RNA的轉(zhuǎn)錄合成

1、1q原核生物RNA的轉(zhuǎn)錄 RNA Transcription in Prokaryotesv轉(zhuǎn)錄的基本原則轉(zhuǎn)錄的基本原則 Basic Principles of Transcription v大腸桿菌大腸桿菌RNARNA聚合酶聚合酶 Escherichia Coli RNA Polymerase v大腸桿菌大腸桿菌7070啟動(dòng)子啟動(dòng)子 The E.coli 70 promoter v轉(zhuǎn)錄的起始轉(zhuǎn)錄的起始, , 延伸與終止延伸與終止 Transcription, initiation, elongation and termination 2轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)錄:以以DNA為模板為模板,在依賴于在依賴于DN

2、A的的RNA聚合酶催化之下的一系列聚合酶催化之下的一系列RNA酶促合成過程叫做轉(zhuǎn)錄酶促合成過程叫做轉(zhuǎn)錄,包括包括RNA鏈的起始、延伸、終止等步驟。鏈的起始、延伸、終止等步驟。 v轉(zhuǎn)錄的基本原則轉(zhuǎn)錄的基本原則 Basic Principles of TranscriptionBasic Principles of Transcription3Antisense strandSense strandAntisense strandSense strand4v大腸桿菌RNA聚合酶 E.coli RNA Polymerase155kDa36.5kDa151kDa11kDa36.5kDa70kDaHol

3、oenzyme 全酶核心酶51 亞基: 核心RNA聚合酶有2個(gè)亞基,由rpoA基因編碼.功能：1）參與RNA核心酶的組裝,尚未發(fā)現(xiàn)有明確的轉(zhuǎn)錄功能。2）參與全酶和啟動(dòng)子的牢固結(jié)合。3）當(dāng)RNA聚合酶核心酶沿著模板移動(dòng)進(jìn)行RNA鏈的延伸時(shí),保證DNA雙螺旋的不斷地在前面解開,在后面恢復(fù)雙螺旋。62 亞基: 是RNA聚合酶的催化中心, 由rpoB 基因編碼.可能含有兩個(gè)結(jié)構(gòu)域, 分別負(fù)責(zé)轉(zhuǎn)錄的起始和延伸.具體是 ：結(jié)合核苷酸 底物并催化磷酸二酯鍵形成證據(jù):(1)抗生素利福平:與亞基結(jié)合,阻止RNA聚合酶 轉(zhuǎn)錄的開始; (2)利迪鏈菌素也與亞基結(jié)合,抑制轉(zhuǎn)錄延伸.73 亞基:是RNA聚合酶的催化中心

4、，由rpoC 基因編碼, 負(fù)責(zé)核心酶與模板DNA的結(jié)合。 84 因子: 大腸桿菌中最常見的因子是70. 特性:（1）與核心酶結(jié)合形成了全酶,在啟動(dòng)子識(shí)別中 起關(guān)鍵性的作用；（2）原核生物含有多種因子，以能識(shí)別各種類型的啟動(dòng)子；（3）RNA鏈延伸至8-9nt時(shí)， 因子就離開核心酶；（4） 因子數(shù)量只有核心酶的30%，因此在任何時(shí)刻只有1/3的聚 合酶是全酶。95 亞基：亞基的功能尚不清楚,也有人認(rèn)為亞基對(duì)于RNA聚合酶的結(jié)構(gòu)和功能沒有太大的影響。10v 大腸桿菌大腸桿菌7070 啟動(dòng)子啟動(dòng)子 The E.coli 70 promoter1. 70在基因中的位置及序列為了方便為了方便, ,人們將人

