蛋白質(zhì)測定實(shí)驗(yàn)報(bào)告

蛋白質(zhì)測定方法化學(xué)報(bào)告蛋白質(zhì)的檢測 酚試劑法靈敏度較高20250mg費(fèi)時(shí)蛋白質(zhì)在堿性溶液中其肽鍵與Cu2+螯合，形成蛋白質(zhì)一銅復(fù)合物，此復(fù)合物使酚試劑的磷鉬酸還原，產(chǎn)生藍(lán)色化合物酚類、檸檬酸、硫酸銨、tris緩沖液、甘氨酸、糖類、甘油等均有干擾作用 由上表可大致了解五種檢測蛋白質(zhì)的方法，下面以實(shí)驗(yàn)的形式進(jìn)行詳細(xì)闡述：1材料與方法1.1儀器材料(1)儀器:凱氏定氮儀、紫外分光光度計(jì)、可見光分光光度計(jì)、工作離心機(jī)、布氏漏斗、抽濾泵。(2)試劑及原材料:牛奶、酸奶、豆?jié){、0.12mol/LpH=4. 7醋酸- 醋酸鈉緩沖液、乙醇-乙醚等體積混合液、濃H2SO4 、40%氫氧化鈉、30%過氧化氫、2%硼酸溶液、0. 050molPL標(biāo)準(zhǔn)鹽酸溶液、硫酸鉀- 硫酸銅接觸劑、混合指示劑、標(biāo)準(zhǔn)蛋白溶液、雙縮脲試劑、考馬斯亮藍(lán)G- 250試劑。1.2實(shí)驗(yàn)方法(1)凱氏定氮法測定蛋白質(zhì)含量將待測樣品與濃硫酸共熱,含氮有機(jī)物即分解產(chǎn)生氨(消化) ,氨又與硫酸作用,變成硫酸銨。為了加速消化,可以加入CuSO4 作催化劑和加入K2SO4 以提高溶液的沸點(diǎn),而加入30%過氧化氫有利于消化溶液的澄清。消化好的樣品在凱氏定氮儀內(nèi)經(jīng)強(qiáng)堿堿化使之分解放出氨,借蒸汽將氨蒸至定量硼酸溶液中,然后用標(biāo)準(zhǔn)鹽酸溶液進(jìn)行滴定,記錄,計(jì)算出樣品含氮量。每個(gè)樣品做三次重復(fù)測定,取平均值。(2)紫外吸收法測定蛋白質(zhì)含量蛋白質(zhì)分子中,酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸殘基的苯環(huán)含有共軛雙鍵,使蛋白質(zhì)具有吸收紫外光的性質(zhì),吸收峰在280nm處,其吸光度(即光密度值)與蛋白質(zhì)含量成正比。此外,蛋白質(zhì)溶液在238nm的光吸收值與肽鍵含量成正比。利用一定波長下,蛋白質(zhì)溶液的光吸收值與蛋白質(zhì)濃度的正比關(guān)系,可以進(jìn)行蛋白質(zhì)含量的測定。紫外吸收法簡便、靈敏、快速,不消耗樣品,測定后仍能回收使用。低濃度的鹽,例如,生化制備中常用的(NH4)2SO4 等和大多數(shù)緩沖液不干擾測定,特別適用于柱層析洗脫液的快速連續(xù)檢測,因?yàn)榇藭r(shí)只需測定蛋白質(zhì)濃度的變化,而不需知道其絕對(duì)值。 此法的特點(diǎn)是測定蛋白質(zhì)含量的準(zhǔn)確度較差,干擾物質(zhì)較多,在用標(biāo)準(zhǔn)曲線法測定蛋白質(zhì)含量時(shí),對(duì)那些與標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)中酪氨酸和色氨酸含量差異大的蛋白質(zhì)有一定的誤差,故該法適于用測定與標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)氨基酸組成相似的蛋白質(zhì)。若樣品中含有嘌呤、嘧啶及核酸等吸收紫外光的物質(zhì),會(huì)出現(xiàn)較大的干擾。核酸的干擾可以通過查校正表,再進(jìn)行計(jì)算的方法加以適當(dāng)?shù)男Ｕ５且驗(yàn)椴煌牡鞍踪|(zhì)和核酸的紫外吸收是不相同的,雖然經(jīng)過校正,測定的結(jié)果還是存在一定的誤差。此外,進(jìn)行紫外吸收法測定時(shí),由于蛋白質(zhì)吸收高峰常因pH的改變而有變化,因此要注意溶液的pH值,測定樣品時(shí)的pH要與測定標(biāo)準(zhǔn)曲線的pH相一致。取待測樣品制成蛋白濃度大約在0. 11. 