纖維素乙醇發(fā)酵--全

1、纖維素乙醇纖維素乙醇發(fā)酵發(fā)酵 汪吳 2010001265 鄧玲玲 2010001289 張欣 2010001290 張憶雪 2010001291 隨著化石能源的漸趨枯竭 糧食危機(jī)的不斷出現(xiàn) 能源需求不斷加大和油價(jià)持續(xù)上升等因素的影響 人們越來越認(rèn)識(shí)到尋求清潔、可再生能源的迫切性。因此，越來越多的國家已將生物質(zhì)能源產(chǎn)業(yè)作為一項(xiàng)重大的國家戰(zhàn)略推進(jìn)，紛紛投入巨資進(jìn)行生物質(zhì)能源的研發(fā)。研究背景研究背景第二代生物燃料第二代生物燃料 第二代生物燃料以秸稈、草和碎木等農(nóng)業(yè)廢棄物或非糧作物為主要原料，又被稱為纖維素乙醇，或非糧生物燃料。與第一代生物燃料對比與第一代生物燃料對比u 首先，汽車發(fā)動(dòng)機(jī)不需要改造就可

2、以直接使用摻入了生物乙醇的汽油或柴油；u 其次，生產(chǎn)第二代生物乙醇的催化酶技術(shù)未來幾年成本還將快速下降，大規(guī)模工業(yè)生產(chǎn)的可行性非常強(qiáng)；u 第三，秸稈等纖維素類農(nóng)業(yè)廢棄物大量存在，比如中國每年農(nóng)業(yè)生產(chǎn)大約產(chǎn)生7億噸秸稈，供給非常充足。我國纖維素乙醇產(chǎn)業(yè)化發(fā)展現(xiàn)狀我國纖維素乙醇產(chǎn)業(yè)化發(fā)展現(xiàn)狀 河南天冠集團(tuán)2006年6月26日，河南天冠集團(tuán)建成投產(chǎn)了我國首條秸稈乙醇中試生產(chǎn)線，標(biāo)志著我國在生物質(zhì)能源利用領(lǐng)域已躋身世界行列。目前，在河南天冠集團(tuán)，一條年產(chǎn)300t乙醇的中試生產(chǎn)線已建成投產(chǎn)，6t麥秸可變成1t乙醇。 上海華東理工大學(xué)能源化工系，承擔(dān)國家863項(xiàng)目的“農(nóng)林廢棄物制取燃料乙醇技術(shù)”研究，近年

3、已進(jìn)入工業(yè)性試驗(yàn)階段。已建成年產(chǎn)燃料乙醇600t的示范工廠，接下來的問題就是如何產(chǎn)業(yè)化。國家科技支撐計(jì)劃國家科技支撐計(jì)劃秸稈乙醇關(guān)鍵技術(shù)研究及產(chǎn)業(yè)化示范項(xiàng)目已于2008年6月上旬獲得科技部批復(fù)，列入“十一五”國家科技支撐計(jì)劃組織實(shí)施。中國科學(xué)院于2007 年12月中旬啟動(dòng)“纖維素乙醇的高溫發(fā)酵和生物煉制”重大項(xiàng)目。國外纖維素乙醇產(chǎn)業(yè)化發(fā)展現(xiàn)狀國外纖維素乙醇產(chǎn)業(yè)化發(fā)展現(xiàn)狀USA 世界的前列 1998.10第一家商業(yè)性轉(zhuǎn)化纖維質(zhì)酒精的工廠由BC International開始，以蔗渣和稻殼為原料，年產(chǎn)酒精20106加侖，成本為0.24-0.34.此外加利福尼亞和紐約城市垃圾生產(chǎn)酒精正在建設(shè)中CAN

4、ADA Iogen 使用麥稈和其他廢棄物為原料，稀酸結(jié)合蒸汽氣爆預(yù)處理技術(shù)，年產(chǎn)32萬升乙醇 SunOpta公司采用稻草、玉米秸稈、甘蔗渣等為原料生產(chǎn)各種生物轉(zhuǎn)化產(chǎn)品，如纖維質(zhì)乙醇、纖維質(zhì)丁醇、木糖醇和膳食纖維等。技術(shù)是高壓下連續(xù)氣爆處理生物質(zhì)，每小時(shí)處理原料500kg日本 全國每年有1000萬t廢木屑，不少企業(yè)利用自行開發(fā)的技術(shù)或引進(jìn)美國技術(shù)開展了以廢木屑為原料生產(chǎn)燃料乙醇的工業(yè)試驗(yàn)。2003年5月投資5億日元建成工試，目前日產(chǎn)乙醇2.50t。試成后擬建200t/d的商用裝置，成本目標(biāo)為25日元/L，將低于美國現(xiàn)有水平。 EUROPE Abengoa 是歐洲最大的乙醇生產(chǎn)廠，同時(shí)也是世界排名