5、們將mRNAmRNA開始轉(zhuǎn)錄的一個(gè)堿基開始轉(zhuǎn)錄的一個(gè)堿基( (轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)) )定為定為+1,+1,沿轉(zhuǎn)錄方向順流而下均用正值表示沿轉(zhuǎn)錄方向順流而下均用正值表示; ;溯流而上的啟溯流而上的啟動(dòng)子部分動(dòng)子部分, ,均用負(fù)值表示。均用負(fù)值表示。112. 70的特征大小40-60bp; -10序列, 也叫pribnow框,含有保守序列 TATAAT, 其中帶底線的稱為保守T,它存在于目前已知的幾乎所有啟動(dòng)子中,一般位于6(5)到9(8).該序列是聚合酶啟動(dòng)DNA解旋的序列.122. 70的特征(續(xù)上) -35序列, 也叫Sextama框,也是RNA聚合酶覆蓋的部分。 RNA聚合酶依靠其亞基識(shí)

6、別該位點(diǎn),因此又稱為RNA聚合酶識(shí)別位點(diǎn)。其保守序列為TTGACA。132. 70的特征(續(xù)上)啟動(dòng)子區(qū)域的共同功能: (1) -35序列組成增強(qiáng)與聚合酶因子相識(shí)別和相互作用的識(shí)別區(qū)； (2) -10序列直接影響DNA的解旋速度；TTGACA.16-18bp.TATAAT5-8bp.CG/AT-35sequence -10sequence +114啟動(dòng)子效率-10序列和-35序列之間距離的改變影響啟動(dòng)子的活性。間隔17bp活性最強(qiáng)（16-18，15-20bp）弱啟動(dòng)子沒有-35序列。如：lac啟動(dòng)子，lac基因的表達(dá)需要一個(gè)輔助激活因子受體蛋白CAP(cyclic AMP receptor p

7、roteizod) 與靠近啟動(dòng)子上的CRP位點(diǎn)結(jié)合，以增強(qiáng)啟動(dòng)子與RNA聚合酶的結(jié)合從而進(jìn)行轉(zhuǎn)錄起始。15v 轉(zhuǎn)錄的起始、延伸與終止 Transcription, Initiation , Elongation and Termination1 啟動(dòng)子結(jié)合 Promoter binding2 DNA解旋 DNA unwinding3 RNA鏈起始 RNA chain initiation4 RNA鏈延伸 RNA chain elongation5 RNA鏈終止 RNA CHAIN TERMINATION6 依賴的轉(zhuǎn)錄終止 Rho-dependent termination161.Promote

8、r binding2. DNA Unwinding and initiation三聚復(fù)合物閉合復(fù)合物開放復(fù)合物3. ElongationDNA解旋區(qū)(轉(zhuǎn)錄泡)1712bp17bp3. Elongation18Termination (1)不依賴因子的轉(zhuǎn)錄終止(Rho-indepent termination)發(fā)夾結(jié)構(gòu)特點(diǎn):回文序列中富含G.C堿基對(duì),在回文序列的下游方向又常有6個(gè)8個(gè)AT堿基對(duì)；1920(2) 依賴因子的轉(zhuǎn)錄終止 (Rho-depent termination)結(jié)合RNA上72個(gè)核甘酸發(fā)夾結(jié)構(gòu)特點(diǎn):依賴因子的終止子中回文序列的G-C對(duì)含量較少。在回文序列下游方向的序列沒有固定特

9、征,其A-T對(duì)含量比前一種終止子低。 21因子是RNA聚合酶的一種重要的蛋白質(zhì)輔助因子。催化解開DNA-DNA和RNA-DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)。22q真核生物RNA的轉(zhuǎn)錄Transcription in Eukaryotesv真核生物的RNA聚合酶 Eukaryotic RNA Polymerases v真核生物的啟動(dòng)子 Eukaryotic Promoter23v真核生物RNA聚合酶Eukaryotic RNA Polymerases 真核細(xì)胞中有三種真核細(xì)胞中有三種RNA聚合酶聚合酶：RNA聚合酶聚合酶I、RNA聚合酶聚合酶、RNA聚合酶聚合酶。除了這除了這3種聚合酶以外種聚合酶以外,真核生物細(xì)

