虛汗停顆粒對(duì)環(huán)磷酰胺模型大鼠免疫功能及腸道菌群的影響

1、    虛汗停顆粒對(duì)環(huán)磷酰胺模型大鼠免疫功能及腸道菌群的影響    寧娜 劉珊珊 黃秋凌 李燕舞 彭丹婷摘要 目的：探討虛汗停顆粒對(duì)環(huán)磷酰胺模型大鼠免疫功能及腸道菌群的干預(yù)作用。方法：將spf級(jí)sd大鼠隨機(jī)分為5組，分別為正常對(duì)照組、環(huán)磷酰胺模型組、虛汗停低劑量組（1.7 g/kg）、高劑量組（3.4 g/kg）、匹多莫德組（0.23 g/kg）。除正常對(duì)照組外，其他各組大鼠采用環(huán)磷酰胺腹腔注射制備免疫功能抑制模型。用流式細(xì)胞計(jì)數(shù)法檢測(cè)各組大鼠外周血淋巴細(xì)胞分類，elisa法檢測(cè)血清免疫球蛋白igg、igm及補(bǔ)體c3、c4含量，16s rdna測(cè)序檢測(cè)大

2、鼠腸道菌群變化。常規(guī)固定大鼠脾臟，he染色后光鏡下進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察。結(jié)果：環(huán)磷酰胺模型大鼠外周血淋巴細(xì)胞中cd3、cd4、cd8細(xì)胞比例明顯降低，虛汗停高劑量組及匹多莫德組對(duì)環(huán)磷酰胺模型大鼠外周血淋巴細(xì)胞中cd3細(xì)胞比例有明顯提高，其他各組均無(wú)顯著變化。模型大鼠血清中igg、igm、c4含量明顯降低，虛汗停低劑量組及匹多莫德組模型大鼠血清igg、igm含量均顯著升高。腸道菌群檢測(cè)結(jié)果顯示，模型大鼠菌群結(jié)構(gòu)與正常大鼠菌群明顯不同;藥物干預(yù)各組與模型組微生物結(jié)構(gòu)的差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均p<0.01）。結(jié)論：虛汗停顆?？梢哉{(diào)節(jié)環(huán)磷酰胺模型大鼠腸道菌群結(jié)構(gòu)，改善部分免疫功能及脾臟病理形態(tài)，體現(xiàn)了中

3、藥復(fù)方多靶點(diǎn)效應(yīng)，為臨床應(yīng)用提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。關(guān)鍵詞 虛汗停顆粒;免疫調(diào)控;環(huán)磷酰胺;匹多莫德顆粒;免疫細(xì)胞因子;16s rrna基因測(cè)序;脾臟病理形態(tài);腸道菌群effects of xuhanting granule on immune function and intestinal microflora of cyclophosphamide model ratsning na1， liu shanshan2， huang qiuling2， li yanwu3， peng danting1（1 guangzhou baiyunshan qixing pharmaceutical compa

4、ny limited， guangzhou 510530， china; 2 guangzhou baiyunshan zhongyi pharmaceutical company limited， guangzhou 510530， china; 3 guangzhou university of chinese medicine， guangzhou 510405， china）abstract objective：to explore the effect of xuhanting granules on immune function and intestinal microflora

5、 of cyclophosphamide rats. methods：a total of 50 rats were randomly divided into 5 groups：a normal control group， a cyclophosphamide model group， xuhanting low， high dose groups （1.7 g/kg， 3.4 g/kg）， and a pidotimod group （0.23g/kg）. except for the normal control group， the immunosuppressive model w

6、as established by intraperitoneal injection of cyclophosphamide. flow cytometry was used to detect the classification of peripheral blood lymphocytes of rats， and elisa method was used to detect the contents of serum immunoglobulin igg， igm and complement c3 and c4. 16s rdna sequencing was used to d

7、etect the changes of intestinal flora in rats. the spleen of rats was fixed routinely， and morphological observation was carried out under light microscope after he staining. results：the proportion of cd3， cd4 and cd8 cells in peripheral blood lymphocytes of cyclophosphamide model rats was significa