5、第二的生產(chǎn)廠家，是以小麥秸稈為原料生產(chǎn)乙醇的瑞典生產(chǎn)商。目前，Abengoa 正努力建兩個(gè)生物質(zhì)乙醇廠，一個(gè)在西班牙，一個(gè)在美國，兩個(gè)都在施工過程中，他們的目標(biāo)是在2011年前使該技術(shù)商業(yè)化。瑞典Etek中試乙醇廠日產(chǎn)量400500升乙醇，每日需要消耗鋸末或其他纖維質(zhì)原料2t(以干物質(zhì)計(jì))。纖維素乙醇產(chǎn)業(yè)化亟待解決的關(guān)鍵技術(shù)纖維素乙醇產(chǎn)業(yè)化亟待解決的關(guān)鍵技術(shù)1 原料分散，季節(jié)性強(qiáng)，難以收集、運(yùn)輸，增加了成本2 原料需進(jìn)行復(fù)雜的預(yù)處理 3 纖維素酶的生產(chǎn)效率低、成本較高4 構(gòu)建能高效利用五碳糖和六碳糖的菌種國內(nèi)外預(yù)處理方法的研究動(dòng)態(tài)國內(nèi)外預(yù)處理方法的研究動(dòng)態(tài)物理化學(xué)結(jié)合法化學(xué)法物理法生物法物理法

6、液態(tài)熱水法微波和超聲波處理冷凍粉碎機(jī)械粉碎法化學(xué)法酸法堿法有機(jī)溶劑法蒸汽爆破法SO2爆破法CO2爆破法氨纖維爆破法纖維素酶的生產(chǎn)和纖維素水解技術(shù)研究纖維素酶的生產(chǎn)和纖維素水解技術(shù)研究u纖維素酶高產(chǎn)菌種的篩選和誘變育種纖維素酶高產(chǎn)菌種的篩選和誘變育種目前，用于生產(chǎn)纖維素酶的微生物大多屬于真菌。研究得較多的有木霉屬、曲霉屬、青霉屬等。其中木霉、青霉產(chǎn)生的纖維素酶活力往往最高，酶組分最全。因而應(yīng)用也最廣泛。曲霉和根霉產(chǎn)生的主要是內(nèi)切型纖維素酶，多用于紡織和造紙等纖維的表面加工。u纖維素酶生產(chǎn)技術(shù)纖維素酶生產(chǎn)技術(shù)纖維素酶的生產(chǎn)可采用液體培養(yǎng)和固體培養(yǎng)兩類方法。我國采用的固體培養(yǎng)方法包括薄層的曲盤培養(yǎng)、

7、簾子培養(yǎng)和厚層的通風(fēng)培養(yǎng)等。生產(chǎn)上常用的是厚層通風(fēng)培養(yǎng)，亦稱厚層通風(fēng)曲或箱曲，設(shè)備比較簡單，易于推廣，但容易污染雜菌，溫度和濕度不易控制，大規(guī)模生產(chǎn)難于穩(wěn)定。在美國能源部的支持下，杰能科(Genencor International)和諾維信(Novozymes AS)兩家酶制劑公司加大了研究力度，努力增加酶活和降低生產(chǎn)成本，取得了引人注目的結(jié)果。諾維信鑒定出多種新酶，配制成新的復(fù)合酶制劑，提高了酶系的降解能力，結(jié)合NREL預(yù)處理技術(shù)的進(jìn)步，使玉米秸產(chǎn)乙醇用酶的成本降至原來的130，從2001年的每加侖5美元到2005年的每加侖1018美分。通過技術(shù)進(jìn)步，杰能科的酶成本也降至原成本的130。美