10、胞中的線粒體真核生物細(xì)胞中的線粒體和葉綠體還含有其他的和葉綠體還含有其他的RNA聚合酶聚合酶243種RNA聚合酶的性質(zhì)和功能TypeLocationFunctionTo -amanitinRNA Pol INucleoli核核仁仁Transcribes Most rRNAs geneInsensitiveRNA PolNucleo-plasm核質(zhì)核質(zhì)Transcribes all protein-coding genes and some snRNA genesVery sensitiveRNA Pol Nucleo-plasmtRNAs, 5S rRNA,U6 snRNA and other

11、 small RNAs genesModerately sensitive中度敏感中度敏感25RNA聚合酶亞基 RNA polymerase subunits三種聚合酶均含有12個(gè)以上的亞基,其中編碼每一個(gè)RNA聚合酶兩個(gè)大亞基的DNA序列具有同源.三種聚合酶均含有與E. coli RNA Pol 核心 ( 2)亞基相同 源的亞基. 其中最大亞基與E. coli RNA Pol 中的 亞基相似,第二大亞基與E. coli RNA Pol 的含有活性位點(diǎn)的 亞基相似.RNA Pol I 和III,共存兩個(gè)亞基,Pol II 專有亞基與E. coli RNA Pol 的 亞基具有同源性.至少還有5

12、種小亞基普遍存在于這3種聚合酶中,此外僅存在于某一特定聚合酶中的亞基還有4-7個(gè).26 真核生物RNA聚合酶的活性Eukaryotic RNA polymerase activity 真核生物的RNA聚合酶與原核生物的共同點(diǎn)：（1）轉(zhuǎn)錄方向?yàn)?3,合成與反義模板鏈互補(bǔ)的RNA（2）轉(zhuǎn)錄起始時(shí)不需要引物,只需要前體核苷酸ATP, GTP, CTP,UTP27真核生物的RNA聚合酶與原核生物的不同點(diǎn)：（1）有三個(gè)聚合酶。（2）真核生物RNA聚合酶在與啟動(dòng)子結(jié)合、起始轉(zhuǎn)錄之前需要一些額外的起始蛋白（轉(zhuǎn)錄因子）的參與。（3） RNA 聚合酶II的羧基端含有一段7個(gè)氨基酸的重復(fù)序列，稱作羧基末端結(jié)構(gòu)域，

13、即CTD (carboxyl terminal domain )；這7個(gè)氨基酸的重復(fù)序列是Tyr（酪）-Ser（絲）-Pro-Thr-Ser-Pro-Ser。在老鼠中重復(fù)52次，在酵母中重復(fù)26次。這種結(jié)構(gòu)對(duì)酶的活性是必要的。28真核生物的轉(zhuǎn)錄因子（1）基本轉(zhuǎn)錄因子（basal factor）（2）上游因子（upstream factor）（3）誘導(dǎo)因子（inducible factor）29v真核生物的啟動(dòng)子 Eukaryotic Promoter啟動(dòng)子：?jiǎn)?dòng)子是指位于基因5 端上游，能夠被RNA 聚合酶和其他轉(zhuǎn)錄因子識(shí)別并與之結(jié)合，從而起始基因轉(zhuǎn)錄的一段DNA 序列，是基因表達(dá)調(diào)控中非常重

14、要的順式作用元件。 調(diào)控元件：順式作用元件(啟動(dòng)子，增強(qiáng)子，沉默子），反式作用因子啟動(dòng)子類型：I型啟動(dòng)子、II型啟動(dòng)子、III型啟動(dòng)子301. rRNA 基因(rDNA)人類rDNA編碼產(chǎn)生一個(gè)45S的rRNA轉(zhuǎn)錄物 (13000nt)，這一轉(zhuǎn)錄物隨后被切成18S (2000nt), 5.8S (160nt) 和 28S (5000 nt)各1個(gè)的 rRNA. 人類細(xì)胞在不同的染色體上分布有5簇rDNA重復(fù)基因（串聯(lián)基因簇），每簇有40個(gè)拷貝，拷貝之間被非轉(zhuǎn)錄的間隔序列分開（圖）這種RNA多基因拷貝的連續(xù)轉(zhuǎn)錄是產(chǎn)生足夠且加工的rRNA。rRNA和蛋白質(zhì)結(jié)合形成了核糖體(1) I型啟動(dòng)子（ RN

