大學(xué)課件之食品微生物學(xué)第二章(7)

1、l 食品生境 l 微生物生態(tài)生物化學(xué)和生理學(xué)(生長、不生長、 死亡) l 微生物相互影響 l 動態(tài)與靜態(tài)相結(jié)合 l 傳統(tǒng)方法與分子方法相結(jié)合 l 慢性病的腸源性學(xué)說 第四節(jié)食品微生物的檢測與計數(shù)第四節(jié)食品微生物的檢測與計數(shù) 微生物生態(tài) 微生物標準 微生物發(fā)酵 1. Sample collection and Processing 肉與肉制品樣品的采集與制備 l 生肉及臟器檢樣：開腔后，用無菌刀取兩腿內(nèi)側(cè)肌肉各 50g；冷藏或銷售的生肉，可取肥肉或其他部位的肌肉 100g。檢樣放入無菌容器內(nèi)，立即送檢(3h)，送檢時 應(yīng)冷藏，不加防腐劑。檢樣在化驗室應(yīng)立即檢驗或放置 冰箱暫存。 l 禽類：鮮、凍

2、家禽采取整只，放無菌容器內(nèi)，處理要求 同上。 l 各類熟肉制品：熟禽采取整只，均放無菌容器內(nèi)，立即 送檢，以下處理要求同上。 1. Sample collection and Processing l 各類熟肉制品檢樣的處理 直接切取或稱取25g，以下處理同生肉。 l 臘腸、香腸等生灌腸檢樣處理 先對生灌腸表面進行消毒，用滅菌剪子取內(nèi) 容物25g，以下處理同生肉。 外界環(huán)境污染外界環(huán)境污染 l 檢驗肉禽及其制品受外界環(huán)境污染的程度或檢驗其是否帶 有某種致病菌，應(yīng)用棉拭采樣法。 l 用板孔5cm2的金屬板壓在受檢物上，將滅菌棉拭稍沾濕， 在板孔內(nèi)揩抹多次，然后將板移壓另一點，如此共移壓揩 抹10

3、次。每支棉拭在揩抹完畢后應(yīng)立即剪斷或燒斷后投入 盛有50mL滅菌水的容器中，立即送檢。 l 檢驗時按要求作10倍遞增稀釋。 l 檢驗致病菌，不必用規(guī)板，在可疑部位用棉拭掐抹即可。 2. 2. 微生物總數(shù)常用計數(shù)法微生物總數(shù)常用計數(shù)法 l 活性細胞的標準平板測定法(Standard Plate Count， SPC) l 活性和非活性細胞的直接顯微計數(shù)法（Direct Microscopic Counts，DMC) l 染色還原技術(shù)估算具有還原能力的各種細胞的總數(shù) l 最近似數(shù)測定法（Most Probable Number，MPN） 分析分析 l傳統(tǒng)微生物檢測技術(shù) l微量生化系統(tǒng)檢測 l物理方

4、法測定 l化學(xué)特征檢測 l與遺傳物質(zhì)相關(guān)的測定方法 l免疫學(xué)技術(shù) 1) 1) 傳統(tǒng)微生物檢測技術(shù)傳統(tǒng)微生物檢測技術(shù) l分離純化 l菌落計數(shù) l顯微鏡直接計數(shù) l形態(tài)學(xué)特征 l生理生化反應(yīng)特征 l API系統(tǒng)：法國bioMrieux （生物梅里埃）公司 生產(chǎn)，鑒定范圍涵蓋幾乎所有的細菌群。 l Enterotube系統(tǒng)：瑞士羅氏公司生產(chǎn)，有 15 種生 化反應(yīng)，專門鑒定腸道菌。 l Biolog 系統(tǒng)：美國安普公司生產(chǎn)，可自動化鑒定， 可鑒定 1140 種細菌。 APIAPI細菌數(shù)值鑒定系統(tǒng)細菌數(shù)值鑒定系統(tǒng) 菌種菌種 基本培養(yǎng)基 （液體） 菌懸液菌懸液 檢測、編碼、查表、鑒定檢測、編碼、查表、鑒