8、國能源部認(rèn)為酶處理成本已不再是產(chǎn)業(yè)化的主要障礙。乙醇發(fā)酵菌種選育及發(fā)酵過程調(diào)控汪吳理想的生物質(zhì)乙醇發(fā)酵菌應(yīng)能發(fā)酵所有生物質(zhì)來源的糖，具有對木素單體、乙酸和其它抑制性副產(chǎn)物的良好抗性，并同纖維素完全水解所需的纖維素酶有協(xié)同作用。一、纖維素乙醇發(fā)酵菌種選育從自然界中篩選戊糖發(fā)酵菌種誘變育種采用原生質(zhì)體融合技術(shù)基因工程在菌種選育上的應(yīng)用木糖發(fā)酵菌株選育方法優(yōu)點(diǎn)：簡單易行，可以達(dá)到純化菌種、防止菌種衰退、穩(wěn)定生產(chǎn)、提高產(chǎn)量等目的。 缺點(diǎn)：效率低、進(jìn)展慢，很難使生產(chǎn)水平大幅度提高。自然篩選誘變育種l 化學(xué)誘變劑:硫酸二乙酯(DES)、亞硝基胍 (NTG)、亞硝酸(NA)、氮芥(NM)、羥胺等l 物理誘變

9、劑:如紫外線、X-射線、-射線、快中子、超聲波等 營養(yǎng)缺陷型菌株的篩選抗性突變株的篩選溫度敏感突變型篩選抗反饋調(diào)節(jié)突變株的篩選組成型突變株的篩選誘變育種實(shí)例樊梓鸞對熱帶假絲酵母2.402進(jìn)行紫外誘變，通過初篩、復(fù)篩，獲得一株耐酸耐乙醇的酵母菌株UV2。在pH3.5和10乙醇的培養(yǎng)基中，表現(xiàn)出良好的發(fā)酵性能。在此條件下進(jìn)行乙醇發(fā)酵試驗(yàn)，乙醇轉(zhuǎn)化率可達(dá)0.329g/g底物，同時(shí)誘變菌株與出發(fā)菌株相比，乙醇轉(zhuǎn)化率提高了28.57%。連續(xù)傳代10次發(fā)酵性能無明顯變化，表明菌株具有一定的遺傳穩(wěn)定性。原生質(zhì)體融合育種是雜交育種（基因重組）育種的一種特殊方式目前已經(jīng)實(shí)現(xiàn)了樹干畢赤酵母與釀酒酵母的屬間原生質(zhì)體

10、融合。融合子能發(fā)酵木糖產(chǎn)生酒精，其耐酒精的性能也比親株有所提高。原生質(zhì)體融合基因工程育種菌株改造策略天然底物利用策略從能夠利用廣泛底物的微生物出發(fā)，利用其本來就有的木糖、阿拉伯糖利用能力，通過基因工程技術(shù)改善其產(chǎn)物的選擇性及其它同合成產(chǎn)物相關(guān)的特性。重組菌底物利用策略則從已有很高產(chǎn)物選擇性和其它產(chǎn)物合成特性的乙醇發(fā)酵菌株出發(fā)，通過代謝工程手段賦予其利用戊糖發(fā)酵的能力。大腸桿菌等能有效地利用木質(zhì)纖維素材料的所有糖組分，對乙醇也有一定耐性(高于50 g/L)。但通常乙醇只是這些大腸桿菌產(chǎn)生的眾多產(chǎn)物之一。乙醇高產(chǎn)的關(guān)鍵在于丙酮酸脫羧酶(PDC)、醇脫氫酶(ADH)系統(tǒng)。有人將運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌編碼PD

11、C和ADH的基因(pdc和adhb)構(gòu)建成稱為PET的人造操縱子，用質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌，并實(shí)現(xiàn)了高表達(dá)，從而將丙酮酸代謝導(dǎo)向產(chǎn)生乙醇。天然底物利用策略美國國家可再生能源實(shí)驗(yàn)室(NREL)的張敏等利用復(fù)雜的克隆技術(shù)，構(gòu)建了帶有兩個(gè)獨(dú)立操縱子的雜合穿梭質(zhì)粒(pzB5)，分別編碼大腸桿菌的xylA和xylB基因，以及轉(zhuǎn)酮酶(tktA)轉(zhuǎn)醛酶(tal)基因，成功地轉(zhuǎn)化了運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌CP4菌株。重組菌利用木糖作為唯一碳源生長，能有效地轉(zhuǎn)化理論得率82%87%的木糖和葡萄糖為乙醇。重組菌底物利用策略樊梓鸞研究了高產(chǎn)乙醇酵母菌株的誘變育種篩選產(chǎn)乙醇能力強(qiáng)的出發(fā)菌株 細(xì)胞懸浮液的制備 紫外照射 繪制致死曲線，