15、A聚合酶I啟動(dòng)子）3145S rRNAprocessed intorDNA32每一個(gè)rRNA簇被稱為一個(gè)核組織區(qū)域（nucleolar organizer regions）. 在rRNA合成活躍階段，前rRNA轉(zhuǎn)錄物與rDNA捆扎在一起可在顯微鏡下看到“圣誕樹” （Christmas tree structures）樣的結(jié)構(gòu).（圖） 332. I 型啟動(dòng)子的特征I型啟動(dòng)子由兩部分的轉(zhuǎn)錄控制區(qū)域構(gòu)成:核心元件(Core element，CE) 和上游控制元件(Upstream control element, UCE)前 rDNA RNA Pol I promoters in human cel

16、ls34上游結(jié)合因子(Upstream binding factor1, UBF1)：一種特異DNA結(jié)合蛋白, 與UCE和核心元件上游的一段序列結(jié)合,UBF1可使轉(zhuǎn)錄速率大大增強(qiáng).UBF1的兩個(gè)結(jié)合位點(diǎn)序列之間沒有明顯的相似性, UBF1的分子先結(jié)合一個(gè)序列元件,隨后通過蛋白-蛋白之間的互作結(jié)合,導(dǎo)致在兩個(gè)位點(diǎn)間的DNA形成一個(gè)環(huán)狀結(jié)構(gòu).3. RNA聚合酶與轉(zhuǎn)錄因子35選擇因子1(Selectivity factor1, SL1)：聚合酶I 轉(zhuǎn)錄所必需.SL1結(jié)合并穩(wěn)定UBF-DNA復(fù)合物,且與核心元件游離的下游部分相互作用.SL1本身沒有與啟動(dòng)子特異結(jié)合的特性,它促使Pol I與UBF-DN

17、A復(fù)合物的結(jié)合并起始轉(zhuǎn)錄.UBF1UBF13637(2) II型啟動(dòng)子：RNA聚合酶II識(shí)別 RNA Pol II (RNA聚合酶聚合酶II)1）RNA Pol II 存在于核質(zhì)中2）負(fù)責(zé)所有編碼基因和一些snRNA基因的轉(zhuǎn)錄3）合成的前mRNA需經(jīng)過一系列的加工,如RNA 5端生成帽子結(jié)構(gòu)、RNA 3端加上poly A 尾巴以及內(nèi)含子剪接38 Typical RNA Pol II genes 39II型啟動(dòng)子 Promoter特征： （1）TATA box：在上游約-25-35bp位置，有7對(duì)共有堿基序列5-TATA（A/T）A（A/T）-3。決定RNA Pol II 的位置或正確的起始轉(zhuǎn)錄

18、。（2）帽子位點(diǎn)（Cap site):即轉(zhuǎn)錄的起始位點(diǎn)，大都為A堿基。（3）CAAT box：即上游調(diào)控元件（UREs）。保守序列為GG（C/T）CAATCT，一般位 于-75bp附近。該序列確保啟動(dòng)子的有效轉(zhuǎn)錄。A40其他真核生物的啟動(dòng)子：（ 1）缺乏TATA框，只含起始元件，如老鼠的末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶基因，其起始元件位于轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)附近，從-6至+11，序列為GCCCTCATTCTGGAGAC。（2）沒有TATA框，也不含起始元件，只有20-50bp的GC區(qū)。 這些啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄效率很低。41食用菌gpd啟動(dòng)子：1 ATTCAAGCAGTCAATGGATTGGAGTGTATTTAGAATCG

