甲殼動(dòng)物酚氧化酶原激活系統(tǒng)

1、甲殼動(dòng)物酚氧化酶原激活系統(tǒng)1 概述甲殼動(dòng)物缺乏后天獲得的特異性免疫功能，但是它們有比較完善的非特異性免疫系統(tǒng)，能夠迅速識(shí)別和有效清除入侵的微生物。非特異性免疫系統(tǒng)是一種比較原始的免疫系統(tǒng)，它存在于所有多細(xì)胞生物體，是免疫防御的第一線，分為細(xì)胞免疫和體液免疫。甲殼動(dòng)物的細(xì)胞免疫包括吞噬作用、包圍化及結(jié)節(jié)的形成；體液免疫包括酚氧化酶原激活系統(tǒng)(prophenoloxidase activating system, proPO系統(tǒng))、各種凝集素及抗菌肽等。proPO系統(tǒng)是一種類似于脊椎動(dòng)物補(bǔ)體系統(tǒng)的酶級(jí)聯(lián)系統(tǒng)，在甲殼動(dòng)物的非特異性免疫系統(tǒng)中起著非常重要的作用。它由酚氧化酶(phenoloxidase

2、, PO)、酚氧化酶原(Prophenoloxidase, proPO)、絲氨酸蛋白酶(serine proteinases, SPs)、模式識(shí)別蛋白(patten recognition proteins，PRPs)和蛋白酶抑制劑(proteinase inhibitor)等構(gòu)成。該系統(tǒng)中的因子以非活化狀態(tài)存在于血顆粒細(xì)胞中，極微量的微生物多糖如 -1,3-葡聚糖(-1,3-glucans, G)、脂多糖(lipopolysaccharide, LPS)、肽聚糖(peptidoglycan , PGN)等和鈣離子、胰蛋白、SDS可激活該系統(tǒng)，使proPO 變成PO，并產(chǎn)生一系列有生理活性的物

3、質(zhì)，通過包囊與黑化作用抑制和殺死病原體，達(dá)到免疫效果。另外其在表皮硬化和傷口愈合中也發(fā)揮著重要的作用。2 proPO激活系統(tǒng)相關(guān)因子2.1 模式識(shí)別蛋白(patten recognition proteins，PRPs)無脊椎動(dòng)物行使非特異性免疫反應(yīng)首先是通過體內(nèi)特定蛋白對(duì)病原微生物表面的病原相關(guān)分子模式(pathogen- associated molecular patterns , RAMPs)，包括革蘭氏陰性菌的脂多糖(lipopolysaccharide, LPS)、革蘭氏陽性菌的肽聚糖(peptidoglycan , PGN)及真菌的-1,3-葡聚糖(-1,3-glucans, G

4、)進(jìn)行識(shí)別，這種特定蛋白就稱為模式識(shí)別蛋白(patten recognition proteins，PRPs)。PRPs包括肽聚糖識(shí)別蛋白(the peptidoglycan-recognition proteins, PGRPs)、革蘭氏陽性菌結(jié)合蛋白(Gram-negative-binding proteins, GNBPs)、-葡聚糖結(jié)合蛋白(-glucan-binding proteins, GBPs)、脂多糖和-1,3-葡聚糖結(jié)合蛋白(LPS and -1,3-glucan-binding proteins, LGBPs)、C型凝集素(C-type lectins)、Toll樣受體(

5、Toll-like receptors)。Toll樣受體雖然在脊椎動(dòng)物中作為一種模式識(shí)別受體發(fā)揮作用,但是在無脊椎動(dòng)物中這類受體并不與病原體直接接觸,而是作為一種跨膜的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)分子行使功能。通常情況下PRPs在異物入侵前位于血漿或血細(xì)胞表面，具有對(duì)多糖的親和性。當(dāng)微生物感染生物體時(shí)，PRPs 首先與微生物細(xì)胞壁上的多糖結(jié)合，然后通過與血細(xì)胞表面特異受體聯(lián)結(jié)促進(jìn)顆粒細(xì)胞擴(kuò)張，引發(fā)包裹、吞噬、proPO 系統(tǒng)級(jí)聯(lián)發(fā)應(yīng)等，實(shí)施機(jī)體的非特異性免疫反應(yīng)。2.1.1 -葡聚糖結(jié)合蛋白(-glucan-binding proteins, GBPs)1992 年，Duvic B等從淡水螯蝦(Pacifasta

