細(xì)胞凋亡的DNA瓊脂糖凝膠電泳

1、細(xì)胞凋亡的細(xì)胞凋亡的DNA瓊脂糖凝膠電泳瓊脂糖凝膠電泳 細(xì)胞凋亡（細(xì)胞凋亡（apoptosis/programmed cell death） 細(xì)胞凋亡是為維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定，一個(gè)由基因細(xì)胞凋亡是為維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定，一個(gè)由基因控制的主動(dòng)的有序的死亡過(guò)程，凋亡細(xì)胞將被吞控制的主動(dòng)的有序的死亡過(guò)程，凋亡細(xì)胞將被吞噬細(xì)胞吞噬。噬細(xì)胞吞噬。生物學(xué)意義：生物學(xué)意義： 確保正常發(fā)育生長(zhǎng)：清除多余的細(xì)胞確保正常發(fā)育生長(zhǎng)：清除多余的細(xì)胞 維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定：清除受損、突變、衰老的細(xì)胞維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定：清除受損、突變、衰老的細(xì)胞 積極防御功能：對(duì)病毒感染細(xì)胞阻止復(fù)制積極防御功能：對(duì)病毒感染細(xì)胞阻止復(fù)制細(xì)胞凋亡過(guò)程中的形態(tài)學(xué)改

2、變細(xì)胞凋亡過(guò)程中的形態(tài)學(xué)改變 細(xì)胞體積縮小，連接消失，與周?chē)募?xì)胞脫離。細(xì)胞體積縮小，連接消失，與周?chē)募?xì)胞脫離。 細(xì)胞質(zhì)密度增加，線粒體膜電位消失，通透性改變，釋放細(xì)胞質(zhì)密度增加，線粒體膜電位消失，通透性改變，釋放細(xì)胞色素細(xì)胞色素C到胞漿。到胞漿。 核質(zhì)濃縮，核膜核仁破碎，核質(zhì)濃縮，核膜核仁破碎，DNA降解成為約降解成為約180bp-200bp片片段。段。 凋亡小體形成。但無(wú)內(nèi)容物外溢，因此不引起周?chē)难装Y凋亡小體形成。但無(wú)內(nèi)容物外溢，因此不引起周?chē)难装Y反應(yīng)，凋亡小體可迅速被周?chē)鷮Ｂ毣蚍菍Ｂ毻淌杉?xì)胞吞噬。反應(yīng)，凋亡小體可迅速被周?chē)鷮Ｂ毣蚍菍Ｂ毻淌杉?xì)胞吞噬。 其中最重要和最具有特征性的改變是

3、其中最重要和最具有特征性的改變是Ca2+/Mg2+依賴性的核酸內(nèi)切酶的激活而導(dǎo)依賴性的核酸內(nèi)切酶的激活而導(dǎo)致染色質(zhì)致染色質(zhì)DNA在核小體連接部位斷裂，形成在核小體連接部位斷裂，形成以以180200 bp為最小單位的單體或寡聚體片為最小單位的單體或寡聚體片段。段。凋亡和壞死的區(qū)別凋亡和壞死的區(qū)別 壞死（壞死（necrosis）：壞死是細(xì)胞受到強(qiáng)烈理化或生物因素）：壞死是細(xì)胞受到強(qiáng)烈理化或生物因素作用引起細(xì)胞作用引起細(xì)胞無(wú)序變化無(wú)序變化的死亡過(guò)程。表現(xiàn)為細(xì)胞的死亡過(guò)程。表現(xiàn)為細(xì)胞 脹大，脹大，胞膜破裂，細(xì)胞內(nèi)容物外溢，核變化較慢，胞膜破裂，細(xì)胞內(nèi)容物外溢，核變化較慢，DNA降解不充降解不充分，引起