8、ntly decreased， and the proportion of cd3 cells in peripheral blood lymphocytes of rats with cyclophosphamide was significantly increased by xuhanding 3.4g/kg and pidotimod group. the contents of igg， igm and c4 in the serum of model rats were significantly decreased. the contents of igg， igm and c4

9、 in serum of model rats were significantly increased by xuhanting 1.7 g/kg and pidotimod. the results of intestinal microflora detection showed that the microflora structure of model rats was significantly different from that of normal rats， and there were significant differences in the microflora s

10、tructure between the drug intervention groups and the model group （pkeywords xuhanting granules; immunoregulation; cyclophosphamide; pidotimod granule; immune cell molecule; 16s rrna gene sequencing; pathological form of spleen; intestinal flora中圖分類號(hào)：r285.5文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2021.16

11、.009虛汗停顆粒是根據(jù)太平惠民和劑局方中記載的名方“牡蠣散”化裁而成的中成藥，可顯著改善臨床患者自汗、盜汗癥狀。實(shí)驗(yàn)研究表明虛汗停顆粒具有顯著的止汗、抗疲勞等藥理作用1-2。中醫(yī)認(rèn)為，汗證多因衛(wèi)表不固、腠理失司而致，脾居于中焦，為五臟之樞紐，脾的功能失調(diào)是汗證發(fā)生的重要原因3。免疫功能是中醫(yī)“脾”功能的部分體現(xiàn)4。傳統(tǒng)中藥以口服為主，首先與之接觸的是胃腸道，中藥進(jìn)入腸道后與腸道菌群的相互作用與機(jī)體免疫功能密切相關(guān)5，菌群變化是中藥多靶點(diǎn)效應(yīng)的切入點(diǎn)6。因此，本研究以免疫功能及腸道菌群調(diào)節(jié)為切入點(diǎn)，進(jìn)一步探討虛汗停顆粒的藥效作用。1 材料與方法1.1 材料1.1.1 動(dòng)物 選取spf級(jí)sd大鼠

12、50只，170190 g，雌雄各半，由廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，合格證號(hào)：44007200063727，許可證號(hào)：syxk（粵）2018-0001。動(dòng)物飼養(yǎng)場(chǎng)所：廣州中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心spf級(jí)大鼠飼養(yǎng)室，許可證號(hào)：syxk（粵）2013-0001。動(dòng)物福利倫理委員會(huì)批準(zhǔn)通過(guò)（倫理審批號(hào)：20190404002）。1.1.2 藥物 虛汗停顆粒（廣州白云山奇星藥業(yè)有限公司，批號(hào)：18023b），其中藥包括黃芪、浮小麥、糯稻根、煅牡蠣、大棗。匹多莫德顆粒（浙江仙琚制藥股份有限公司，批號(hào)：181232）;注射用環(huán)磷酰胺（百特國(guó)際有限公司，批號(hào)：8j266d）。1.1.3 試劑與儀器 大鼠外周血淋

13、巴細(xì)胞分離液（天津市灝洋生物制品科技有限公司，批號(hào)：2019212）;fitc anti-rat cd4抗體（biolegend，inc，美國(guó)，批號(hào)：ab_313933）;pe anti-rat cd3抗體（biolegend，inc，美國(guó)，批號(hào)：ab_2563272）;fitc anti-rat cd8a抗體（biolegend，inc，美國(guó)，批號(hào)：ab_313974）;fitc anti-rat cd161抗體（biolegend，inc，美國(guó)，批號(hào)：ab_2564547）;大鼠igg、igm、c3、c4酶聯(lián)免疫檢測(cè)試劑盒（南京建成生物工程研究所，批號(hào)：20190617）。臺(tái)式離心機(jī)（湘儀