6、cus leniusculus)血細(xì)胞中純化到GBP 結(jié)合蛋白，并對(duì)其部分特性進(jìn)行研究。GBP在肝胰腺轉(zhuǎn)錄，其編碼的蛋白被釋放到血淋巴中，并與-1,3-葡聚糖結(jié)合，促進(jìn)proPO系統(tǒng)的激活。從凡納濱對(duì)蝦(Litopenaeus vannamei)和中國明對(duì)蝦(Fenneropenaeus chinensis)分離獲得與淡水螯蝦(P.leniusculus)GBP相似的蛋白，其氨基酸序列與GBP相似性約為70%，被命名為GBP-HDL。GBP/GBP-HDL家族包含兩個(gè)與微生物葡聚糖酶催化域序列相似性很高的基序，但是它們不具有葡聚糖酶活性，而具有整合蛋白基序作為假定的細(xì)胞粘附位點(diǎn)。已從加州對(duì)蝦(

7、Penaeus californiensis)、細(xì)角濱對(duì)蝦(Litopenaeus stylirostris)、凡納濱對(duì)蝦(L.vannamei)和中國明對(duì)蝦(F.chinensis)分離并克隆了GBP/GBP-HDL家族基因。凡納濱對(duì)蝦(L.vannamei) GBP-HDL在肝胰腺、肌肉、游泳足和鰓中表達(dá)，在血細(xì)胞中不表達(dá)；中國明對(duì)蝦(F.chinensis) GBP-HDL在腸、肝胰腺、肌肉和鰓和血細(xì)胞中均有表達(dá)，且在感染白斑綜合癥病毒后其表達(dá)情況發(fā)生改變。盡管對(duì)蝦GBP-HDL mRNA在多種組織中均有轉(zhuǎn)錄，但GBP-HDL蛋白僅存在于血淋巴中。在-1,3-葡聚糖存在的下，分離純化的G

8、BP能夠激活加州對(duì)蝦(P.californiensis)酚氧化酶活性，因此GBP-HDL可能是對(duì)蝦proPO激活路徑中識(shí)別-1,3-葡聚糖的一種模式識(shí)別蛋白。2.1.2 脂多糖和-1,3-葡聚糖結(jié)合蛋白(LPS and -1,3-glucan-binding proteins, LGBPs)LGBPs最初從淡水螯蝦(P.leniusculus)分離獲得，與昆蟲GNBPs具有較高的同源性，LGBPs與LPS或-1,3-葡聚糖的結(jié)合能夠激活proPO系統(tǒng)。目前已克隆獲得淡水螯蝦(P.leniusculus)、凡納濱對(duì)蝦(L.vannamei)、中國明對(duì)蝦(F.chinensis)、日本囊對(duì)蝦(Ma

9、rsupenaeus japonicus)和斑節(jié)對(duì)蝦(Penaeus monodon) LGBPs基因。大多數(shù)LGBP成熟蛋白的平均分子量為39.840.2kDa，含有一個(gè)由多聚糖結(jié)合基序、葡聚糖酶基序、-葡聚糖識(shí)別基序以及兩個(gè)精氨酸-天冬氨酸-甘氨酸基序。LGBP mRNA主要在血細(xì)胞中表達(dá)，在感染白斑綜合癥病毒或革蘭氏陰性菌及其脂多糖早期中期，LGBP mRNA表達(dá)水平上調(diào)，表明LGBP是一種與免疫應(yīng)答有關(guān)的基因。2.1.3 C型凝集素(C-type lectins)C型凝集素是糖類結(jié)合蛋白，在脊椎動(dòng)物和無脊椎動(dòng)物的生物過程中具有重要作用。Changlin Chen首次在蟑螂報(bào)道了凝集素與