5、定 適用于適用于APIAPI鑒定細鑒定細 菌有菌有700700多種多種 50 CH 不同培養(yǎng)基分裝不同小槽中，同步接種，培養(yǎng)后檢 測、查表、鑒定。 在96孔的細菌培養(yǎng)板上檢測微生物對不同發(fā)酵性碳源利用 情況進行的分類鑒定。 自動化、快速自動化、快速 可鑒定細菌有可鑒定細菌有11401140多種、酵母菌多種、酵母菌267267 種、目前已經(jīng)可用于絲狀真菌。種、目前已經(jīng)可用于絲狀真菌。 每個孔中含有每個孔中含有 不同的底物不同的底物 菌懸液或無菌水菌懸液或無菌水 3) 3) 物理方法測定物理方法測定 l阻抗法 l微熱量法 l流動細菌計數(shù)器法 l放射測量法 l 微生物在培養(yǎng)過程中， 生理代謝作用使培

6、養(yǎng)基中的電惰性 物質(zhì)(大分子物質(zhì)) 轉(zhuǎn)化為電活性物質(zhì)(小分子物質(zhì))，使導(dǎo) 電性增強，電阻抗降低。 l 電導(dǎo)率隨時間的變化曲線與微生物生長曲線非常相似，原始 菌數(shù)不同，出現(xiàn)指數(shù)增長期的時間也不同，建立二者間的關(guān) 系，就能通過培養(yǎng)基電特性變化推出原始菌量。 l 用于快速檢測食品用于快速檢測食品(牛奶、牛肉等牛奶、牛肉等)、化妝品、藥品等的細菌、化妝品、藥品等的細菌 總數(shù)、大腸菌群、酵母菌、霉菌、乳酸菌數(shù)和沙門氏菌?？倲?shù)、大腸菌群、酵母菌、霉菌、乳酸菌數(shù)和沙門氏菌。 直接阻抗法直接阻抗法 l 直接阻抗法是將培養(yǎng)基裝入特制的測量管，接種后在培養(yǎng) 基中插入電極，直接測量培養(yǎng)基的電特性變化。 l 培養(yǎng)基的

7、選擇是決定檢測成敗的關(guān)鍵因素之一，它既要有 利于被測菌的繁殖與分離, 又要在檢測過程中產(chǎn)生顯著的 阻抗變化。 測定步驟測定步驟 l 測試前先根據(jù)培養(yǎng)基和所測樣品的種類設(shè)定M 值的閾值, 從 測量開始到達到閾值所需的時間定義為檢測時間(DT)。 l 1gCFU與DT呈線性關(guān)系，對每一種待測菌預(yù)先需測定CFU對 DT 值的標準曲線，測定不同樣品的DT值，對照標準曲線即 可得到CFU的數(shù)值。 l 電阻抗法能檢測出活菌量低于10cfu/mL的樣品，其靈敏度受 到溫度、緩沖體系和電極材料的安放位置的影響(測量管底 部靈敏度頂部)。 間接阻抗檢測法間接阻抗檢測法 l 某些特殊微生物的培養(yǎng)需要使用LiCl、

8、KCl等高濃度鹽。 這使培養(yǎng)基本身帶有很強的導(dǎo)電性，掩蓋了微生物代謝 產(chǎn)生的阻抗變化，因此不能用直接阻抗法分析。 l 間接阻抗檢測法是通過檢測微生物生長代謝產(chǎn)生的CO2 來反映微生物的代謝活性。 l 在阻抗測試管中加入KOH，接種后培養(yǎng)產(chǎn)生的CO2與KOH 反應(yīng)生成碳酸鹽，其導(dǎo)電性比原始溶液低，記錄測試管 中溶液的導(dǎo)電性變化即可得到微生物的信息。 微量量熱法微量量熱法 l 原理：在細菌生長的整個過程中總會有一定的 熱效應(yīng)發(fā)生，用微量熱量儀連續(xù)測定細菌生長 過程的熱量變化即可獲得細菌生長的熱譜圖， 由熱譜圖可以確定初始的菌液濃度。 細菌在細菌在2222下的產(chǎn)熱曲線下的產(chǎn)熱曲線 除溫度外，培養(yǎng)基、

