配位化學(xué)在細(xì)胞凋亡中的應(yīng)用

1、 報(bào)告人：張煜 導(dǎo)師：唐瑜教授配位化學(xué)在細(xì)胞凋亡中的應(yīng)用配位化學(xué)在細(xì)胞凋亡中的應(yīng)用一、細(xì)胞凋亡的簡(jiǎn)介一、細(xì)胞凋亡的簡(jiǎn)介二、文獻(xiàn)二、文獻(xiàn)三、設(shè)計(jì)思路三、設(shè)計(jì)思路四、總結(jié)四、總結(jié)配位化學(xué)在細(xì)胞凋亡中的應(yīng)用配位化學(xué)在細(xì)胞凋亡中的應(yīng)用TextTextText一、細(xì)胞凋亡的簡(jiǎn)介一、細(xì)胞凋亡的簡(jiǎn)介19721972年年KerrKerr根據(jù)細(xì)胞發(fā)生與壞死不同的死亡現(xiàn)象，提出了細(xì)胞凋亡的概念，稱為根據(jù)細(xì)胞發(fā)生與壞死不同的死亡現(xiàn)象，提出了細(xì)胞凋亡的概念，稱為ApoptosisApoptosis，宣告了對(duì)細(xì)胞凋亡的真正探索的開始。而細(xì)胞程序性死亡（宣告了對(duì)細(xì)胞凋亡的真正探索的開始。而細(xì)胞程序性死亡（programm

2、ed cell deathprogrammed cell death，PCDPCD）最）最初是初是19561956年發(fā)育生物學(xué)中提出的概念，是個(gè)功能性概念，強(qiáng)調(diào)的是其分子生物學(xué)和生理功能，年發(fā)育生物學(xué)中提出的概念，是個(gè)功能性概念，強(qiáng)調(diào)的是其分子生物學(xué)和生理功能，一般指生理性細(xì)胞死亡。描述在一個(gè)多細(xì)胞生物體中某些細(xì)胞死亡是個(gè)體發(fā)育中的一個(gè)預(yù)定的、一般指生理性細(xì)胞死亡。描述在一個(gè)多細(xì)胞生物體中某些細(xì)胞死亡是個(gè)體發(fā)育中的一個(gè)預(yù)定的、并受到嚴(yán)格程序控制的正常組成部分。在現(xiàn)在的研究中把二者作為一個(gè)意思解釋。隨著分子生并受到嚴(yán)格程序控制的正常組成部分。在現(xiàn)在的研究中把二者作為一個(gè)意思解釋。隨著分子生物學(xué)檢

3、測(cè)技術(shù)的飛速發(fā)展，近二三十年來，細(xì)胞凋亡的研究取得了重大的突破，越來越受到醫(yī)物學(xué)檢測(cè)技術(shù)的飛速發(fā)展，近二三十年來，細(xì)胞凋亡的研究取得了重大的突破，越來越受到醫(yī)學(xué)界和生物學(xué)界的普遍關(guān)注。盡管人們尚未完全掌控細(xì)胞凋亡，但是目前人們對(duì)細(xì)胞凋亡機(jī)制學(xué)界和生物學(xué)界的普遍關(guān)注。盡管人們尚未完全掌控細(xì)胞凋亡，但是目前人們對(duì)細(xì)胞凋亡機(jī)制和凋亡異常導(dǎo)致的疾病有了比較全面的認(rèn)識(shí)，并且根據(jù)細(xì)胞凋亡的不同特征，形成了不同的凋和凋亡異常導(dǎo)致的疾病有了比較全面的認(rèn)識(shí)，并且根據(jù)細(xì)胞凋亡的不同特征，形成了不同的凋亡檢測(cè)方法。這些都為人們更加深入地研究細(xì)胞凋亡奠定了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)，也為對(duì)疾病的新認(rèn)識(shí)亡檢測(cè)方法。這些都為人們更加深入