10、proPO系統(tǒng)的聯(lián)系，分離純化的血清凝集素能夠激活蟑螂血淋巴的proPO系統(tǒng)，并能增強(qiáng)海帶多糖對(duì)proPO系統(tǒng)的激活。在煙草天蛾發(fā)現(xiàn)了兩種C型凝集素，分別命名為IML-1和IML-2，被認(rèn)為是昆蟲血淋巴proPO系統(tǒng)激活所需要的模式識(shí)別蛋白。近期，在淡水螯蝦(P.leniusculus)證明了C型凝集素與proPO系統(tǒng)激活之間的聯(lián)系?？耸显r(Procambarus clarkii)C型凝集素PcLec2是參與proPO系統(tǒng)激活的一種模式識(shí)別蛋白，同時(shí)，淡水螯蝦(P.leniusculus)C型凝集素甘露糖結(jié)合凝集素(mannose-binding lectin, Pl- MBL)在顆粒細(xì)胞

11、中合成，在受到感染后通過胞吐作用排出，具有調(diào)節(jié)proPO系統(tǒng)的作用。已從對(duì)蝦中鑒定了一些C型凝集素并對(duì)其生化特征予以描述，但有關(guān)其在對(duì)蝦proPO系統(tǒng)激活中的潛在作用卻知之甚少。近期有研究表明，凡納濱對(duì)蝦(L.vannamei)C型凝集素能增強(qiáng)血淋巴中酚氧化酶的活性。然而，對(duì)蝦proPO系統(tǒng)激活的分子機(jī)制還有待進(jìn)一步闡明。2.2絲氨酸蛋白酶(serine proteinases, SPs)絲氨酸蛋白酶(serine proteinases, SPs)是一類以絲氨酸為活性中心的蛋白水解酶，不僅參與機(jī)體消化、胚胎發(fā)育、組織重建、細(xì)胞分化及血管形成等過程，而且在抵御病原體入侵的過程中起著非常重要的作

12、用。參與免疫反應(yīng)的SPs 通常以酶原的形式合成，儲(chǔ)存在膜泡內(nèi)或顆粒中，然后被轉(zhuǎn)運(yùn)或釋放到細(xì)胞外，通過與特異的蛋白酶結(jié)合，在其活性位點(diǎn)水解斷裂，使之活化，形成級(jí)聯(lián)反應(yīng)，并快速啟動(dòng)相應(yīng)的免疫防御系統(tǒng)，抵御病原體的感染。絲氨酸蛋白酶的活性部位都含有組氨酸、天冬氨酸和絲氨酸，形成催化三聯(lián)體。目前，已在昆蟲和甲殼動(dòng)物中發(fā)現(xiàn)了幾種參與proPO系統(tǒng)激活的SPs，它們都屬于含有發(fā)夾結(jié)構(gòu)域的絲氨酸蛋白酶 (Clip-domain serine proteinase , Clip-SPs)。 Clip-SPs通常以酶原的形式合成，其N端具有12個(gè)Clip結(jié)構(gòu)域，C端起催化作用的SP結(jié)構(gòu)域。Clip結(jié)構(gòu)域通常由3

13、755個(gè)氨基酸殘基組成，并通過3 個(gè)嚴(yán)格保守的二硫鍵相互連接，形成緊湊結(jié)構(gòu)，進(jìn)而通過2392 個(gè)氨基酸殘基與SP 結(jié)構(gòu)域連接。Clip-SPs分為具催化活性的SPs和無催化活性的SPs絲氨酸蛋白酶同源物(Clip-SP homologs, Clip-SPHs)，二者的氨基酸序列相似，但Clip-SPHs由于一個(gè)或多個(gè)催化殘基的缺失或突變導(dǎo)致其明顯缺乏酰胺酶活力(如：Clip-SPHs催化三聯(lián)體中的絲氨酸被甘氨酸取代)，目前已有文獻(xiàn)證實(shí)，SPHs在節(jié)肢動(dòng)物中參與酚氧化酶原系統(tǒng)的激活和抗微生物應(yīng)答。Rattanachai 等(2005)從日本囊對(duì)蝦中克隆到了一個(gè)SPHs 基因, 發(fā)現(xiàn)基因的表達(dá)量在