14、，型號(hào)：tdz5-ws）。1.2 方法1.2.1 分組與模型制備 將sd大鼠隨機(jī)分為5組，每組10只。分別為正常對(duì)照組、模型對(duì)照組、匹多莫德組、虛汗停低劑量組、虛汗停高劑量組。除正常對(duì)照組外其余4組大鼠腹腔注射35 mg/（kg·d）環(huán)磷酰胺，連續(xù)3 d，正常對(duì)照組腹腔注射等體積生理鹽水。1.2.2 干預(yù)方法 造模結(jié)束后，虛汗停低、高劑量組按1.7 g/kg、3.4 g/kg灌胃，匹多莫德組按0.23 g/kg灌胃。1次/d，連續(xù)7 d。1.2.3 腸道菌群測(cè)序 末次給藥后無(wú)菌管采集新鮮大鼠糞便，液氮保存?zhèn)溆?，進(jìn)行16s rdna菌群測(cè)序分析。采用illumina hiseq測(cè)序平臺(tái)

15、，利用雙末端測(cè)序的方法，構(gòu)建小片段文庫(kù)進(jìn)行測(cè)序。通過(guò)對(duì)reads拼接過(guò)濾，otu聚類，并進(jìn)行物種注釋和豐度分析，進(jìn)一步進(jìn)行alpha多樣性分析、多樣性分析及顯著物種差異分析等。1.2.4 外周血igm、igg、補(bǔ)體c3、c4含量的檢測(cè) 腹腔靜脈取血（不抗凝）約2 ml，室溫靜置30 min，上機(jī)682×g離心，取血清，-20 保存?zhèn)溆?。采用酶?lián)免疫法檢測(cè)各組血清中igm、igg、補(bǔ)體c3、c4含量。1.2.5 外周血淋巴細(xì)胞檢測(cè) 腹腔靜脈取血（肝素鈉抗凝）5 ml，按11比例緩慢加入大鼠外周血淋巴細(xì)胞分離液（5 ml）上層，上機(jī)598×g離心;離心后吸取分離液與血漿之間的白

16、色絮狀物即外周血淋巴細(xì)胞，加入清洗液清洗淋巴細(xì)胞2次。流式細(xì)胞儀檢測(cè)cd3、cd4、cd8及nk細(xì)胞比例。1.2.6 脾臟指數(shù)及形態(tài) 稱取脾臟質(zhì)量計(jì)算脾臟指數(shù)，取部分脾臟組織固定、切片、he染色，顯微鏡下觀察脾臟形態(tài)變化。1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用spss 17.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)研究數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，計(jì)數(shù)資料用百分率表示，采用2檢驗(yàn)，計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，采用t檢驗(yàn)，以p<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。2 結(jié)果2.1 虛汗停對(duì)各組大鼠血清igm、igg、補(bǔ)體c3、c4含量的影響 結(jié)果顯示，環(huán)磷酰胺模型大鼠（模型對(duì)照組）血清中igg、igm、c4含量明顯降低，匹多莫德

17、組、虛汗停低劑量組可顯著上調(diào)模型大鼠血清igg、igm含量，對(duì)補(bǔ)體c4、c3無(wú)明顯作用。見表1。2.2 虛汗停對(duì)各組大鼠外周血淋巴細(xì)胞中cd3、cd4、cd8及nk細(xì)胞比例的影響 結(jié)果顯示，環(huán)磷酰胺模型大鼠（模型對(duì)照組）外周血淋巴細(xì)胞中cd3、cd4、cd8、nk細(xì)胞比例明顯降低。經(jīng)藥物干預(yù)，匹多莫德組及虛汗停高劑量組外周血淋巴細(xì)胞中cd3細(xì)胞比例升高，其他各組均無(wú)顯著變化。見表2。2.3 虛汗停對(duì)環(huán)磷酰胺模型大鼠腸道菌群的影響結(jié)果顯示，各組樣本物種分類在門水平上以厚壁菌門、擬桿菌門、疣微菌門、變形菌門及放線菌門為主;在屬水平各組樣本物種分類比例有所不同，其中虛汗停低、高劑量組均可增加乳酸桿菌