4、局部嚴(yán)重的炎癥反應(yīng)。分，引起局部嚴(yán)重的炎癥反應(yīng)。 凋亡是細(xì)胞對(duì)環(huán)境的生理性病理性刺激信號(hào)，環(huán)境條件的凋亡是細(xì)胞對(duì)環(huán)境的生理性病理性刺激信號(hào)，環(huán)境條件的變化或緩和性損傷產(chǎn)生的應(yīng)答變化或緩和性損傷產(chǎn)生的應(yīng)答有序變化有序變化的死亡過(guò)程。其細(xì)的死亡過(guò)程。其細(xì)胞及組織的變化與壞死有明顯的不同。胞及組織的變化與壞死有明顯的不同。凋亡和壞死的形態(tài)學(xué)特征凋亡和壞死的形態(tài)學(xué)特征凋凋 亡亡壞壞 死死單細(xì)胞或一小群細(xì)胞單細(xì)胞或一小群細(xì)胞相鄰的細(xì)胞團(tuán)相鄰的細(xì)胞團(tuán)細(xì)胞皺縮和卷積細(xì)胞皺縮和卷積細(xì)胞腫脹細(xì)胞腫脹核固縮和和碎裂核固縮和和碎裂核溶解核溶解完整的細(xì)胞膜完整的細(xì)胞膜破壞的細(xì)胞膜破壞的細(xì)胞膜細(xì)胞質(zhì)保留在凋亡小體細(xì)胞質(zhì)

5、保留在凋亡小體細(xì)胞質(zhì)釋放細(xì)胞質(zhì)釋放無(wú)炎癥無(wú)炎癥一般都存在炎癥一般都存在炎癥實(shí)驗(yàn)原理實(shí)驗(yàn)原理 本實(shí)驗(yàn)是利用瓊脂糖凝膠電泳分析小鼠胸腺細(xì)胞本實(shí)驗(yàn)是利用瓊脂糖凝膠電泳分析小鼠胸腺細(xì)胞DNA在地塞米松誘導(dǎo)下細(xì)胞的凋亡現(xiàn)象。凋亡細(xì)在地塞米松誘導(dǎo)下細(xì)胞的凋亡現(xiàn)象。凋亡細(xì)胞染色質(zhì)胞染色質(zhì)DNA在核小體連接處斷裂，形成在核小體連接處斷裂，形成180-200 bp或其整倍數(shù)的寡核苷酸片段，在凝膠電泳上表或其整倍數(shù)的寡核苷酸片段，在凝膠電泳上表現(xiàn)為梯狀電泳圖譜現(xiàn)為梯狀電泳圖譜(DNA ladder)，而壞死細(xì)胞或凋，而壞死細(xì)胞或凋亡后期的繼發(fā)性壞死細(xì)胞亡后期的繼發(fā)性壞死細(xì)胞DNA電泳后則成模糊的電泳后則成模糊的“

6、涂片狀涂片狀” 。材材 料料1. 凋亡細(xì)胞：經(jīng)地塞米松誘導(dǎo)的小鼠胸腺細(xì)胞凋亡細(xì)胞：經(jīng)地塞米松誘導(dǎo)的小鼠胸腺細(xì)胞2. 提取提取DNA：基因組：基因組DNA抽提試劑盒（抽提試劑盒（RNA酶、酶、蛋白酶蛋白酶K、懸浮液、裂解液、洗滌液、洗脫液、懸浮液、裂解液、洗滌液、洗脫液、DNA ladder 標(biāo)準(zhǔn)品等）標(biāo)準(zhǔn)品等）3. DNA電泳：電泳：1 %的瓊脂糖凝膠、點(diǎn)樣緩沖液的瓊脂糖凝膠、點(diǎn)樣緩沖液4. 實(shí)驗(yàn)器材：實(shí)驗(yàn)器材：1.5mlEP管、吸附柱、收集管、臺(tái)式管、吸附柱、收集管、臺(tái)式高速離心機(jī)、高速離心機(jī)、65水浴箱、瓊脂糖凝膠電泳裝置、水浴箱、瓊脂糖凝膠電泳裝置、紫外透射儀紫外透射儀 方方 法法一、胸