4、地研究細(xì)胞凋亡奠定了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)，也為對(duì)疾病的新認(rèn)識(shí)打下了分子生物學(xué)基礎(chǔ)。而且也為解決惡性腫瘤的醫(yī)學(xué)難題指明了新的方向。打下了分子生物學(xué)基礎(chǔ)。而且也為解決惡性腫瘤的醫(yī)學(xué)難題指明了新的方向。凋亡細(xì)胞的特征凋亡細(xì)胞的特征welcome to use these PowerPoint templates, New Content design, 10 years experience形態(tài)學(xué)特征形態(tài)學(xué)特征 細(xì)胞凋亡過程可分為三個(gè)不太明顯的階段：感應(yīng)階段、效應(yīng)階段和分解細(xì)胞凋亡過程可分為三個(gè)不太明顯的階段：感應(yīng)階段、效應(yīng)階段和分解階段。感應(yīng)階段通過死亡誘導(dǎo)信號(hào)刺激凋亡前信號(hào)大量轉(zhuǎn)變。這種死亡誘階段。感應(yīng)階

5、段通過死亡誘導(dǎo)信號(hào)刺激凋亡前信號(hào)大量轉(zhuǎn)變。這種死亡誘導(dǎo)信號(hào)包括氧化還原種類、神經(jīng)酰胺信號(hào)、導(dǎo)信號(hào)包括氧化還原種類、神經(jīng)酰胺信號(hào)、CaCa2+2+的超活化途徑和的超活化途徑和BclBcl家族家族蛋白如蛋白如BaxBax和和BadBad。在第二階段，即效應(yīng)階段，在關(guān)鍵調(diào)節(jié)器。在第二階段，即效應(yīng)階段，在關(guān)鍵調(diào)節(jié)器線粒體的線粒體的作用下，細(xì)胞開始死亡。最后的分解階段包含了細(xì)胞質(zhì)和核質(zhì)兩個(gè)部分。作用下，細(xì)胞開始死亡。最后的分解階段包含了細(xì)胞質(zhì)和核質(zhì)兩個(gè)部分。在細(xì)胞質(zhì)中一種叫在細(xì)胞質(zhì)中一種叫caspasescaspases的復(fù)合級(jí)聯(lián)蛋白被激活；在細(xì)胞核中，染色質(zhì)的復(fù)合級(jí)聯(lián)蛋白被激活；在細(xì)胞核中，染色質(zhì)濃縮

6、，核膜破裂濃縮，核膜破裂DNADNA被分解成若干小片段。最后細(xì)胞被分解成若干凋亡小被分解成若干小片段。最后細(xì)胞被分解成若干凋亡小體，在表面的磷脂酰絲氨酸被識(shí)別后被鄰近的細(xì)胞或者吞噬細(xì)胞所吞噬。體，在表面的磷脂酰絲氨酸被識(shí)別后被鄰近的細(xì)胞或者吞噬細(xì)胞所吞噬。從細(xì)胞發(fā)生凋亡開始，到出現(xiàn)凋亡小體僅需數(shù)分鐘，而被吞噬消化整個(gè)過從細(xì)胞發(fā)生凋亡開始，到出現(xiàn)凋亡小體僅需數(shù)分鐘，而被吞噬消化整個(gè)過程可持續(xù)程可持續(xù)4 49 h9 h。凋亡細(xì)胞的特征凋亡細(xì)胞的特征welcome to use these PowerPoint templates, New Content design, 10 years expe