19、AAGGTTGTGGAA51 CAAGGAAAAGATGCGGACGAAAAACACAACTGATCCTTTTATAGATAATC101 GCGCTTCAGTCAAATCTTGATTGCGTGATGTTGTGACTTCGACAATAGCC151 CTAAAGTCTAGACCTTAGAACACTTTAGTACCTCGGACCTGCGATTGGGT201 AGGATTTACTGGCCGAGTCCTTTGGGATGGACTGCCAATCAGCAAACGTT251 CTTCAGTTCTATCGCCCCATGACTAAGGTTGCCTGGAACCGTGCTCGAGC301 TTTGGATGGAAGTGC

20、CTTTGAAAAGCCCTGCAAAGTCTTGCAAATGCTAC351 AGCTTCCTCCCTGGCCTGGGTTTGTTGTTCTAGAACTACTCTCATTCTTA401 TCTTCTGCATACAACCATTTCATGCTATCCCAGGATACACCGGTTTCACC451 GTAGTAGCCTTATGGATGCAACTTTGACGCACTGACAATCTGACTGATAT501 CGACCAATAAGAATAGATAAAACTCCCTGTCCGAGTCCTTTCCGTGATAC551 ATGTGGCTCTCCGACTGCACTCTAACGCCGATAGGATACGGGCCC

21、GCTCA601 GATAACCAGCA42uGfp基因在灰蓋鬼傘菌絲中的表達(dá)ck- pLg-gfp轉(zhuǎn)化子Lg2 pGg-gfp轉(zhuǎn)化子Gg1 普通光源藍(lán)光激發(fā)ck- pLg-gfp轉(zhuǎn)化子Lg2 pGg-gfp轉(zhuǎn)化子Gg1 l熒光顯微鏡下的菌絲熒光圖43ck- pLg-gfp轉(zhuǎn)化子Lg2 pGg-gfp轉(zhuǎn)化子Gg1 pLr-gfp轉(zhuǎn)化子 Lr1l共聚焦顯微鏡下菌絲熒光圖片44Fluorescence microscope45u增強(qiáng)子Enhancer ：在遠(yuǎn)離轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)（上游或下游）的一段可增強(qiáng)啟動(dòng)子活性的調(diào)控元件，大小為100-200bp。最初在DNA病毒SV40的基因組中發(fā)現(xiàn)。特性：（1）加強(qiáng)

22、相連基因從正確起始位點(diǎn)的轉(zhuǎn)錄活性；（2）增強(qiáng)子無論是在下游或在上游均可激活轉(zhuǎn)錄；（3）無論是在下游或在上游，可在遠(yuǎn)離起始位點(diǎn)1Kb以上發(fā)揮作用；（4）兩個(gè)啟動(dòng)子串聯(lián)在一起時(shí)，增強(qiáng)子優(yōu)先激活距離最近的那一個(gè)。u沉默子Silencer:46 IIII型基因轉(zhuǎn)錄的轉(zhuǎn)錄因子和轉(zhuǎn)錄起始復(fù)合物型基因轉(zhuǎn)錄的轉(zhuǎn)錄因子和轉(zhuǎn)錄起始復(fù)合物轉(zhuǎn)錄因子：真核生物RNA聚合酶轉(zhuǎn)錄需要的各種蛋白質(zhì)輔助因子稱之。以TFIIX表示，以發(fā)現(xiàn)順序命名，如：TFIIA、TFIIB等。轉(zhuǎn)錄起始復(fù)合物的組裝過程：p268-26947（3）III型啟動(dòng)子：RNA聚合酶III識(shí)別 RNA聚合酶聚合酶III:1）Contains at leas

23、t 16 different subunits2）Located in nucleoplasm(核質(zhì)核質(zhì))3）Synthesizes the precursor of 5S rRNA, the tRNAs and other snRNAs and small cytosolic(胞質(zhì)胞質(zhì)) RNAs III型啟動(dòng)子的類型（下圖）：基因內(nèi)啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄起點(diǎn)上游啟動(dòng)子48 Promoters for RNA polymerase IIIMay consist of bipartite(雙向的) sequences downstream of the startpoint, with boxA sepa