14、投喂含有肽聚糖的餌料后有顯著增加；Jitvaropas等(2009)從斑節(jié)對(duì)蝦的血淋巴細(xì)胞中克隆得到了一個(gè)SPHs 基因, 經(jīng)過分子克隆和體外表達(dá)獲得的蛋白具有細(xì)胞粘附、抑菌等生物學(xué)活性；楊燚等(2012)從中國明對(duì)蝦血細(xì)胞中克隆獲得了一個(gè)SPHs基因, 細(xì)菌和對(duì)蝦白斑綜合癥病毒(WSSV)刺激后該基因在血細(xì)胞中的表達(dá)會(huì)顯著上調(diào)。已證明，當(dāng)沒有SPHs時(shí)，proPO能夠被PAP在正確的位置裂解，但是卻不能顯現(xiàn)PO的活性。因此有人推斷，SPs和SPHs的發(fā)夾結(jié)構(gòu)域似乎對(duì)proPO的活化作用很關(guān)鍵，SPHs很可能改變了PO的構(gòu)象而導(dǎo)致其活化，但目前SPHs與PO之間的直接反應(yīng)關(guān)系還沒有被確認(rèn)。2.

15、3酚氧化酶(phenoloxidase, PO)和酚氧化酶原(Prophenoloxidase, proPO)酚氧化酶(phenoloxidase, PO)又稱為酪氨酸酶(tyrosinase)，在無脊椎動(dòng)物和脊椎動(dòng)物中都有發(fā)現(xiàn)，其活性部位是由2個(gè)銅原子(CuA和CuB)，能夠催化酚類物質(zhì)形成最終的反應(yīng)產(chǎn)物黑色素。無脊椎動(dòng)物 PO 一般以無活性狀態(tài)的proPO存在，ProPO產(chǎn)生于血淋巴中成熟的血細(xì)胞，如顆粒細(xì)胞和半顆粒細(xì)胞，經(jīng)絲氨酸蛋白酶裂解變成有活性的 PO。1996 年，Sugumaran建議：酪氨酸酶這個(gè)名字應(yīng)專門用于哺乳類，而 PO 專門用于無脊椎動(dòng)物。FujimotoK對(duì)它們進(jìn)行序

16、列分析，結(jié)果顯示它們來源于兩個(gè)相對(duì)獨(dú)立的分支，從序列相似性考慮，酪氨酸酶可能起源于軟體動(dòng)物的血藍(lán)蛋白，PO 可能起源于節(jié)肢動(dòng)物的血藍(lán)蛋白。PO能夠催化單酚羥化成二酚，并把二酚氧化成醌，醌在非酶促條件下形成最終的反應(yīng)產(chǎn)物黑色素。這些黑色素協(xié)同具有細(xì)胞毒性的醌類中間產(chǎn)物沉積到入侵的病原體周圍，起到隔離殺死病原體的作用，即所謂的黑化包被反應(yīng)。在較高等的無脊椎動(dòng)物如節(jié)肢動(dòng)物中，PO 具有多種功能，它不僅參與黑色素形成、角質(zhì)的硬化和傷口愈合，而且在宿主的防御反應(yīng)中還作為非自身識(shí)別系統(tǒng)發(fā)揮功能，在識(shí)別異物、釋放調(diào)理素(opsonin)、促進(jìn)血細(xì)胞的吞噬和包囊反應(yīng)以及促進(jìn)顆粒細(xì)胞和半顆粒細(xì)胞釋放顆粒、產(chǎn)生多

