電解性自由基對離體豚鼠冠脈內(nèi)皮與氣道上皮的損傷作用

1、    電解性自由基對離體豚鼠冠脈內(nèi)皮與氣道上皮的損傷作用            關(guān)鍵詞：電解；自由基；豚鼠；冠狀血管；氣管；上皮    中國病理生理雜志000921    摘 要 目的和方法：采用電解Krebs灌流液產(chǎn)生自由基的方法，觀察電解性自由基對豚鼠離體心臟冠脈內(nèi)皮與氣道上皮功能的影響。結(jié)果：10 mA直流電，持續(xù)1-2 min電解灌流液產(chǎn)生的自由基

2、導(dǎo)致離體心臟冠脈壓升高約4.4 kPa,同時使心肌收縮力下降,心肌組織過氧化脂質(zhì)含量增高,而SOD活性降低;使離體支氣管肺灌流壓升高約2.20 kPa ，并對磷酸組胺反應(yīng)性增高3倍； 電解灌流液的作用可被羥自由基清除劑甘露醇、DMSO抑制。結(jié)論：電解性自由基可引起冠脈內(nèi)皮與氣道上皮損傷,使冠脈和氣道反應(yīng)性增高。    中分類號 R543.3+3； R562.1+1 文獻(xiàn)標(biāo)識碼 A    文章編號 1000-4718(2000)09-0848-04    Effects of

3、electrolyzed free radicals on endothelium of isolated    guinea pig coronary and epithelium of airway tube    CHEN Lin-xi, CHEN Jian-xiong， LIAO Duan-fang, ZHU Bin-yang， YI Lin    (Department of Cardiopulmanary Pharmacology,Hengyang Medical

4、 College,Hengyang 421001,China)    Abstract AIM and METHODS:To study the damage effects of free radicals from electrolyzed krebs solution(direct current,10 mA,1-2 min) on isolated guinea pig coronary and airway tube. RESULTS:In Langendorff's perfused guinea pig hearts,the ele

5、ctrolyzed free radicals increased coronary perfusion pressure(4.4±1.2) kPa,inhibited myocyte contractility (0.8±0.8) g vs (2.9±0.6) g，P<0.05,increased TBARS level and decreased SOD activity.In isolated perfused lungs of guinia pig,electrolyzed Krebs solution promoted significantly

6、the airway perfusion pressure (0.03±0.01) kPa vs (2.20±0.29) kPa,P<0.01 and histamine reactivity (0.65±0.37) kPa vs (2.05±0.25) kPa, P<0.01. Hydroxyl radicals scavenger DMSO and natural medicine gypenosides prevented the effects of oxygen free radicals. CONCLUSION: These re

7、sults indicated that the free radicals by electrolyzation could induce damages of coronary endothelium and airway epithelium.    MeSH Electrolysis; Free radicals; Guinea pigs; Coronary vessels; Trachea; Epithelium    氧自由基是一組非?；钴S的極性基團(tuán)，可引起細(xì)胞膜脂質(zhì)過氧化損傷、滅活一氧化氮、氧化低密度

8、脂蛋白、誘導(dǎo)血小板聚集、刺激某些原癌基因表達(dá)等，在心、肝、肺、腎、腦等器官疾病發(fā)生發(fā)展過程中起重要作用。細(xì)胞、組織、器官自由基損傷模型制備常采用內(nèi)源性或外源性兩種自由基產(chǎn)生方式。前者常用缺血/再灌注,后者常用黃嘌呤+黃嘌呤氧化酶。由于黃嘌呤和黃嘌呤氧化酶價格昂貴，如采用較長時間灌流，則需消耗大量試劑，加之黃嘌呤氧化酶較易失活，產(chǎn)生氧自由基的時間和強度難以控制，應(yīng)用受到一些限制。我室建立了電解性產(chǎn)生氧自由基的方法并觀察了電解性自由基損傷主動脈、腦血管內(nèi)皮的作用，效果良好1-5。本實驗旨在觀察電解性自由基損傷離體豚鼠心臟冠狀動脈內(nèi)皮和氣道上皮的作用。    