7、rience生化特征生化特征 早期凋亡細(xì)胞及活細(xì)胞的胞膜正常，對(duì)早期凋亡細(xì)胞及活細(xì)胞的胞膜正常，對(duì)DNADNA染料碘化丙錠（染料碘化丙錠（PIPI）拒染，但）拒染，但可被另外一種可被另外一種DNADNA染料染料Hoechst 33342Hoechst 33342（Ho33342Ho33342）染色；而壞死細(xì)胞的胞）染色；而壞死細(xì)胞的胞膜完整性受到破壞，細(xì)胞不需固定即可被膜完整性受到破壞，細(xì)胞不需固定即可被PIPI染色。凋亡細(xì)胞在凋亡早期原染色。凋亡細(xì)胞在凋亡早期原來位于細(xì)胞膜內(nèi)側(cè)的磷脂酰絲氨酸（來位于細(xì)胞膜內(nèi)側(cè)的磷脂酰絲氨酸（PSPS）翻轉(zhuǎn)至磷脂雙分子層外側(cè)。凋亡）翻轉(zhuǎn)至磷脂雙分子層外側(cè)。凋亡

8、發(fā)生時(shí)線粒體呼吸鏈?zhǔn)軗p，使細(xì)胞生成發(fā)生時(shí)線粒體呼吸鏈?zhǔn)軗p，使細(xì)胞生成ATPATP的量減少；跨膜電位降低，細(xì)的量減少；跨膜電位降低，細(xì)胞色素胞色素c c從線粒體內(nèi)漏到胞質(zhì)中；線粒體膜的通透性升高。胞漿中從線粒體內(nèi)漏到胞質(zhì)中；線粒體膜的通透性升高。胞漿中CaCa2+2+和和Mg2+Mg2+濃度升高，可以激活核酸內(nèi)切酶和蛋白酶激活的核酸內(nèi)切酶可以將濃度升高，可以激活核酸內(nèi)切酶和蛋白酶激活的核酸內(nèi)切酶可以將DNADNA切成切成5050300 bp300 bp大小的大小的DNADNA，然后進(jìn)一步將染色質(zhì)裂解成單個(gè)核小體和，然后進(jìn)一步將染色質(zhì)裂解成單個(gè)核小體和寡聚核小體，形成寡聚核小體，形成1801802

9、00 bp200 bp的的DNADNA片斷。片斷。配位化學(xué)在細(xì)胞凋亡中的應(yīng)用配位化學(xué)在細(xì)胞凋亡中的應(yīng)用二、文獻(xiàn)報(bào)道二、文獻(xiàn)報(bào)道Conjugates of ferrocene with biological compounds. Coordination to gold complexes and antitumoral properties Journal of Inorganic Biochemistry 105 (2011) 13731382在這篇文獻(xiàn)中，他們合成了一系列帶有生物配體的二茂鐵配合物。并且將這些配合物和Au(I)和Au(III)結(jié)合。他們檢測(cè)了這兩個(gè)基團(tuán)的結(jié)合位點(diǎn)。而且這兩個(gè)

10、基團(tuán)結(jié)合表現(xiàn)出很好的抗癌活性。他們將金的配合物運(yùn)用到三種癌細(xì)胞中：MCF-7（人類的乳腺癌細(xì)胞）、HeLa（人類的宮頸癌細(xì)胞）和NIE-115（來源于老鼠的交感神經(jīng)囊腫神經(jīng)元細(xì)胞）。檢測(cè)這些配合物對(duì)癌細(xì)胞的作用。Scheme 1. i) L-histidine methyl ester, ii) histamine, iii) L-tryptophan methyl ester, iv) L-methionine methyl ester, v) L-lysine ethyl ester , vi) L-prolinamide.第一步、合成所需的配合物第一步、合成所需的配合物Scheme 2.