7、腺細(xì)胞的制備：一、胸腺細(xì)胞的制備： 小鼠摘眼球并斷椎處死，取胸腺，浸入含小鼠摘眼球并斷椎處死，取胸腺，浸入含510%小牛血清的小牛血清的1640培養(yǎng)液中，置銅網(wǎng)上研磨，培養(yǎng)液中，置銅網(wǎng)上研磨，將研磨好的細(xì)胞懸液用尼龍網(wǎng)過(guò)濾。將研磨好的細(xì)胞懸液用尼龍網(wǎng)過(guò)濾。2000rpm，離心離心5min，制成，制成1107細(xì)胞懸液備用。細(xì)胞懸液備用。二、提取胸腺細(xì)胞二、提取胸腺細(xì)胞DNA：裂解細(xì)胞階段（使用到的試劑：裂解液裂解細(xì)胞階段（使用到的試劑：裂解液=L液、液、RNaseA/蛋白酶蛋白酶K液液=A液）液） 將細(xì)胞離心后小心倒出液體，離心管中加入將細(xì)胞離心后小心倒出液體，離心管中加入100lL液和液和20

8、lA液，充分混勻，置于液，充分混勻，置于55溫浴溫浴20分鐘，其間來(lái)回顛倒離心管分鐘，其間來(lái)回顛倒離心管3-5次。次。(2) 結(jié)合結(jié)合DNA階段階段(使用到的試劑使用到的試劑: 結(jié)合緩沖液結(jié)合緩沖液=B液、液、3MNaAC, pH4.8) 加入加入10l 3MNaAC，隨后加入，隨后加入1250l B液，充分液，充分振蕩混合均勻（重要！），振蕩混合均勻（重要?。?，12000rpm離心離心3min。將上清分將上清分2次加入到離心吸附管。靜置次加入到離心吸附管。靜置1分鐘，分鐘，12000rpm離心離心30s，倒掉收集管中廢液。第二次，倒掉收集管中廢液。第二次同上，靜置同上，靜置1分鐘，離心分鐘，

9、離心30s。(3)漂洗階段（使用試劑：漂洗階段（使用試劑：600ul漂洗緩沖液漂洗緩沖液2=W液）液） 倒掉收集管中的廢液，再加入倒掉收集管中的廢液，再加入600ulW液，液，12000rpm離心離心30秒。秒。 重復(fù)上敘步驟，再次加入重復(fù)上敘步驟，再次加入600 ulW液，液，12000rpm離心離心30秒。秒。 倒掉廢液，再次倒掉廢液，再次12000rpm離心離心30秒。秒。(4) 洗脫收獲（使用試劑：洗脫收獲（使用試劑：50l洗脫緩沖液洗脫緩沖液=T液）液） 小心取出離心吸附柱（不可沾上小心取出離心吸附柱（不可沾上W液，因其中含液，因其中含有乙醇，會(huì)使提取有乙醇，會(huì)使提取DNA變性），將

10、其套入一個(gè)干變性），將其套入一個(gè)干凈的凈的1.5ml eppendorf管中，沿吸附柱的正中間小管中，沿吸附柱的正中間小心加入心加入50l T液，靜置液，靜置1分鐘后，于分鐘后，于12000rpm離心離心1min。Eppendorf管中便是收集到的基因組管中便是收集到的基因組DNA, 取取10l電泳。電泳。三、三、DNA瓊脂糖凝膠電泳：瓊脂糖凝膠電泳：(5)制板制板: 將將1 %的瓊脂糖凝膠加熱溶化，取的瓊脂糖凝膠加熱溶化，取20ml倒倒板板, 待凝待凝, 取梳。置板于電泳槽中，加電泳緩沖液取梳。置板于電泳槽中，加電泳緩沖液至淹沒(méi)過(guò)膠。至淹沒(méi)過(guò)膠。(6) 加樣：取加樣：取50 uL DNA樣品