17、種介導(dǎo)凝集因子及抗菌肽等免疫功能方面發(fā)揮著重要的作用。PO活力的強(qiáng)弱與機(jī)體的免疫力直接相關(guān)，可作為衡量甲殼動(dòng)物免疫功能大小的指標(biāo)之一。目前，許多甲殼類proPO 的cDNA 序列已被克隆并測序，如羅氏沼蝦(Macrobrachium rosenbergii)、鋸緣青蟹(Scylla serrata)、短溝對(duì)蝦(Penaeus semisulcatus)、斑節(jié)對(duì)蝦(P.monodon)、凡納濱對(duì)蝦(L.vannamei)、日本囊對(duì)蝦(M.japonicus)及中國明對(duì)蝦(F.chinensis)等。甲殼動(dòng)物proPO 的cDNA序列長約2500bp，如鋸緣青蟹(S.serrata)proPO 的

18、cDNA 序列為2663 bp，南美白對(duì)蝦的為2471 bp，序列中含有高度保守的兩個(gè)銅結(jié)合位點(diǎn)，即5 個(gè)糖基化位點(diǎn)和6 個(gè)組氨酸殘基，整個(gè)序列沒有信號(hào)肽。ProPO 經(jīng)絲氨酸蛋白酶裂解轉(zhuǎn)變?yōu)榫呋钚缘腜O，一般會(huì)有一段約50 個(gè)氨基酸的肽鏈從proPO 上切除。而這個(gè)酶切位點(diǎn)及其周圍的氨基酸序列在同一物種中也是非常保守的，如淡水螯蝦(P. Leniusculus)的酶切位點(diǎn)在Arg176-Thr177，斑節(jié)對(duì)蝦(P.monodon)的酶切位點(diǎn)在Arg44- Val45。2.4血藍(lán)蛋白(hemocyanin)甲殼動(dòng)物血藍(lán)蛋白是一類含有銅離子的寡聚蛋白，起著運(yùn)送氧的重要功能。但是，最近的研究發(fā)現(xiàn)，

19、在一定條件下血藍(lán)蛋白具有PO的活性。雖然體內(nèi)血藍(lán)蛋白是否具有PO活性尚無證據(jù)，但血藍(lán)蛋白體在外添加SDS、胰蛋白酶、-1,3-葡聚糖和血細(xì)胞粗提物的混合物時(shí)能顯示PO活性。血藍(lán)蛋白和PO 雖然在結(jié)構(gòu)上有相似點(diǎn)，如兩者都是含雙銅的蛋白，這兩個(gè)銅位點(diǎn)就是它們的活性部位，且都分別與三個(gè)組氨酸殘基連在一起。但是，兩者卻有著許多不同點(diǎn)，如它們的生成器官是不同的，血藍(lán)蛋白在肝胰腺中生成，而proPO 在成熟血細(xì)胞中生成。另外，將螯蝦的PO 與血藍(lán)蛋白進(jìn)行理化特性比較發(fā)現(xiàn)，血藍(lán)蛋白的表面帶有較多的負(fù)電并較PO 的疏水性弱，血藍(lán)蛋白有信號(hào)肽，而PO 沒有信號(hào)肽。對(duì)血藍(lán)蛋白結(jié)構(gòu)的研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)血藍(lán)蛋白執(zhí)行攜氧功能

20、時(shí)，由于一些重要的氨基酸殘基的阻擋，其活性部位只允許氧分子進(jìn)入，酚類底物不能進(jìn)入。對(duì)螯蝦、黃道蟹(Cancer magister)等的研究表明，在血藍(lán)蛋白的N末端發(fā)生蛋白質(zhì)水解或?qū)被釟埢龌钚圆课皇蛊浣Y(jié)構(gòu)改變或部分展開后，血藍(lán)蛋白的銅位點(diǎn)能與更大的底物，如酚類物質(zhì)結(jié)合，從而使之具有PO功能，完成黑化。2.5 其他proPO系統(tǒng)相關(guān)因子ProPO 通過粒細(xì)胞內(nèi)小泡胞吐的形式排到血漿中，同時(shí)被胞吐外排的還有過氧素(peroxinectin)，Masquerade-like 蛋白，抗菌肽，轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶(transglutaminase, TGase)等，因而ProPO 系統(tǒng)的激活也影響了其它的

