAATATATTA 10區(qū) 原核生物啟動子保守序列 RNA pol辨認位點 recognitionsite RNA聚合酶全酶在轉錄起始區(qū)的結合 E coli開放轉錄復合體的形成 2 DNA雙鏈局部解開 形成開放轉錄復合體 opentranscriptioncomplex 1 RNA聚合酶全酶 2 與模板結合 形成閉合轉錄復合體 closedtranscriptioncomplex 3 在RNA聚合酶作用下發(fā)生第一次聚合反應 形成轉錄起始復合物 RNApol 2 DNA pppGpN OH3 轉錄起始復合物 5 pppG OH NTP 5 pppGpN OH3 ppi 轉錄起始過程 4 亞基脫落 cycle 二 轉錄延長 1 亞基脫落 RNA pol聚合酶核心酶變構 與模板結合松弛 沿著DNA模板前移 2 在核心酶作用下 NTP不斷聚合 RNA鏈不斷延長 NMP n NTP NMP n 1 PPi UnwindinggeneratessupercoilsintheDNAthatcanberelievedbyDNAtopoisomerases ActinomycinDwasthefirstantibiotictofindtherapeuticapplicationintumorchemotherapy ItbindstotheDNAtemplateandinterfereswiththemovementofRNApolymerasealongtheDNA 轉錄空泡 transcriptionbubble RNA pol 核心酶 DNA RNA 5 3 DNA 原核生物轉錄過程中的羽毛狀現(xiàn)象 核糖體 RNA RNA聚合酶 在同一DNA模板上 有多個轉錄同時在進行 轉錄尚未完成 翻譯已在進行 這種形狀說明 原核生物的邊轉錄邊翻譯電鏡照片 識別轉錄起始部位 與模板鏈結合 并使DNA雙鏈打開 催化NTP的聚合 缺乏外切酶活性 無校對功能 不同的 識別不同的轉錄起始位點 RNA聚合酶作用特點 依賴Rho 因子的轉錄終止非依賴Rho因子的轉錄終止 三 轉錄終止 指RNA聚合酶在DNA模板上停頓下來不再前進 轉錄產(chǎn)物RNA鏈從轉錄復合物上脫落下來 分類 1 非依賴Rho因子的轉錄終止 DNA模板上靠近終止處 有些特殊的堿基序列 轉錄出RNA后 RNA產(chǎn)物形成特殊的結構來終止轉錄 這種方式較普遍 反向重復序列與發(fā)夾Invertedrepeatsandhairpins 5 NNGAATGCCNNNGGCATTCNN3 3 NNCTTACGGNNNCCGTAAGNN5 5 NNGAAUGCCNNNGGCAUUCNN3 莖環(huán) 發(fā)夾結構 莖環(huán)結構使轉錄終止的機理 使RNA聚合酶變構 轉錄停頓 使轉錄復合物趨于解離 RNA產(chǎn)物釋放 ATP 2 依賴Rho因子的轉錄終止 相對少見 主要見于噬菌體 Rhofactor ATPaseactivityhelicaseactivity易與polyC結合 真核生物的轉錄過程TheProcessofTranscriptioninEukaryote 第三節(jié) 一 轉錄起始前的上游區(qū)段 不同物種 不同細胞或不同的基因 轉錄起始點上游可以有不同的DNA序列 但這些序列都可統(tǒng)稱為順式作用元件 cis actingelement 一 真核生物的轉錄起始過程 真核生物的轉錄起始上游區(qū)段比原核生物多樣化 轉錄起始時 RNA pol不直接結合模板 其起始過程比原核生物復雜 順式作用元件包括啟動子 啟動子上游元件 upstreampromoterelements 或promoter proximalelements 等近端調控元件和增強子 enhancer 沉默子等遠隔序列 一個典型的真核生物基因上游序列 起始點上游多數(shù)有共同的TATA序列 