12、確定最大正突變的照射劑量 挑選菌株影印培養(yǎng) 初篩 復(fù)篩 發(fā)酵試驗(yàn) 菌株穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 。高產(chǎn)乙醇菌種選育供試菌種：南陽酵母2.606(Saccharomyces cerevisiae)，熱帶假絲酵母2.637(Candida tropicalis)，熱帶假絲酵母2.402(Candida tropicalis)YEPD液體培養(yǎng)基:酵母膏10g/L、蛋白胨20g/L 、葡萄糖20g/L 。利用杜氏管測定三種酵母在葡萄糖發(fā)酵培養(yǎng)基和混合糖發(fā)酵培養(yǎng)基中的呼吸情況，從而確定菌株生產(chǎn)乙醇的能力A:篩選產(chǎn)乙醇能力強(qiáng)的出發(fā)菌株選取熱帶假絲酵母2.402為出發(fā)菌株B:紫外誘變誘變劑量的選擇最佳誘變時(shí)間為30s，致

13、死率為80.30%C:酵母菌一級(jí)篩選（TTC法）TTC是(2,3,5-氯化三苯基四氮唑)一種顯色劑，它能對酵母的代謝產(chǎn)物發(fā)生呈色反應(yīng)，通過它可以判斷酵母中呼吸酶活力的大小，即酵母產(chǎn)乙醇能力的高低。得到25株酵母菌，隨機(jī)編號(hào)UV1UV25誘變后菌株TTC下層平板比較菌落顏色影印平板30，24h倒入TTC上層培養(yǎng)基30，23hD:酵母菌二級(jí)篩選（杜氏小管法）（1）酵母代謝木糖和葡萄糖混合糖的馴化實(shí)驗(yàn)14株（2）酵母耐酸試驗(yàn)8株（3）酵母耐乙醇試驗(yàn)E: 酵母菌三級(jí)篩選(C02失重法)以UV2號(hào)菌株為最終發(fā)酵用菌株。F: 糖濃度對乙醇產(chǎn)率的影響G: 誘變菌株UV2的遺傳穩(wěn)定性試驗(yàn)小結(jié)：從優(yōu)良穩(wěn)定的南陽

14、酵母2.606，熱帶假絲酵母2.637和2.402中篩選出可同時(shí)糖化五碳糖和六碳糖，且乙醇產(chǎn)率較高的熱帶假絲酵母2.402進(jìn)行紫外誘變，通過初篩、復(fù)篩，獲得一株耐酸耐乙醇的酵母菌株。在pH3.5和10%乙醇的培養(yǎng)基中，表現(xiàn)出良好的發(fā)酵性能。在此條件下進(jìn)行乙醇發(fā)酵試驗(yàn)，乙醇轉(zhuǎn)化率可達(dá)0.329g/g底物，同時(shí)誘變菌株與出發(fā)菌株相比，乙醇轉(zhuǎn)化率提高了28.57%。連續(xù)傳代10次發(fā)酵性能無明顯變化，表明菌株具有一定的遺傳穩(wěn)定性。纖維素糖化發(fā)酵工藝?yán)w維素糖化發(fā)酵工藝同步糖化共發(fā)酵法（SSCF)微生物直接轉(zhuǎn)換法（CBP)同步糖化發(fā)酵法（SSF)分批補(bǔ)料技術(shù)和纖維素-淀粉共發(fā)酵水解發(fā)酵二段法（SHF)定義

15、：將纖維素先用纖維素酶糖化，再經(jīng)酵母發(fā)酵成酒精的方法。優(yōu)點(diǎn)：可以分別使用水解和發(fā)酵各自的最適條件(分別為50和30)。缺點(diǎn)：酶水解產(chǎn)生的產(chǎn)物(纖維二糖和葡萄糖)會(huì)反饋抑制水解反應(yīng)水解發(fā)酵二段法（separate hydrolysis and fermentation , SHF）SHF方法的改進(jìn)Ghose等將高產(chǎn)菌株綠色木霉QM9123的纖維素酶濃縮58倍，加入30%研磨的木質(zhì)纖維素懸浮液，在反應(yīng)器內(nèi)連續(xù)糖化，將生成的葡萄糖通過超過濾膜分離出去，從而消除產(chǎn)物抑制，提高了反應(yīng)速度，流出液的葡萄糖濃度達(dá)10%以上。但膜技術(shù)產(chǎn)業(yè)化有一定困難。纖維素酶水解和菌體酒精發(fā)酵同時(shí)進(jìn)行的方法。優(yōu)點(diǎn)：在加入纖維