0mgPmL的蛋白質(zhì)溶液,用紫外分光光度計(jì)進(jìn)行比色,對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)曲線得出樣品含氮量。每個(gè)樣品做3次重復(fù)測定,取平均值。(3)雙縮脲法測定蛋白質(zhì)含量雙縮脲(NH3CONHCONH3)是兩個(gè)分子脲經(jīng)180左右加熱,放出一個(gè)分子氨后得到的產(chǎn)物。在強(qiáng)堿性溶液中,雙縮脲與CuSO4 形成紫色絡(luò)合物,稱為雙縮脲反應(yīng)。凡具有兩個(gè)酰胺基或兩個(gè)直接連接的肽鍵,或能夠以一個(gè)中間碳原子相連的肽鍵,這類化合物都有雙縮脲反應(yīng)。紫色絡(luò)合物顏色的深淺與蛋白質(zhì)濃度成正比,而與蛋白質(zhì)分子量及氨基酸成分無關(guān),故可用來測定蛋白質(zhì)含量。 此法的優(yōu)點(diǎn)是測定較快速,不同的蛋白質(zhì)產(chǎn)生顏色的深淺相近,以及干擾物質(zhì)少;主要的缺點(diǎn)是靈敏度差。因此雙縮脲法常用于需要快速,但并不需要十分精確的蛋白質(zhì)測定。取待測樣品制成蛋白濃度大約在110mgPmL的蛋白質(zhì)溶液,加雙縮脲試劑染色30min,用可見光分光光度計(jì)進(jìn)行比色,對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)曲線得出樣品蛋白質(zhì)含量。每個(gè)樣品做3次重復(fù)測定,取平均值。(4)考馬斯亮藍(lán)法測定蛋白質(zhì)含量由于雙縮脲法(Biuret 法)存在明顯的缺點(diǎn)和許多限制,因此1976年由Bradford建立的考馬斯亮藍(lán)法(Bradford法) ,這是根據(jù)蛋白質(zhì)與染料相結(jié)合的原理設(shè)計(jì)的。這種蛋白質(zhì)測定法具有超過其他幾種方法的突出優(yōu)點(diǎn),因而正在得到廣泛的應(yīng)用。這一方法是目前靈敏度最高的蛋白質(zhì)測定法。【Bradford法的突出優(yōu)點(diǎn)是:a.靈敏度高。據(jù)估計(jì),比Lowry法約高4倍,其最低蛋白質(zhì)檢測量可達(dá)1mg。這是因?yàn)榈鞍踪|(zhì)與染料結(jié)合后產(chǎn)生的顏色變化很大,蛋白質(zhì)- 染料復(fù)合物有更高的消光系數(shù),因而光吸收值隨蛋白質(zhì)濃度的變化比Lowry法要大得多。b.測定快速、簡便,只需加一種試劑。完成一個(gè)樣品的測定,只需要5min左右。由于染料與蛋白質(zhì)結(jié)合的過程,大約只要2min即可完成,其顏色可以在1h內(nèi)保持穩(wěn)定,且在520min之間,顏色的穩(wěn)定性最好,因而完全不用像Lowry法那樣費(fèi)時(shí)和嚴(yán)格地控制時(shí)間。c. 干擾物質(zhì)少。如干擾Lowry法的、離子、Tris緩沖液、糖和蔗糖、甘油、巰基乙醇、EDTA等均不干擾此測定法。此法的缺點(diǎn)是:a.由于各種蛋白質(zhì)中的精氨酸和芳香族氨基酸的含量不同,因此Bradford法用于不同蛋白質(zhì)測定時(shí)有較大的偏差,在制作標(biāo)準(zhǔn)曲線時(shí)通常選用- 球蛋白為標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì),以減少這方面的偏差。b.仍有一些物質(zhì)干擾此法的測定,主要的干擾物質(zhì)有:去污劑、TritonX- 100、十二烷基硫酸鈉(SDS)和0. 1N的NaOH。(如同0. 1N的酸干擾Lowry法一樣) 。c.標(biāo)準(zhǔn)曲線也有輕微的非線性,因而不能用Beer定律進(jìn)行計(jì)算,而只能用標(biāo)準(zhǔn)曲線來測定未知蛋白質(zhì)的濃度。】取待測樣品加入考馬斯亮藍(lán)G- 250試劑放置5min后,用可見光分光光度計(jì)比色,對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)曲線得出樣品蛋白質(zhì)含量。