11、與樣品與10uL點(diǎn)樣緩沖液點(diǎn)樣緩沖液,混混勻勻, 10ul/孔。（孔。（DNA marker 直接加樣，直接加樣，5 ul/孔）?？祝?。(7) 電泳：點(diǎn)樣孔置負(fù)極，電壓電泳：點(diǎn)樣孔置負(fù)極，電壓80-100V，電泳至，電泳至溴酚蘭移出溴酚蘭移出2/3距離時(shí)，關(guān)閉電源。距離時(shí)，關(guān)閉電源。(8) 觀察：取出凝膠板，置紫外透射儀上，可見(jiàn)綠觀察：取出凝膠板，置紫外透射儀上，可見(jiàn)綠色色DNA區(qū)帶。區(qū)帶。注意事項(xiàng)：注意事項(xiàng)：a 步驟步驟2中，加入中，加入B液后一定要充分混勻。離心后，液后一定要充分混勻。離心后，小心取出上清，小心取出上清，Tips頭不可吸附上白色沉淀（為頭不可吸附上白色沉淀（為基因組蛋白）。

12、基因組蛋白）。b 漂洗階段（步驟漂洗階段（步驟3）一定要離心充分去除漂洗緩）一定要離心充分去除漂洗緩沖液，可適當(dāng)將離心時(shí)間延長(zhǎng)。沖液，可適當(dāng)將離心時(shí)間延長(zhǎng)。c 洗脫緩沖液一定要保證加入到吸附柱中央。洗脫緩沖液一定要保證加入到吸附柱中央。結(jié)果觀察結(jié)果觀察 加地塞米松培養(yǎng)的胸腺細(xì)胞加地塞米松培養(yǎng)的胸腺細(xì)胞DNA電泳后呈典型電泳后呈典型的的“階梯狀階梯狀”條帶。未加地塞米松培養(yǎng)的胸腺條帶。未加地塞米松培養(yǎng)的胸腺細(xì)胞，細(xì)胞，DNA無(wú)類似改變。細(xì)胞壞死對(duì)照的無(wú)類似改變。細(xì)胞壞死對(duì)照的DNA電泳呈現(xiàn)彌漫的片狀圖譜。電泳呈現(xiàn)彌漫的片狀圖譜。地塞米松誘導(dǎo)小鼠胸腺地塞米松誘導(dǎo)小鼠胸腺細(xì)胞凋亡細(xì)胞凋亡1： DNA

13、 marker;2-3：細(xì)胞壞死對(duì)照：細(xì)胞壞死對(duì)照4-6：細(xì)胞凋亡；：細(xì)胞凋亡；7： 正常細(xì)胞對(duì)照正常細(xì)胞對(duì)照基因組基因組DNADNA抽提試劑盒抽提試劑盒SDS（十二烷基硫酸鈉）：破細(xì)胞膜、核膜，使組織蛋白與（十二烷基硫酸鈉）：破細(xì)胞膜、核膜，使組織蛋白與DNA分離分離EDTA（乙二胺四乙酸二鈉）：抑制（乙二胺四乙酸二鈉）：抑制DNA酶活性，確保目的酶活性，確保目的DNA不再降解不再降解Proteinase K：使染色質(zhì)上蛋白質(zhì)與：使染色質(zhì)上蛋白質(zhì)與DNA分離，并進(jìn)一步降解為分離，并進(jìn)一步降解為小肽小肽/氨基酸氨基酸酚、氯仿：抽提除去蛋白質(zhì)酚、氯仿：抽提除去蛋白質(zhì)異丙醇：沉淀異丙醇：沉淀DNA

14、Goldview：DNA螢光染料，與螢光染料，與DNA結(jié)合形成一種光絡(luò)合物，在紫結(jié)合形成一種光絡(luò)合物，在紫外光下呈綠色螢光外光下呈綠色螢光TNF receptor-associated death domain (TRADD) Fas-associated death domain protein (FADD)cysteine-aspartic proteases（caspase）細(xì)胞凋亡的檢測(cè)細(xì)胞凋亡的檢測(cè) 細(xì)胞形態(tài)的改變細(xì)胞形態(tài)的改變 DNA片段片段 檢測(cè)檢測(cè)caspase，裂解的底物，調(diào)節(jié)因子和抑制因子，裂解的底物，調(diào)節(jié)因子和抑制因子 細(xì)胞膜的改變細(xì)胞膜的改變 線粒體改變線粒體改變細(xì)胞形