16、素酶的同時(shí)接種酒精發(fā)酵的酵母，可使生成的葡萄糖立即被酵母發(fā)酵成酒精；去除了產(chǎn)物抑制，就可以不妨礙纖維素糖化的繼續(xù)進(jìn)行，酒精得率可明顯提高。關(guān)鍵：選擇最適的酵母，酶解的最適溫度約為50，而普通釀酒的最適發(fā)酵溫度通常約30。同步糖化發(fā)酵(simultaneous saccharification and fermentation, SSF)SSF實(shí)例彭林才等人以衛(wèi)生紙廠初級(jí)污泥作為生物質(zhì)原料，采用同步糖化發(fā)酵法生產(chǎn)燃料乙醇，經(jīng)過條件優(yōu)化乙醇質(zhì)量濃度達(dá)19.5g/L，是理論值的63.9%。同步糖化共發(fā)酵(simultanenous saccharification and cofermentatio

17、n, SSCF )利用能同時(shí)發(fā)酵戊糖和己糖的穩(wěn)定的基因重組菌株進(jìn)行同步共發(fā)酵。實(shí)例：在中試條件下，經(jīng)過稀酸預(yù)處理的玉米纖維在總固體物濃度為20%、纖維素酶用量為10 IFPU/g纖維素、30、150 rpm、pH 5.0條件下，使用普度大學(xué)構(gòu)建的重組酵母LNH-ST菌株進(jìn)行同步糖化共發(fā)酵4天，78.4%的可用葡萄糖和56.1%的可用木糖被轉(zhuǎn)化成乙醇。微生物直接轉(zhuǎn)化法(consolidated bioprocessing,CBP)纖維素酶的生成和乙醇發(fā)酵由一種微生物或一個(gè)微生物群體來實(shí)施。CBP需要的菌株可以通過代謝途徑工程方法構(gòu)建。實(shí)例1：Ingram等將歐文氏菌(Erwinia)的兩種內(nèi)切葡

18、聚糖酶的基因克隆到能生產(chǎn)乙醇的克雷伯氏菌(Klebsiella)中，使該菌配合真菌纖維素酶發(fā)酵纖維素產(chǎn)生的乙醇增加了22%。CPB實(shí)例2粗糙脈胞菌AS31602發(fā)酵生產(chǎn)乙醇粳糙脈孢菌(Neurospora crassa)AS3.1602具有同時(shí)產(chǎn)生纖維素酶、半纖維素酶、發(fā)酵葡萄糖和木糖的能力。張志華對N.crassa AS 3.1602好氧產(chǎn)酶和厭氧直接發(fā)酵纖維素產(chǎn)生乙醇的過程進(jìn)行了代謝分析。以20 g/L的微晶纖維素為碳源進(jìn)行產(chǎn)酶培養(yǎng)，好氧發(fā)酵3 d時(shí)，菌體處于穩(wěn)定期，F(xiàn)PA酶活、CMC酶活、-葡萄糖苷酶酶活和木聚糖酶酶活都處于較高水平。厭氧條件下直接轉(zhuǎn)化20 g/L的微晶纖維素，發(fā)酵96

19、h時(shí)乙醇濃度可以達(dá)到6.3 g/L，僅檢測到少量副產(chǎn)物乳酸和乙酸。分批補(bǔ)料技術(shù)和纖維素一淀粉共發(fā)酵山東大學(xué)利用造紙廠廢水中回收的細(xì)雜纖維進(jìn)行的酶解產(chǎn)酒精實(shí)驗(yàn)顯示，使用15 FPA IU/g纖維素的纖維素酶，起始纖維廢渣濃度10g/100 ml(已呈半固態(tài)，沒有多少游離水)，酒醪的酒度也只能達(dá)到2.5%2.7%(V/W)。在36 h時(shí)補(bǔ)加10 g纖維廢渣，不要再加纖維素酶，就可繼續(xù)發(fā)酵。最終酒度可以達(dá)到5%(V/W)左右。發(fā)酵過程調(diào)控對于不同的發(fā)酵工藝，其具體影響因素不同，影響發(fā)酵過程的主要因素有：A. 發(fā)酵溫度B. 發(fā)酵時(shí)間C. 纖維素酶用量D. 菌種接種量E. 菌液濃度F. 底物濃度實(shí)例1：