9、材 料 和 方 法    一、藥品    硫代巴比妥酸(thiobarbituric acid,TBA)瑞士Fluka產(chǎn)品;絞股藍(lán)總皂甙(gypenosides,GPS,湖南醫(yī)科大學(xué)藥理室贈送)；鄰苯三酚(遵義化工廠)，二甲基亞砜(DMSO，天津化學(xué)試劑廠),甘露醇注射液(mannitol,江蘇常熟制藥廠)，磷酸組胺(histamine,HA，上海生化研究所),均為分析純。    二、方法    (一)電解性自由基產(chǎn)生方法 采用本室建立

10、的方法，以YSD-5型藥理生理多用儀輸出1、2、5 mA恒定直流電電解灌流Krebs液(mmol/L:NaCl 115.0, KCl 4.6, MgSO4 1.16, NaH2PO4 1.16, NaHCO3 21.9, CaCl2 2.5, Glucose 11.0, 流速5 mL/min)持續(xù)8 min,每隔30 s取1 mL Krebs液以細(xì)胞色素c還原法在550 nm波長下測定自由基含量。    (二) 化學(xué)性自由基產(chǎn)生方法 以10、30、100 mol/L黃嘌呤加5 u/L黃嘌呤氧化酶共同孵育，每30 s取樣測定超氧化物5。 

11、0;  (三) 豚鼠Langendorff心臟電解性自由基損傷冠狀動脈內(nèi)皮模型 參照本室方法，先備好Langendorff心臟，然后將兩鉑金絲電極置于主動脈插管內(nèi)，陽極距主動脈5 cm,陰極距主動脈10 cm,用YSD-5型藥理生理多用儀輸出10 mA恒定直流電電解灌流Krebs液，持續(xù)時間1 min,記錄如下指標(biāo)：以對照組冠脈壓為零，記錄處理后冠脈壓凈增值，并記錄心肌收縮力(ventricular contractile force，VCR),處理后取心肌組織勻漿，按硫代巴比妥酸法7測定心肌組織過氧化脂質(zhì)(LPO)，結(jié)果以硫代巴比妥酸反應(yīng)產(chǎn)物(thiobarbituric

12、 acid reactive substance,TBARS)含量表示。按鄰苯三酚法8測定心肌組織SOD活性。實驗分為空白對照組，電解損傷組和電解損傷+絞股藍(lán)總皂甙組。    (四)豚鼠離體支氣管肺灌流9電解系統(tǒng)損傷氣道上皮模型 取300 g左右豚鼠，雌雄均可，先擊暈后放血處死，快速分離支氣管肺，在肺動脈處切1小口，用充氧Krebs液沖洗干凈后將支氣管固定于不銹鋼管上，并在肺表面用針頭刺數(shù)孔，37 恒溫，以10 mL/min Krebs液流速灌流，參照本室5的方法，將鉑絲電極置于管內(nèi)，陽極距標(biāo)本上端4 cm, 陰極距標(biāo)本上端8 cm,通以10 mA恒定電

13、流，電解Krebs液,持續(xù)時間為2 min。以二道生理記錄儀記錄支氣管肺灌注壓(kPa)，并以組胺作用時灌注壓的變化表示氣道反應(yīng)性。實驗分為對照組、電解損傷組、電解損傷+二甲基亞砜組和電解損傷+甘露醇組。    結(jié) 果    一、不同電流時電解性自由基的產(chǎn)生     Fig 1 changes of electrolyzed free radicals in different electric current intensity.   