稱為Hognest盒或TATA盒 TATAbox TATA盒和Inr一起通常被稱為核心啟動子 TATA盒的作用在于決定轉錄的起點 序列的改變會使轉錄位點偏移 缺失TATA盒 轉錄將在許多位點上開始 TATA盒決定轉錄的效率 如雞蛋清蛋白基因啟動子的TATA變?yōu)門AGA后 轉錄效率大大下降 轉錄起始點 TATA盒 CAAT盒 GC盒 增強子 順式作用元件 cis actingelement AATAAA 切離加尾 轉錄終止點 修飾點 外顯子 翻譯起始點 內含子 OCT 1 OCT 1 ATTTGCAT八聚體 二 轉錄因子 能直接 間接辨認和結合轉錄上游區(qū)段DNA的蛋白質 現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)數(shù)百種 統(tǒng)稱為反式作用因子 trans actingfactors 反式作用因子中 直接或間接結合RNA聚合酶的 則稱為轉錄因子 transcriptionalfactors TF 或基本轉錄因子 通用轉錄因子 參與RNA pol 轉錄的TF 穩(wěn)定TF D DNA復合物 結合RNApol促進RNApol結合及作為其它因子結合的橋梁解螺旋酶 結合TF H解旋酶 作為蛋白激酶催化CTD磷酸化 三 轉錄起始前復合物 pre initiationcomplex PIC 真核生物RNA pol不與DNA分子直接結合 而需依靠眾多的轉錄因子 TF F A B 由RNA Pol 催化轉錄的PIC pre initiationcomplex H E TBP TAF TF D A B DNA復合物 TATA A B TBP TAF TATA H E PIC組裝完成 TF H解開雙螺旋并使CTD磷酸化 型基因中的四類轉錄因子 RNA聚合酶II與啟動子的結合 啟動轉錄需要多種蛋白質因子的協(xié)同作用 通常包括多種順式作用元件與反式作用因子的作用 因子和因子之間互相辨認 結合 以準確地控制基因是否轉錄 何時轉錄以及轉錄的效率 PIC的形成 四 拼板理論 piecingtheory 為了保證轉錄的準確性 不同基因需不同轉錄因子 拼板理論 piecingtheory 少數(shù)幾個反式作用因子 主要是可誘導因子和上游因子 之間互相作用 再與基本轉錄因子 RNA聚合酶搭配而有針對性地結合 轉錄相應的基因 二 轉錄延長 真核生物轉錄延長過程與原核生物大致相似 但因有核膜相隔 沒有轉錄與翻譯同步的現(xiàn)象 RNA pol前移處處都遇上核小體 轉錄延長過程中可以觀察到核小體移位和解聚現(xiàn)象 RNA Pol RNA Pol RNA Pol 核小體 轉錄延長中的核小體移位 轉錄方向 5 AAUAAA 5 AAUAAA 核酸酶 GUGUGUG RNA pol AATAAAGTGTGTG 轉錄終止的修飾點 5 5 3 3 3 加尾 AAAAAAA 3 mRNA 三 轉錄終止 和轉錄后修飾密切相關 復制與轉錄特點比較 真核生物的轉錄后修飾Post transcriptionalModification 第三節(jié) 真核生物轉錄生成的RNA分子是初級RNA轉錄物 primaryRNAtranscript 幾乎所有的初級RNA轉錄物都要經(jīng)過加工 才能成為具有功能的成熟的RNA 加工主要在細胞核中進行 幾種主要的修飾方式 1 剪接 splicing 2 剪切 cleavage 3 化學修飾 modification 4 添加 addition 5 編輯 一 真核生物hnRNA的加工包括首 尾修飾和剪接 一 hnRNA在5 末端加 帽 大多數(shù)真核mRNA的5 末端有7 甲基鳥嘌呤的帽結構 這個真核mRNA加工過程的起始步驟由兩種酶 加帽酶 cappingenzyme 和甲基轉移酶 methyltransferase 催化完成 帽子結構 5 