RNA-seq技術(shù)原理及應(yīng)用

RNA-seq技術(shù)原理及應(yīng)用,.,主要內(nèi)容,1、RNA-seq技術(shù)簡(jiǎn)介2、RNA-seq技術(shù)原理3、RNA-seq結(jié)果分析4、RNA-seq技術(shù)應(yīng)用,.,一、RNA-seq技術(shù)簡(jiǎn)介,1.誕生于20世紀(jì)70年代的Sanger法是最早被廣泛應(yīng)用的DNA測(cè)序技術(shù)，也是完成人類基因組計(jì)劃的基礎(chǔ)。2.2005年以來(lái)，以Roche公司的454技術(shù)、Illumina公司的Solexa技術(shù)和ABI公司的SOLiD技術(shù)為標(biāo)志的新一代測(cè)序技術(shù)相繼誕生，又稱作深度測(cè)序技術(shù)。3.把高通量測(cè)序技術(shù)應(yīng)用到由RNA逆轉(zhuǎn)錄生成的cDNA上，從而獲得來(lái)自不同基因的RNA片段在特定樣本中的含量，這就是RNA測(cè)序或RNA-seq。,.,二、RNA-seq技術(shù)原理,Illumina/Solexa測(cè)序技術(shù)的基本原理是邊合成邊測(cè)序，即測(cè)序過(guò)程是以DNA單鏈為模板，在生成互補(bǔ)鏈時(shí)，利用帶熒光標(biāo)記的dNTP發(fā)出不同顏色的熒光來(lái)確定不同的堿基。新加入dNTP的末端被可逆的保護(hù)基團(tuán)封閉，既保證單次反應(yīng)只能加入一個(gè)堿基，又能在該堿基讀取完畢后，將保護(hù)基團(tuán)除去，使得下一個(gè)反應(yīng)可繼續(xù)進(jìn)行。為了增加熒光強(qiáng)度，使之更易被成像系統(tǒng)所采集，該技術(shù)在測(cè)序之前還需要對(duì)待測(cè)片段做橋式擴(kuò)增。,.,ShotGun文庫(kù)構(gòu)建,簇序列讀取反應(yīng),圖像獲得和處理,序列組裝和比較,3,TTTT,TGCT,二、RNA-seq技術(shù)原理,.,二、RNA-seq技術(shù)原理,RNA-seq實(shí)驗(yàn)流程圖,.,為了便于測(cè)序數(shù)據(jù)的發(fā)布和共享，高通量測(cè)序數(shù)據(jù)以FASTQ格式來(lái)記錄所測(cè)的堿基讀段和質(zhì)量分?jǐn)?shù)。NCBI、EBI、DDBJ等數(shù)據(jù)中心建立了大容量的數(shù)據(jù)庫(kù)SRA來(lái)存放共享的測(cè)序數(shù)據(jù)。,三、RNA-seq結(jié)果分析,.,三、RNA-seq結(jié)果分析,RNA-seq數(shù)據(jù)的基本處理,.,1.序列定位算法（1）空位種子索引法：首先將讀段切分，并選取其中一段或幾段作為種子建立搜索索引，再通過(guò)查找索引、延展匹配來(lái)實(shí)現(xiàn)讀段定位，通過(guò)輪換種子考慮允許出現(xiàn)錯(cuò)配的各種可能的位置組合（Maq）。（2）Burrows-Wheeler轉(zhuǎn)換技術(shù)：通過(guò)B-W轉(zhuǎn)換將基因組序列按一定規(guī)則壓縮并建立索引，再通過(guò)查找和回溯來(lái)定位讀段，在查找時(shí)可通過(guò)堿基替代來(lái)實(shí)現(xiàn)允許的錯(cuò)配（Bowtie）。（3）改進(jìn)的SmithWaterman動(dòng)態(tài)規(guī)劃算法：隨著讀長(zhǎng)的增加，允許讀段序列中存在插入刪除(indel)的定位（BFAST、SHRiMP、Mosaik）。,三、RNA-seq結(jié)果分析,.,2.基因表達(dá)水平估計(jì)RNA-seq數(shù)據(jù)最基本的應(yīng)用是檢測(cè)基因的表達(dá)水平，與基因芯片數(shù)據(jù)相比，RNA測(cè)序得到的是數(shù)字化的表達(dá)信號(hào)，具有靈敏度高、分辨率高、無(wú)飽和區(qū)等優(yōu)勢(shì)。RNA測(cè)序數(shù)據(jù)是對(duì)提取出的RNA轉(zhuǎn)錄本中隨機(jī)進(jìn)行的短片段測(cè)序，如果一個(gè)轉(zhuǎn)錄本的豐度高，則測(cè)序后定位到其對(duì)應(yīng)的基因組區(qū)域的讀段也就多，可以通過(guò)對(duì)定位到基因外顯子區(qū)的讀段計(jì)數(shù)來(lái)估計(jì)基因表達(dá)水平。,三、RNA-seq結(jié)果分析,.,3.選擇性剪接事件識(shí)別和剪接異構(gòu)體表達(dá)水平推斷只要測(cè)序深度足夠深，就能檢測(cè)到所有轉(zhuǎn)錄本的全部序列，包括來(lái)自剪接接合區(qū)的序列。Tophat等軟件定位剪接接合區(qū)讀段的策略能標(biāo)定出剪接事件中的兩個(gè)剪接位點(diǎn)：供體位點(diǎn)和受體位點(diǎn)。通過(guò)比較供體位點(diǎn)和受體位點(diǎn)的組合，就能識(shí)別選擇性剪接事件。進(jìn)一步，通過(guò)對(duì)供體和受體位點(diǎn)的讀段計(jì)數(shù)，結(jié)合外顯子其他區(qū)域的讀段數(shù)據(jù)，還能定量地計(jì)算選擇性剪接事件之間的比例。,三、RNA-seq結(jié)果分析,.,三、RNA-seq結(jié)果分析,兩類樣本RNA-seq數(shù)據(jù)比較分析的框架,.,四、RNA-seq技術(shù)應(yīng)用,1、轉(zhuǎn)錄本結(jié)構(gòu)研究利用單堿基分辨率的RNA-Seq技術(shù)可極大地豐富基因注釋的很多方面內(nèi)容,包括5/3邊界鑒定、UTRs區(qū)域鑒定以及新的轉(zhuǎn)錄區(qū)域鑒定等。RNA-Seq還可對(duì)可變剪接(Alternativesplicing)進(jìn)行定量研究。2、轉(zhuǎn)錄本變異研究在發(fā)現(xiàn)序列差異方面，如融合基因鑒定、編碼序列多態(tài)性研究等，RNA-seq也具有很大的潛力。,.,四、RNA-seq技術(shù)應(yīng)用,3、非編碼區(qū)域功能研究轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究的一個(gè)重要方面就是發(fā)現(xiàn)和分析ncRNA，在表觀遺傳、轉(zhuǎn)錄及轉(zhuǎn)錄后等多個(gè)層面調(diào)控基因表達(dá)。4、基因表達(dá)水平研究RNA-Seq一個(gè)特別強(qiáng)大的優(yōu)勢(shì)是它可以捕捉不同組織或狀態(tài)下的轉(zhuǎn)錄組動(dòng)態(tài)變化而無(wú)需對(duì)數(shù)據(jù)集進(jìn)行復(fù)雜的標(biāo)準(zhǔn)化。,.