20、SSF纖維素轉(zhuǎn)化乙醇最佳工藝參數(shù)確定單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果在最優(yōu)條件下，乙醇轉(zhuǎn)化率可達(dá)0.368g/g底物，比優(yōu)化前的乙醇轉(zhuǎn)化率提高了10.60%，較出發(fā)菌株提高了36.14%。纖維素發(fā)酵生產(chǎn)乙醇工藝示意圖 葡萄糖發(fā)酵途徑葡萄糖發(fā)酵途徑EMPEMP、HMPHMP、EDED和和PKPK 由葡萄糖到形成丙酮酸的一系列反應(yīng)稱糖酵解，又稱EMP途徑。糖酵解作用一般在無氧情況下進(jìn)行，故又稱無氧分解。 用酵母使糖變?yōu)橐掖嫉墓こ谭Q為生醇發(fā)酵。酵母等能使丙酮酸脫羧成乙醛，乙醛在醇脫氫酶催化下被NADH還原成乙醇。 該過程只在pH3.54.5以及厭氧的條件下發(fā)生。當(dāng)發(fā)酵液處在堿性條件下，酵母的乙醇發(fā)酵會(huì)改為

21、甘油發(fā)酵。原因：該條件下產(chǎn)生的乙醛不能作為正常受氫體，結(jié)果2分子乙醛間發(fā)生歧化反應(yīng)，生成1分子乙醇和1分子乙酸；CH3CHO+H2O+NAD+ CH3COOH+NADH+H+CH3CHO+NADH+H+ CH3CH2OH+ NAD+ 此時(shí)也由磷酸二羥丙酮擔(dān)任受氫體接受3-磷酸甘油醛脫下的氫而生成 -磷酸甘油，后者經(jīng)-磷酸甘油酯酶催化，生成甘油。2葡萄糖葡萄糖 2甘油甘油+乙醇乙醇+乙酸乙酸+2CO2戊糖磷酸途徑（戊糖磷酸途徑（HMSHMS），約有），約有30%30%的葡萄糖可能由此途徑進(jìn)行的葡萄糖可能由此途徑進(jìn)行氧化。氧化。ED途徑途徑是少數(shù)缺乏完整EMP的微生物具有的一種替代途徑。關(guān)鍵反應(yīng)：

22、2-酮-3-脫氧-6-磷酸葡萄糖酸的裂解相關(guān)的發(fā)酵生產(chǎn)：細(xì)菌酒精發(fā)酵優(yōu)點(diǎn)：代謝速率高，產(chǎn)物轉(zhuǎn)化率高，菌體生成少，代 謝副產(chǎn)物少，發(fā)酵溫度較高，不必定期供氧。缺點(diǎn)：較易染菌；細(xì)菌對乙醇耐受力低酵母菌（在酵母菌（在pH3.5-4.5時(shí)）的乙醇發(fā)酵時(shí)）的乙醇發(fā)酵 脫羧酶脫羧酶 脫氫酶脫氫酶丙酮酸丙酮酸 乙醛乙醛 乙醇乙醇 通過通過EMP途徑途徑產(chǎn)生乙醇，總反應(yīng)式為：產(chǎn)生乙醇，總反應(yīng)式為： C6H12O6+2ADP+2Pi 2C2H5OH+2CO2+2ATP 細(xì)菌的乙醇發(fā)酵細(xì)菌的乙醇發(fā)酵通過通過ED途徑途徑產(chǎn)生乙醇，總反應(yīng)如下：產(chǎn)生乙醇，總反應(yīng)如下： 葡萄糖葡萄糖+ADP+Pi 2乙醇乙醇+2CO2+