18、屬比例、降低擬桿菌屬比例。見圖1。alpha多樣性分析顯示，各組樣品物種多樣性及豐度差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p>0.05）。見圖2。菌屬水平采用pcoa分析顯示，模型對(duì)照組樣品的微生物組成結(jié)構(gòu)明顯偏離其他各組，采用binary jaccard法計(jì)算樣品間的距離，結(jié)果顯示藥物干預(yù)各組與模型組微生物結(jié)構(gòu)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p<0.01）。見圖3。組間樣品lefse分析顯示了不同組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的標(biāo)志性菌群：正常對(duì)照組以雙歧桿菌、瘤胃球菌、放線菌、gordonibacter、turicibacter為優(yōu)勢(shì)菌，而模型對(duì)照組以allobaculum、holdemanella、stoquefich

19、us為優(yōu)勢(shì)菌，虛汗停不同劑量干預(yù)組對(duì)菌群的干預(yù)效應(yīng)類似，優(yōu)勢(shì)菌均表現(xiàn)為cyanobacterium、catenibacterium、mitochondria、luchmannii、oxyphotobacteria等，匹多莫德干預(yù)組優(yōu)勢(shì)菌表現(xiàn)為瘤胃球菌、cyanobacterium、muribaculaccac、mitochaondria、luchmannii、turicibacter、gordonibacter等。見圖4。2.4 對(duì)脾臟指數(shù)及形態(tài)的影響 結(jié)果顯示，環(huán)磷酰胺模型大鼠（模型對(duì)照組）體質(zhì)量顯著低于正常組，脾質(zhì)量及脾臟指數(shù)（脾質(zhì)量/體質(zhì)量）無(wú)明顯變化，各藥物組干預(yù)對(duì)模型大鼠體質(zhì)量、脾質(zhì)

20、量無(wú)顯著作用。見表3。形態(tài)學(xué)觀察顯示，正常大鼠脾臟白髓發(fā)達(dá)，環(huán)磷酰胺模型大鼠脾臟淋巴細(xì)胞減少，脾小結(jié)體積變小，小結(jié)周圍有多量巨噬細(xì)胞，各藥物干預(yù)組大鼠脾小結(jié)形態(tài)及淋巴細(xì)胞數(shù)量均有所恢復(fù)。見圖5。3 討論免疫抑制是機(jī)體免疫功能受損，對(duì)抗原應(yīng)答能力下降的一種異常狀態(tài)，可表現(xiàn)出中醫(yī)“虛”的癥狀。虛汗停顆粒取自經(jīng)典名方“牡蠣散”，在原著中用于“諸虛不足，及新病暴虛，津液不固”，其中黃芪、牡蠣是其核心藥對(duì)7?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，黃芪具有調(diào)節(jié)免疫、強(qiáng)心、調(diào)節(jié)糖代謝及抗氧化等作用，黃芪多糖可提高免疫抑制小鼠腹腔巨噬細(xì)胞吞噬功能及外周血淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率8-9。牡蠣則具有保肝、抗疲勞及調(diào)節(jié)免疫功能等作用10-12

21、。本研究發(fā)現(xiàn)，環(huán)磷酰胺大鼠模型可出現(xiàn)脾臟形態(tài)受損，脾小結(jié)及淋巴細(xì)胞減少，外周血淋巴細(xì)胞cd3、cd4、cd8細(xì)胞比例明顯降低，血清中igg、igm、c4含量明顯降低等免疫力低下表現(xiàn)。虛汗停干預(yù)可顯著提高環(huán)磷酰胺模型大鼠血清中igg、igm含量，上調(diào)環(huán)磷酰胺模型大鼠外周血淋巴細(xì)胞cd3比例，同時(shí)改善模型大鼠脾臟病理形態(tài)，提示虛汗停顆粒可促進(jìn)環(huán)磷酰胺模型大鼠的免疫器官及免疫細(xì)胞功能的恢復(fù)。人體的腸道菌群及其生存的腸道環(huán)境構(gòu)成了腸道微生態(tài)，是人體最主要最復(fù)雜的微生態(tài)，其中腸道菌群占據(jù)腸道微生態(tài)的核心地位。腸道菌群與機(jī)體的免疫功能有密切的關(guān)系13。研究表明，中藥口服后在腸道內(nèi)容物中駐留的未被吸收的藥物