24、rated from either boxC or boxB. Or they may consist of separated sequences upstream of the startpoint (Oct, PSE, TATA box).5SrRNA基因U6等基因tRNA基因49tRNA 的基因內(nèi)啟動(dòng)子(1) Transcription control regions (promoters) of tRNA lies after the start site.(2) Two highly conserved sequences within the tRNA coding region

25、, called A box (5-TGGCNNAGTGG) and B box (5-GGTTCGANNCC). These sequences also encode important sequences in the tRNA itself, the D-loop and T C-loop (tRNA二級(jí)結(jié)構(gòu)形式二級(jí)結(jié)構(gòu)形式).Highly conserved sequence in tRNAs are also highly conserved promoter DNA sequences. 50(3)Two complex DNA-binding factorsa. TFIIIC

26、binds to both the A and B boxesb. TFIIIB: the true initiation factorbinds 50 bp upstream from the A box.Consists of 3 subunits, including TBP, BRF and BTFIIIC remove without affecting transcription51v轉(zhuǎn)錄的終止Transcriptional termination RNA polymerases III 的終止只需要一個(gè)簡(jiǎn)單的核苷酸序列, 這個(gè)核苷酸序列由成簇的dA殘基構(gòu)成, 但其終止序列受到周圍

27、的序列的影響.如Xenopus borealis體細(xì)胞中5SrRNA基因的一個(gè)有效的終止信號(hào), 其序列為: 5-GCAAAAGC-3 其他終止信號(hào)可能也是U序列的發(fā)夾結(jié)構(gòu)和富含 G-C的區(qū)域。52qRNA轉(zhuǎn)錄的抑制作用RNA的轉(zhuǎn)錄抑制劑有三類：（1）嘌呤和嘧啶類似物:53（）（）DNA模板功能的抑制物模板功能的抑制物: 1）烷化劑：氮芥、磺酸酯、氮丙啶、乙撐亞胺。）烷化劑：氮芥、磺酸酯、氮丙啶、乙撐亞胺。 2 ）放線菌素：）放線菌素： 3）嵌入染料：溴化乙錠等）嵌入染料：溴化乙錠等（3）RNA聚合酶的抑制物：聚合酶的抑制物： 1）利福利福平平霉素：利福平霉素：利福平 2）鏈霉素）鏈霉素 3）-

28、鵝膏蕈堿鵝膏蕈堿 4）放線菌素）放線菌素54作業(yè)：1）術(shù)語解釋：轉(zhuǎn)錄、模板鏈、轉(zhuǎn)錄泡、啟動(dòng)子、增強(qiáng)子、 沉默子。2）真核生物的RNA聚合酶與原核生物的RNA聚合酶有哪些 異同點(diǎn)？3）簡(jiǎn)述原核生物的啟動(dòng)子的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)。4）簡(jiǎn)述真核生物的啟動(dòng)子類型及其結(jié)構(gòu)特點(diǎn)。5）原核生物和真核生物的轉(zhuǎn)錄是如何終止的？553 亞基:是RNA聚合酶的催化中心，由rpoC 基因編碼, 負(fù)責(zé)核心酶與模板DNA的結(jié)合。 56Termination (1)不依賴因子的轉(zhuǎn)錄終止(Rho-indepent termination)發(fā)夾結(jié)構(gòu)特點(diǎn):回文序列中富含G.C堿基對(duì),在回文序列的下游方向又常有6個(gè)8個(gè)AT堿基對(duì)；57因子是RNA聚合酶的一種重要的蛋白質(zhì)輔助因子。催化解開DNA-DNA和RNA-DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)。582. I 型啟動(dòng)子的特征I型啟動(dòng)子由兩部分的轉(zhuǎn)錄控制區(qū)域構(gòu)成:核心元件(Core element，CE) 和上游控制元件(Upstream control element, UCE)前 rD