m7GpppGp 5 pppGp 5 GpppGp 帽子結構的生成 m7Gpppm7GpppN1mp m7GpppN1mpN2mp 帽子結構功能 1 保護mRNA免受核酸酶水解 2 與帽結合蛋白質復合體結合 并參與mRNA和核糖體的結合 與翻譯起始有關 3 與mRNA向核外的轉運有關 4 增強mRNA剪接效率 尾結構 polyA加尾過程 先由核酸外切酶切去3 末端一些過剩的核苷酸 然后加入polyA 二 前體mRNA在3 端特異位點斷裂并加上多聚腺苷酸尾 多聚腺苷酸聚合酶 poly A polymerase PAP 利用polyA純化mRNA 尾功能 1 保護RNA 防止被水解 2 與翻譯起始有關 3 與mRNA向核外的轉運有關注意 并不是所有基因的轉錄產(chǎn)物都有polyA尾 斷裂基因 外顯子和內含子 why what hnRNA HOW 二次轉酯反應 三 hnRNA的剪接 TOOL snRNA 剪接體 1993年諾貝爾生理學或醫(yī)學獎得主 羅伯茨RichardJ Roberts美國貝弗莉新英格蘭生物實驗室1943年 夏普PhillipA Sharp美國麻省理工學院癌癥研究中心1944年 why 雞卵清蛋白成熟mRNA與DNA雜交電鏡圖 DNA mRNA 目錄 why 真核生物中的結構基因由若干個編碼區(qū)和非編碼區(qū)相互間隔 但又連續(xù)鑲嵌而構成 因此真核生物的結構基因稱為斷裂基因 斷裂基因 splitgene 編碼區(qū)A B C D why 外顯子在斷裂基因及其初級轉錄產(chǎn)物上出現(xiàn) 并表達為成熟RNA的核酸序列 內含子隔斷基因的線性表達而在剪接過程中被除去的核酸序列 注意 并不是所有外顯子均表達 所有內含子均不表達 why 內含子的分類 根據(jù)基因的類型和剪接的方式 通常把內含子分為4類 I 主要存在于線粒體 葉綠體及某些低等真核生物的rRNA基因 II 也發(fā)現(xiàn)于線粒體 葉綠體 轉錄產(chǎn)物是mRNA III 是常見的形成套索結構后剪接 大多數(shù)mRNA基因有此類內含子 IV 是tRNA基因及其初級轉錄產(chǎn)物中的內含子 剪接過程需酶及ATP 剪接體 spliceosome WHO 2015年8月 酵母剪接體的高分辨率結構2016年12月又陸續(xù)報道了酵母剪接體在不同工作狀態(tài)下的高分辨結構2017年5月12日 人源剪接體的原子分辨率結構 tool snRNA smallnuclearRNA 種類 U1 U2 U4 U5 U6 GUAAGU AG UACUACA 共有序列 支點序列 5 3 exons 外顯子 introns 內含子 hnRNA HOW 內含子的結構 IVS 2 654 C T 剪接突變是 地中海貧血的一種最常見的基因突變 據(jù)統(tǒng)計 1 3以上的遺傳性疾病與RNA剪接異常有關 U1snRNP與U2snRNP的識別結合 HOW SnRNP s對內含子的識別結合 branchsitesequence U1snRNA U2snRNA A 5 splicesite U1snRNP U2snRNP 3 splicesite 剪接體 U1 U2 U5 U4 U6 U4 5 3 5 5 5 3 3 3 U5 U4 U6 lariatform 套索狀結構 剪接過程 HOW 第一次轉酯反應 第二次轉酯反應 剪接的機制 二次轉酯反應 HOW 雞卵清蛋白基因 hnRNA 首 尾修飾 hnRNA剪接 成熟的mRNA 雞卵清蛋白基因及其轉錄 轉錄后修飾 選擇性剪切選擇性剪接 前體mRNA分子可發(fā)生可變剪接和可變剪切 剪接小結 對象 hnRNA 原因 工具 斷裂基因 外顯子 內含子 剪接體 snRNPs snRNA 過程 套索狀結構 機制 二次轉酯反應 三 mRNA的編輯 mRNAediting 概念 對mRNA外顯子的加工過程 mRNA