9、測定方法、起始菌液濃度等都對方程有影響 流動型血球細胞計數(shù)法流動型血球細胞計數(shù)法 l 當電流接通后，位于小孔(充滿了具有電導(dǎo)性的液體)兩側(cè) 的電極產(chǎn)生穩(wěn)定的電流。當有一個細胞通過小孔時，小孔 感應(yīng)區(qū)內(nèi)的電阻增加，瞬間電壓變化產(chǎn)生一個脈沖信號。 細胞體積越大，脈沖振幅越高。 流動型血球細胞計數(shù)法流動型血球細胞計數(shù)法 l 原理：檢測器根據(jù)細胞特性如熒光性、吸光性和光散射性進 行計數(shù)，還可通過流動分類器進行分類。 蛋白染色：熒光性異硫氰酸鹽 DNA染色：丙基碘化物 每個面包酵母中含4.610-14 g DNA、1.110-11 g 蛋白質(zhì) l 流動型血球細胞計數(shù)法與熒光標記的抗體聯(lián)合 40min內(nèi)就

10、可檢測到牛乳和雞蛋中的鼠傷寒沙門氏菌，靈 敏度達103個/ml。 經(jīng)6h的非選擇性富集，牛乳中檢測限度為10個/ml，雞蛋 中為1個/ml。 4) 4) 化學(xué)特征檢測化學(xué)特征檢測 l 熱穩(wěn)定性核酸酶熱穩(wěn)定性核酸酶 l 原理：絕大多數(shù)金葡球菌菌株，特別是腸毒素生 產(chǎn)菌株可產(chǎn)凝固酶和熱穩(wěn)定性核酸酶。 l 實驗證明，熱穩(wěn)定性核酸酶是金葡球菌生長的標 志，凝固酶是產(chǎn)腸毒素菌株存在的標志。 熱穩(wěn)定性核酸酶法的優(yōu)點熱穩(wěn)定性核酸酶法的優(yōu)點 l 在細胞受熱、化學(xué)因素和病原體等因素影響時，核酸酶仍然存 在。 l 檢測熱穩(wěn)定性核酸酶比檢測腸毒素快 l當有0.34單位的熱穩(wěn)定性核酸酶存在時，表明有某種葡萄球 菌生長

11、，當細胞數(shù)達到105-106時才能檢測到核酸酶，而細胞 數(shù)106時才能檢測到腸毒素，即先產(chǎn)核酸酶后產(chǎn)腸毒素。 l 檢測時樣品不用濃縮，而檢測腸毒素需濃縮樣品。 熒光素酶測定法熒光素酶測定法 生物發(fā)光生物發(fā)光 (Bioluminescence, BL) l 細胞內(nèi)發(fā)光：如果細胞內(nèi)同時含有熒光素和熒光素酶， 則發(fā)光可在細胞內(nèi)進行，此稱細胞內(nèi)發(fā)光；此類生物 類群有細菌、單細胞動物、低等無脊椎動物、螢火蟲 和某些魚類。 l 細胞外發(fā)光：如果細胞內(nèi)僅含有熒光素或熒光素酶， 則發(fā)光必須在分別含有熒光素和熒光素酶的不同發(fā)光 細胞之分泌物相遇時才能產(chǎn)生，此稱細胞外發(fā)光。此 類生物類群有水母、介形類、高等無脊椎

12、動物和某些 魚類(冷發(fā)光)。 熒光素酶測定法原理熒光素酶測定法原理 l 原理：ATP普遍存在于一切活細胞中，熒光素酶在Mg2+存 在的條件下，與還原熒光素和ATP結(jié)合形成熒光素酶-熒光 素-單磷酸腺苷的復(fù)合物，該復(fù)合物與氧結(jié)合時發(fā)出光。 l 在反應(yīng)過程中，放出的總光量取決于熒光素酶、熒光素、 氧和ATP的濃度，當所有其它反應(yīng)物過量時，發(fā)出的總光 量和最大光強度與ATP的量成正比。 熒光素酶測定法應(yīng)用熒光素酶測定法應(yīng)用 l 此法是BL測定法中最敏感的方法， ATP方法在國外已用于 肉制品、飲料和酒類中細菌的快速檢測，已有多種檢測儀器。 目前多主張利用核苷酸激酶使ADP 轉(zhuǎn)化為ATP，使檢測靈敏