11、 i) Au(acac)(PR3), ii) Au(acac)(PR3), iii) Au(OTf)(PR3), iv) Au(C6F5)3(OEt2).第二步、基于第二步、基于MTT比色法檢測(cè)比色法檢測(cè)IC50值的實(shí)驗(yàn)值的實(shí)驗(yàn) Cells were exposed to each compound for a total of 48 h. Using the colorimetric mitochondrial function-based MTT viability assay, the IC50 values (final concentration0.5% DMSO) were cal

12、culated from dose-response curves obtained by nonlinear regression analysis. IC50 values are concentrations of drug required to inhibit tumor cell proliferation by 50%, compared to the control viability.As demonstrated by the IC50 for 48 h values listed in Table 4, the tested ferrocene bioconjugates

13、 do not show significant antiproliferative activity but the gold complexes appeared to be quite effective as cytotoxic agents against in vitro growth of various cancer cell lines.MTT比色法原理比色法原理MTT比色法是一種檢測(cè)細(xì)胞存活和生長(zhǎng)的方法。其檢測(cè)原理為活細(xì)胞線粒體中的琥珀酸脫氧酶使外源性MTT還原為水不溶性的藍(lán)紫色結(jié)晶甲瓚，并沉淀在細(xì)胞中，而死細(xì)胞無此功能。二甲亞砜（DMSO）能溶解細(xì)胞中的甲瓚。用酶聯(lián)免疫檢

14、測(cè)儀在440nm波長(zhǎng)處測(cè)定其光吸收值，可間接反映活細(xì)胞數(shù)量。MTT結(jié)晶形成量與細(xì)胞數(shù)成正比。IC50值的簡(jiǎn)介值的簡(jiǎn)介 IC50是指被抑制一半時(shí)抑制劑的濃度，這里的反應(yīng)可以是酶催化反應(yīng)，抗原抗體反應(yīng)等。在凋亡方面，可以理解為一定濃度的某種藥物誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡50%，該濃度稱為50%抑制濃度，即凋亡細(xì)胞與全部細(xì)胞數(shù)之比等于50%時(shí)所對(duì)應(yīng)的濃度，IC50值可以用來衡量藥物誘導(dǎo)凋亡的能力，即誘導(dǎo)能力越強(qiáng)，該數(shù)值越低，當(dāng)然也可以反向說明某種細(xì)胞對(duì)藥物的耐受程度。IC50 (48 h) of complexes against HeLa, MCF-7, and N1E-115 cells.IC50 (M)

15、CompoundsHeLaMCF-7N1E-11531000NTNT41000NTNT61000NTNT7321.8151.2272.28221.9451.7261.69281.6521.2542.310291.3322.5102.211181.4151.8291.713872.0882.2312.4Fig. 3. Variation of cell survival with the incubation time (complex 10).第三步、流式細(xì)胞記數(shù)法第三步、流式細(xì)胞記數(shù)法l Flow cytometry studies using double staining with Ho

16、echst 33342 and propidium iodide showed also a significative percentage of apoptotic cells after incubation of MCF-7 cells with increasing concentrations of compound 10 (10 and 50 M) for 3 and 24 h (Fig. 4 and Table 5).l The use of the molecular probe H2DCF-DA showed that incubation of MCF-7 cells w

17、ith compound 10 produced an increasing dose and time dependent amount of reactive oxygen species (ROS) (Fig. 5 and Table 6).Fig. 4. FCM of light scatter of apoptotic MCF-7 cells. Cells were incubated for 3 and 24 h with complex 10 at 10 and 50 M. a) 10 M for 3 h; b) 10 M for 24 h; c) 50 M for 3 h an

18、d d) 50 M for 24 h.Table 5Percentage of apoptotic, dead and live cells after incubation with complex 10.Complex 10 (M)Incubation time (h)ApoptoticDeadAlive10352.1047.470.182458.4441.130.2350324.5974.910.042411.3688.460.04Fig. 5. FCM of ROS production using H2DCF-DA (2,7-dichlorodihydroflurescein dia

19、cetate).a) Control (non-treated cells); b) Positive control (cells incubated with500MH2O2.Cells incubated with complex 10 for 3 and 6 h at 10 and 50 M. c) 10 M for 3 h; d) 10 M for 6 h; e) 50 M for 3 h and f) 50 M for 6 h.Table 6Production of reactive oxygen species (ROS) by MCF-7 cells incubated with comple