23、ATP細(xì)菌的乙醇發(fā)酵細(xì)菌的乙醇發(fā)酵通過通過HMS途徑途徑產(chǎn)生乙醇、乳酸等，總反應(yīng)如下：產(chǎn)生乙醇、乳酸等，總反應(yīng)如下： 葡萄糖葡萄糖+ADP+Pi 乳酸乳酸+乙醇乙醇+CO2+ATP葡萄糖三條降解途徑在不同微生物中的分布葡萄糖三條降解途徑在不同微生物中的分布菌名菌名EMP（%）HMP（%）ED（%）釀酒酵母釀酒酵母8812產(chǎn)朊假絲酵母產(chǎn)朊假絲酵母66811934灰色鏈霉菌灰色鏈霉菌973產(chǎn)黃青霉產(chǎn)黃青霉7723大腸桿菌大腸桿菌7228銅綠假單胞菌銅綠假單胞菌2971嗜糖假單胞菌嗜糖假單胞菌100枯草桿菌枯草桿菌7426氧化葡萄糖桿菌氧化葡萄糖桿菌100真養(yǎng)產(chǎn)堿菌真養(yǎng)產(chǎn)堿菌100運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌運(yùn)動(dòng)

24、發(fā)酵單胞菌100藤黃八疊球菌藤黃八疊球菌7030由表可見，在微生物細(xì)胞中，有的同時(shí)存在多條由表可見，在微生物細(xì)胞中，有的同時(shí)存在多條途徑來降解葡萄糖，有的只有一種。在某一具體途徑來降解葡萄糖，有的只有一種。在某一具體條件下，擁有多條途徑的某種微生物究竟經(jīng)何種條件下，擁有多條途徑的某種微生物究竟經(jīng)何種途徑代謝，對發(fā)酵產(chǎn)物影響很大。途徑代謝，對發(fā)酵產(chǎn)物影響很大。木糖代謝途徑木糖代謝途徑傳統(tǒng)的用于發(fā)酵生產(chǎn)的微生物（傳統(tǒng)的用于發(fā)酵生產(chǎn)的微生物（釀酒酵母和運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌等釀酒酵母和運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌等）能）能很好地利用葡萄糖，且乙醇發(fā)酵率高，乙醇耐受力強(qiáng)，但均缺少利很好地利用葡萄糖，且乙醇發(fā)酵率高，乙醇耐受

25、力強(qiáng)，但均缺少利用木糖的能力。因此近些年來，人們嘗試?yán)么x工程手段改造酵用木糖的能力。因此近些年來，人們嘗試?yán)么x工程手段改造酵母菌或者細(xì)菌來發(fā)酵木糖等五碳糖生產(chǎn)酒精。母菌或者細(xì)菌來發(fā)酵木糖等五碳糖生產(chǎn)酒精。代謝工程（代謝工程（metabolic engineeringmetabolic engineering）代謝工程是基因工程的一個(gè)重要分支，利用重組DNA為主的技術(shù)，操縱酶的轉(zhuǎn)移和細(xì)胞調(diào)節(jié)功能，定向改造基因組結(jié)構(gòu)，重新設(shè)計(jì)細(xì)胞的代謝系統(tǒng)，達(dá)到生物體內(nèi)改變代謝流，擴(kuò)展代謝途徑和構(gòu)建新的代謝途徑的目的。代謝工程具體思路代謝工程具體思路1、改變代謝流1）加速速度限制反應(yīng)2）改變分支代謝途徑流

26、向3）構(gòu)建代謝旁路4）改變能量代謝途徑2、擴(kuò)展代謝途徑和構(gòu)建新的途徑1）延伸代謝途徑2）構(gòu)建新的合成途徑ACBDEFGHJIK中心代謝途徑收斂途徑發(fā)散途徑指向中心代謝途徑，并以指向中心代謝途徑，并以中心代謝途徑中間化合物中心代謝途徑中間化合物為接口的途徑。為接口的途徑。代謝網(wǎng)絡(luò)組成的途徑類型代謝網(wǎng)絡(luò)組成的途徑類型以中心代謝途徑的中間以中心代謝途徑的中間化合物為起點(diǎn)，并由中化合物為起點(diǎn)，并由中心代謝途徑向周圍分散心代謝途徑向周圍分散的途徑的途徑代謝分析中研究方法代謝分析中研究方法圖 細(xì)胞在不同水平上對基因改變和環(huán)境變化的響應(yīng)，對于不同水平上各自的高通量研究方法為分析細(xì)胞的代謝提供了大量的信息S.