21、免疫反應(yīng)，而且這些免疫反應(yīng)之間又是彼此協(xié)調(diào)作用的。2.51 過氧素研究發(fā)現(xiàn)，過氧素是一分子量為76KDa 的蛋白，它以非活化狀態(tài)存在于成熟顆粒細(xì)胞與半顆粒細(xì)胞中，伴隨著酚氧化酶原激活系統(tǒng)的激活而活化。過氧素是甲殼動(dòng)物中發(fā)現(xiàn)的第一個(gè)黏附分子，它調(diào)節(jié)細(xì)胞間的連接，通過將外源物連到粒細(xì)胞表面特殊接收器上，使外源物成為更大的異物，包囊由此產(chǎn)生并被黑化。過氧素還具有過氧化物酶的功能和調(diào)理素的功能，同時(shí)它也是脫顆粒因子，能引起細(xì)胞的胞吐，經(jīng)過這樣的循環(huán)，proPO 被越來越多地從血細(xì)胞中排出。2.52 Masquerade-like 蛋白Masquerade-like 蛋白是一種與絲氨酸蛋白酶相似的異二聚

22、體蛋白，由分子量134KDa和129KDa兩個(gè)單位組成，它不僅具有和酵母/細(xì)菌結(jié)合的結(jié)構(gòu)域，還具有和血細(xì)胞結(jié)合的結(jié)構(gòu)域，它隨著proPO系統(tǒng)的激活自身發(fā)生水解。雖然尚不清楚其是否直接參與了proPO系統(tǒng)的激活，但它卻具有調(diào)理素（opsonin）、細(xì)胞粘連蛋白（cell adhesion protein）和模式識(shí)別蛋白的作用。2.5.3 抗菌肽抗菌肽是一種具有抗菌活性的生物短肽，廣泛存在于生物界中，在機(jī)體抵抗病原的入侵方面起著重要的作用，是缺乏特異性免疫功能生物的重要防御成分。抗菌肽經(jīng)血細(xì)胞產(chǎn)生,并儲(chǔ)存在血細(xì)胞中，在病原刺激下釋放到血淋巴。酚氧化酶原激活系統(tǒng)中的SPs即能產(chǎn)生抗菌肽。在螯蝦中，從

23、SPs前體的發(fā)夾區(qū)提取的重組肽(recombinant peptide)對(duì)革蘭氏陽性菌有活性，它在SPs前體水解時(shí)被切下，其抗菌活性可能是伴隨proPO活化而產(chǎn)生的。血藍(lán)蛋白也能產(chǎn)生抗菌肽。血藍(lán)蛋白經(jīng)限制性蛋白水解產(chǎn)生蝦紅素1(astacidin1)，這個(gè)過程在proPO與-1,3-葡聚糖、LPS等接觸時(shí)被觸發(fā)，并由一種目前尚不清楚的半胱氨酸蛋白酶完成此酶切過程。3 酚氧化酶原激活系統(tǒng)的調(diào)節(jié)因?yàn)閜roPO系統(tǒng)所產(chǎn)生的醌和黑色素本身具有毒性，如果不加以限制，對(duì)甲殼動(dòng)物自身來說也是非常不利的，因而對(duì)酚氧化酶原激活系統(tǒng)的活性調(diào)節(jié)機(jī)制也是人們研究的重要內(nèi)容。其中主要的調(diào)節(jié)方式為對(duì)proPO 激活過程的調(diào)節(jié)和SPs 活性的調(diào)節(jié)。proPO 激活過程的調(diào)節(jié)方式在于SPs 是以非活性酶原的形式存在，只有在出現(xiàn)引發(fā)物的情況下，它才