15、態(tài)的改變細(xì)胞形態(tài)的改變 電鏡檢測(cè)：電鏡檢測(cè)： 可檢測(cè)單個(gè)凋亡細(xì)胞的變化，但細(xì)胞凋亡早期可檢測(cè)單個(gè)凋亡細(xì)胞的變化，但細(xì)胞凋亡早期無(wú)明顯形態(tài)學(xué)變化的，需做其他實(shí)驗(yàn)證實(shí)。無(wú)明顯形態(tài)學(xué)變化的，需做其他實(shí)驗(yàn)證實(shí)。正常胸腺細(xì)胞正常胸腺細(xì)胞凋亡胸腺細(xì)胞凋亡胸腺細(xì)胞凋亡的淋巴細(xì)胞凋亡的淋巴細(xì)胞凋亡的淋巴細(xì)胞凋亡的淋巴細(xì)胞被巨噬細(xì)胞吞噬被巨噬細(xì)胞吞噬DNA片段的檢測(cè)片段的檢測(cè) DNA瓊脂糖凝膠電泳瓊脂糖凝膠電泳 TUNEL法法（Terminal deoxynucleotidyl transferase dUTP nick end labeling，TUNEL）：）：基本原理：存在于基本原理：存在于DNA上的切口

16、可被末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶上的切口可被末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶（TdT）識(shí)別，這種酶將催化）識(shí)別，這種酶將催化dUTP添加到切口上，添加到切口上，dUTP繼繼而可被其它標(biāo)志物所標(biāo)記。此法亦可用于標(biāo)記遭到嚴(yán)重而可被其它標(biāo)志物所標(biāo)記。此法亦可用于標(biāo)記遭到嚴(yán)重DNA損傷的細(xì)胞。損傷的細(xì)胞。TUNEL染色染色法展示出小鼠法展示出小鼠肝臟中的一個(gè)肝臟中的一個(gè)凋亡細(xì)胞凋亡細(xì)胞Caspase等凋亡相關(guān)因子檢測(cè)等凋亡相關(guān)因子檢測(cè) western blot, immunoprecipitation Immunohistochemistry Apoptosis PCR microarray Apoptotic or a

17、nti-apoptotic regulator proteins such as Bax, Bid, and Bcl-2 can also be detected using fluorescence and confocal microscopy 檢測(cè)細(xì)胞膜的改變檢測(cè)細(xì)胞膜的改變 Annexin V基本原理：正常細(xì)胞中，磷脂酰絲氨酸只分布在細(xì)胞膜脂質(zhì)基本原理：正常細(xì)胞中，磷脂酰絲氨酸只分布在細(xì)胞膜脂質(zhì)雙層的內(nèi)側(cè)，細(xì)胞發(fā)生凋亡早期，膜磷脂酰絲氨酸（雙層的內(nèi)側(cè)，細(xì)胞發(fā)生凋亡早期，膜磷脂酰絲氨酸（PS）由脂膜內(nèi)側(cè)翻向外側(cè)。由脂膜內(nèi)側(cè)翻向外側(cè)。Annexin V作為一種磷脂結(jié)合蛋白，作為一種磷脂結(jié)合蛋白，與磷脂酰絲氨酸有高度親和力，它通過(guò)細(xì)胞外側(cè)暴露的磷與磷脂酰絲氨酸有高度親和力，它通過(guò)細(xì)胞外側(cè)暴露的磷脂酰絲氨酸與凋亡早期細(xì)胞的胞膜結(jié)合。因此脂酰絲氨酸與凋亡早期細(xì)胞的胞膜結(jié)合。因此Annexin V是檢測(cè)細(xì)胞早期凋亡的靈敏指標(biāo)。是檢測(cè)細(xì)胞早期凋亡的靈敏指標(biāo)。線粒體的改變線粒體的改變 線粒體檢測(cè)：線粒體