27、Cerevisiae對不同氮源的吸收利用的途徑與機(jī)理對不同氮源的吸收利用的途徑與機(jī)理 谷氨酸和谷氨酰胺在氮代謝中起著重要的作用，氨、谷氨酸和谷氨酰胺之間的相互轉(zhuǎn)化被稱為氮的中間代謝途徑 (CNR)，如圖所示。 S.cerevisiae在脯氨酸作為氮源時(shí)轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)控機(jī)制在脯氨酸作為氮源時(shí)轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)控機(jī)制 吸收轉(zhuǎn)運(yùn)脯氨酸的兩個(gè)酶吸收轉(zhuǎn)運(yùn)脯氨酸的兩個(gè)酶: : Gap1p，一般氨基酸的一般氨基酸的通用的通透酶通用的通透酶 Put4p，脯氨酸脯氨酸特異性的通透酶特異性的通透酶S.CerevisiaeS.Cerevisiae以葡萄糖、甘油和乙酸為碳源條件下以葡萄糖、甘油和乙酸為碳源條件下中間代謝途徑關(guān)

28、鍵酶活分析中間代謝途徑關(guān)鍵酶活分析6-磷酸葡萄糖脫氫酶（磷酸戊糖途徑）磷酸烯醇式丙酮羧酸化激酶（糖異生途徑）丙酮酸激酶（糖酵解途徑）異檸檬酸脫氫酶；-酮戊二酸脫氫酶 （三羧酸循環(huán)）總結(jié)總結(jié) 以葡萄糖、甘油和乙酸為碳源，連續(xù)培養(yǎng)S.Cerevisiae，測量了在不同培養(yǎng)條件下中間代謝途徑一些具有代表性的酶活性。初步分析了為了適應(yīng)不同的環(huán)境胞內(nèi)代謝體系的一些主要酶活性的響應(yīng)，為代謝通量的分析提供一些基礎(chǔ)信息，實(shí)驗(yàn)結(jié)果也將結(jié)合到代謝通量的研究中。S.Cerevisiae在不同發(fā)酵階段的菌體生長、底物在不同發(fā)酵階段的菌體生長、底物消耗及部分代謝產(chǎn)物的積累與消耗情況消耗及部分代謝產(chǎn)物的積累與消耗情況S.

29、CerevisiaeS.Cerevisiae在發(fā)酵不同階段和以乳酸為碳源下的在發(fā)酵不同階段和以乳酸為碳源下的蛋白質(zhì)組解析和酶活性分析蛋白質(zhì)組解析和酶活性分析圖中第一個(gè)樣圖中第一個(gè)樣品取在葡萄糖品取在葡萄糖作碳源的對數(shù)作碳源的對數(shù)期，第二個(gè)樣期，第二個(gè)樣品取在發(fā)酵后品取在發(fā)酵后期，細(xì)胞正在期，細(xì)胞正在消耗乙醇，第消耗乙醇，第三個(gè)樣品為乳三個(gè)樣品為乳酸作為碳源酸作為碳源總結(jié)總結(jié) 通過酶活性檢測，在S.Cerevisiae利用葡萄糖為碳源的對數(shù)生長期和葡萄糖消耗盡的后期，以及利用乳酸為碳源的情況下，研究了中間代謝途徑中的一些關(guān)鍵的酶，分析了胞內(nèi)的代謝為了適應(yīng)不同的環(huán)境而作的系統(tǒng)而精細(xì)的調(diào)控，中間代謝

30、途徑中一些途徑得到強(qiáng)化和激活，一些途徑被削弱或阻斷，從而維持了細(xì)胞在不同環(huán)境下生長的需要以及能量的平衡。 展望展望 燃料乙醇是未來世界能源的主流，將改變世界能源結(jié)構(gòu)。中國應(yīng)該利用纖維素乙醇作為主要的生物能源，加快以纖維素乙醇為核心的綜合技術(shù)開發(fā)，盡早實(shí)現(xiàn)其產(chǎn)業(yè)化發(fā)展的目標(biāo)。 對于50年后生物質(zhì)生物煉制技術(shù)的發(fā)展?fàn)顩r，可以做出這樣的展望：屆時(shí)將實(shí)現(xiàn)淀粉、糖類、纖維素等生物質(zhì)原料的全部利用，產(chǎn)品多元化，形成生物質(zhì)煉制巨型行業(yè)，部分替代不可再生的一次性礦產(chǎn)資源，初步實(shí)現(xiàn)以碳水化合物為基礎(chǔ)的經(jīng)濟(jì)與社會(huì)可持續(xù)發(fā)展?？梢灶A(yù)見，在不遠(yuǎn)的未來，纖維素乙醇生產(chǎn)將會(huì)取得更大突破。主要參考文獻(xiàn)主要參考文獻(xiàn)1 Wu Y J, Ma H, Liu W W. Enhan