13、度進一步提高。 l 存在問題 l細菌數(shù)1104 cfu/ml 時，檢測結(jié)果不準確 l如何去除食品中非微生物產(chǎn)生的ATP l 利用該技術(shù)快速檢測微生物時，必須對非微生物ATP 進行有 選擇地萃取和水解，同時必須選擇合適的微生物ATP 萃取劑 和萃取方法。 熒光素酶發(fā)光基因熒光素酶發(fā)光基因(Lux) l 發(fā)光細菌：發(fā)光桿菌屬、弧菌屬和異短桿菌屬。 l 發(fā)光細菌菌體中的發(fā)光物質(zhì)受基因的控制，目前 已從費氏弧菌、哈氏弧菌和明亮發(fā)光桿菌等多種 發(fā)光細菌中克隆到Lux，通過轉(zhuǎn)移這些基因可使 其它微生物具有產(chǎn)生發(fā)光物質(zhì)的能力。 Lux的應(yīng)用的應(yīng)用 l 細菌主要的熒光素酶基因為luxA-E，將lux基因插 入

14、噬菌體內(nèi)，構(gòu)建重組噬菌體。當加入宿主細菌 時，含有l(wèi)ux基因的噬菌體吸附、增殖，通過增加 lux基因使宿主細胞發(fā)光。 l 檢測沙門氏菌的含量只需1h，另外可檢測腸細菌 等G-，但G+產(chǎn)生的光比G-弱100倍，此法不適用。 輻射測量法輻射測量法 l 原理：以14C標記培養(yǎng)基中的可代謝物質(zhì)為基礎(chǔ)， 微生物在利用這些物質(zhì)時有14CO2釋放，再利用放 射能計數(shù)器檢測。 l檢測能利用葡萄糖的微生物：14C-葡萄糖 l檢測不能利用葡萄糖的微生物： 14C-甲酸鹽或 14C-谷氨酸鹽 l 適用于微生物含量高的食品檢測，一般需5-6h； 而微生物含量低則時間更長。 熒光和發(fā)光法熒光和發(fā)光法 l 原理：在食品微

15、生物培養(yǎng)基中添加某種化合物， 它們被微生物產(chǎn)生的酶分解或與菌體細胞結(jié)合， 產(chǎn)生熒光基質(zhì)或發(fā)光基質(zhì)，這些物質(zhì)的含量可在 一定的波長下檢測或使菌落顯色。 l 5-Br-4-Cl-3-吲哚醛-葡萄糖醛酸(BCIG)可使大腸桿菌菌落 成藍色，而其它微生物不顯藍色。 l 氨肽酶使L-丙氨酸-p-硝基苯胺(LAPN) p-硝基苯胺，在 390nm檢測此黃色物質(zhì)的量。用于檢測G-。 l 已知有97分離出的大腸桿菌產(chǎn)生葡萄糖苷酸酶，此酶能使 葡萄糖苷酸-4-甲基傘形花烯(MUG)分解而生成熒光性甲基傘 形花酮，可用作快速檢測。 5) 與遺傳物質(zhì)相關(guān)的測定方法與遺傳物質(zhì)相關(guān)的測定方法 l GC mol% 同一種微生物，種內(nèi)各菌株間的GC mol%可相 差2.5-4.0%，大于5可認為是兩個種，大于10 可認為是不同的屬。 l 基因探針 基因組探針、cDNA探針、寡核苷酸探針 l PCR l 基因芯片 6) 免疫學(xué)技術(shù)免疫學(xué)技術(shù) l 凝集反應(yīng) l 沉淀反應(yīng) l 免疫電子顯微技術(shù) l 免疫磁珠 l 免疫標記技術(shù) l ( )是產(chǎn)腸毒素金葡球菌菌株存在的標志。 A. 熱穩(wěn)定性核酸酶 B. 溶菌酶 C. DNA