每個(gè)樣品做3次重復(fù)測定,取平均值。2結(jié)果與分析2.1實(shí)驗(yàn)結(jié)果表1樣品蛋白質(zhì)含量的測定結(jié)果2.2實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析(1)凱氏定氮法可測出全部3種樣品的蛋白含量,測試結(jié)果準(zhǔn)確,只是蒸餾與吸收裝置復(fù)雜,不便于操作,實(shí)驗(yàn)過程所需時(shí)間較長,操作復(fù)雜。(2)紫外吸收法無法測出牛奶、酸奶的蛋白含量,測出的豆?jié){蛋白含量也與實(shí)際值相差較大,不具實(shí)際使用價(jià)值。此方法實(shí)驗(yàn)過程簡單,適用于測試無色樣品,對(duì)于有色樣品需進(jìn)行預(yù)處理,排除顏色干擾后才適用于此方法。(3)雙縮脲法適用于被測的3種樣品,實(shí)驗(yàn)操作簡便迅速,但其缺點(diǎn)是靈敏度較低,蛋白質(zhì)量須在120mgPmL時(shí)測定結(jié)果較準(zhǔn)確。因此實(shí)驗(yàn)前要估測被測樣品的蛋白含量,把樣品稀釋至蛋白濃度為120mgPmL。(4)考馬斯亮藍(lán)染色法可以測出被測的全部3種樣品,此方法快速、靈敏,但只有作微量蛋白測定時(shí)的結(jié)果才準(zhǔn)確,因此在實(shí)驗(yàn)前應(yīng)將樣品稀釋至蛋白濃度為0. 11mgPmL,而且實(shí)驗(yàn)必須在1h內(nèi)完成,不然測試結(jié)果不準(zhǔn)確。（5）酚試劑法原理：蛋白質(zhì)在堿性溶液中其肽鍵與Cu2+螯合，形成蛋白質(zhì)一銅復(fù)合物，此復(fù)合物使酚試劑的磷鉬酸還原，產(chǎn)生藍(lán)色化合物，在一定條件下，利用藍(lán)色深淺與蛋白質(zhì)濃度的線性關(guān)系作標(biāo)準(zhǔn)曲線并測定樣品中蛋白質(zhì)的濃度。優(yōu)點(diǎn)：操作簡便，靈敏度高，比雙縮脲法靈敏得多，樣品中蛋白質(zhì)含量高于5g即可測得，是測定蛋白質(zhì)含量應(yīng)用得最廣泛的方法之一。缺點(diǎn)：費(fèi)時(shí)間較長，要精確控制操作時(shí)間，標(biāo)準(zhǔn)曲線也不是嚴(yán)格的直線形式，且專一性較差，干擾物質(zhì)較多。對(duì)雙縮脲反應(yīng)發(fā)生干擾的離子，同樣容易干擾lowry反應(yīng)。而且對(duì)后者的影響還要大得多。酚類、檸檬酸、硫酸銨、tris緩沖液、甘氨酸、糖類、甘油等均有干擾作用。濃度較低的尿素（0.5%），硫酸納（1%），硝酸納（1%），三氯乙酸（0.5%），乙醇（5%），乙醚（5%），丙酮（0.5%）等溶液對(duì)顯色無影響，但這些物質(zhì)濃度高時(shí)，必須作校正曲線。含硫酸銨的溶液，只須加濃碳酸鈉氫氧化鈉溶液，即可顯色測定。若樣品酸度較高，顯色后會(huì)色淺，則必須提高碳酸鈉氫氧化鈉溶液的濃度12倍。適用范圍：適用于酪氨酸和色氨酸的定量測定。此法可檢測的最低蛋白質(zhì)量達(dá)5mg。通常測定范圍是20250mg個(gè)人想法蛋白質(zhì)是我們生活中不可或缺的東西，無論是各種乳制品還是一些保健產(chǎn)品，蛋白質(zhì)的含量無疑是一個(gè)受人矚目的指標(biāo)。然而，縱觀我們現(xiàn)在使用的這些蛋白質(zhì)檢測方法，很明顯的都有一個(gè)“不適合大規(guī)模檢測”的特點(diǎn)，這對(duì)于現(xiàn)在的大規(guī)模生產(chǎn)模式顯然不適用。而且，更為嚴(yán)重的是，所有的檢測方法都會(huì)受到許多其它物質(zhì)的干擾作用，之前鬧得沸沸揚(yáng)揚(yáng)的三鹿奶粉事件就是利用了凱式定氮法中的檢測漏洞（檢測時(shí)檢測的是氮元素的含量，那么，一些非來自于蛋白質(zhì)的氮就會(huì)被當(dāng)成蛋白質(zhì)中的，從而“提高”了