22、成分包括未被吸收的初生代謝產(chǎn)物和次生代謝產(chǎn)物，這些腸中移行成分可能刺激消化道內(nèi)壁，產(chǎn)生免疫應(yīng)答，或是干預(yù)和重塑腸道菌群，或是刺激菌群分泌生物活性物質(zhì)產(chǎn)生效應(yīng)14-15。中藥復(fù)方及中藥單體對(duì)腸道菌群的調(diào)節(jié)作用已成為研究熱點(diǎn)。研究表明，七味白術(shù)散不僅可促進(jìn)雙歧桿菌、乳酸菌、酵母菌等有益菌的增殖，還可促進(jìn)腸道營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的消化及吸收16;補(bǔ)肺健脾顆?？商岣咝∈竽c道內(nèi)雙歧桿菌、乳桿菌和類桿菌的豐度，有利于維持腸道內(nèi)環(huán)境平衡，增強(qiáng)人體抵抗力17;四君子湯能夠抑制有害菌、促進(jìn)有益菌增殖，恢復(fù)結(jié)腸炎大鼠的菌群平衡，促進(jìn)短鏈脂肪酸的生產(chǎn)18;補(bǔ)益類中藥（如黨參）含有皂苷類成分，這些成分可以促進(jìn)腸道內(nèi)雙歧桿菌、乳酸

23、桿菌等有益菌的生長(zhǎng)，增加腸道中乙酸的含量，抑制有害菌的定植19。本研究發(fā)現(xiàn)，虛汗停顆粒不僅可以顯著調(diào)節(jié)環(huán)磷酰胺模型大鼠腸道菌群結(jié)構(gòu)，使之趨于正常，還可以顯著增加乳酸桿菌、cyanobacterium含量。值得注意的是免疫抑制模型大鼠腸道的優(yōu)勢(shì)菌holdemanella通常是一類致病菌，會(huì)增加其他細(xì)菌的感染，可分解腸道黏液，與炎癥介質(zhì)il-6、il-1、tnf-水平正相關(guān)20。而藥物干預(yù)組（虛汗停、匹多莫德）中的優(yōu)勢(shì)菌cyanobacterium可以合成大量的次生代謝產(chǎn)物，包括具有抗菌、抗病毒、抗真菌和抗癌活性的生物化合物21。乳酸桿菌可以拮抗致病菌，有助于維持機(jī)體對(duì)抗原的細(xì)胞和體液免疫反應(yīng)22

24、。以上研究結(jié)果表明，虛汗停顆粒干預(yù)后的優(yōu)勢(shì)菌屬對(duì)于機(jī)體免疫功能有正向調(diào)節(jié)作用，可能是藥物發(fā)揮效應(yīng)的靶點(diǎn)之一。參考文獻(xiàn)1夏偉，盧磊，邱勇，等.虛汗停顆粒治療自汗盜汗臨床療效及安全性薈萃分析j.遼寧中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)，2013，15（9）：100-102.2劉聲波，朱柏華，王汝俊，等.虛汗停顆粒的藥效學(xué)研究j.中醫(yī)研究，2002，15（1）：16-18.3任士龐，張肖瑾，趙興，等.淺談?wù){(diào)脾論治小兒自汗j.亞太傳統(tǒng)醫(yī)藥，2016，12（8）：66-67.4張志勇.淺談脾臟的免疫功能j.菏澤醫(yī)學(xué)專科學(xué)校學(xué)報(bào)，1991，3（2）：20-21.5鄭華，魏秋梅，蔣健林，等.中藥與腸道菌群相互作用的研究進(jìn)展j.中

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