14、0;1 不同電流時電解性自由基的變化    如1示， 在1、2、5 mA電流下電解灌流液,自由基在1 min內(nèi)達(dá)高峰,并呈穩(wěn)定狀態(tài),停止電解后自由基產(chǎn)生迅速減少。    二、黃嘌呤+黃嘌呤氧化酶時超氧化產(chǎn)物的產(chǎn)生    Fig 2 Superoxide production curves of differente xanthine+xanthine oxidase.    2 不同黃嘌呤+黃嘌呤氧化酶時超氧化產(chǎn)物變化 

15、60;  如2示，黃嘌呤加黃嘌呤氧化酶法產(chǎn)生自由基迅速，達(dá)峰時間短，持續(xù)時間短，且呈劑量依賴性。    三、 電解性自由基對離體豚鼠冠脈灌注壓及心肌收縮力的影響    表1顯示，10 mA電流電解灌流液1 min，冠脈壓明顯升高，同時心肌收縮力明顯下降。絞股藍(lán)總皂甙升高心肌收縮力，降低冠脈壓。    表1 電解性自由基對離體豚鼠冠脈灌注壓    及心肌收縮力的影響    Tab

16、 1 Effect of electrolyzed free radicals on perfusion pressure of    isolated guinea pig coronary and ventricular contractile force(±s. n=10) Group    Coronary pressure net    increment(kPa)    Ventricular contractil

17、e    force(g)    Control    0    2.9±0.6    Electiolysis    4.4±1.2    0.8±0.8*    GPS    1.1±0.6* *

18、    1.8±0.6* *    *P<0.01 vs control; * * P<0.01 vs electrolysis.    四、電解性自由基對離體豚鼠心肌組織TABRS含量和SOD活性影響    如表2所見，電解性自由基損傷冠脈內(nèi)皮后心肌組織TBARS升高，而SOD活性下降.絞股藍(lán)總皂甙降低TABRS含量，升高SOD活性。表2 電解性自由基對離體豚鼠心肌組織   

19、0;TABRS含量和SOD活性影響    Tab 2 Effect of electrolyzed free radicals on TBARS contents    and SOD activity of isolated guinea pig heart tissue(±s) Group    n    TBARS(nmol/mg wet wt)    n  &

20、#160; SOD(u/mg wet wt)    Contro    l8    84.1±10.6    8    1.06±0.40    Electrolysis    5    114.2±24.7*  

21、60; 7    0.44±0.13* *    GPS    10    61.4±17.9* * *    10    0.95±0.21* * *    *P<0.05, * * P<0.01 vs control; * * * P<0.01 vs ele

22、ctrolysis.    五、 電解性自由基對離體豚鼠支氣管肺氣道上皮功能的影響表3 電解性自由基對離體豚鼠支氣管    肺氣道上皮功能的影響    Tab 3 Effect of electrolyzed &127;free&127;radicals on air tube perfusion    pressure and histamine reactivity of isolated guinea pig (&

23、#177;s) Group    n    bronchiallung perfusion pressure(kPa)    n    HA activity(kPa)    Control    10    0.03±0.01* *    5  &

24、#160; 0.65±0.37* *    electrolysis    10    2.20±0.29    5    2.05±0.25    DMSO    8    0.87±0.17* *  

25、60; MAN    6    0.97±0.24* *    * * P<0.01 vs electrolysis.    如表3所示，10 mA電流電解支氣管肺灌流液2 min，發(fā)現(xiàn)支氣管肺灌流壓從(0.03±0.01) kPa上升至(2.20±0.29) kPa,對磷酸組胺反應(yīng)性增加3倍.預(yù)先用DMSO 10 mmol/L及甘露醇50 mmol/L分別灌流15 min,則可對抗電解性氧

26、自由基的作用。討 論    氧自由基因可損傷細(xì)胞生物膜,促進(jìn)粘附分子表達(dá), 修飾低密度脂蛋白,誘導(dǎo)血小板聚集,滅活一氧化氮及誘導(dǎo)原癌基因表達(dá)，在動脈粥樣硬化、心肌缺血再灌注損傷、支氣管哮喘、呼吸窘迫綜合征等心肺疾病中起重要作用。    各種器官的氧自由基損傷模型已成為研究很多疾病防治的常規(guī)方法。在實驗中產(chǎn)生外源性氧自由基的常見方法為黃嘌呤+黃嘌呤氧化酶法，該方法所產(chǎn)生的氧自由基時間短暫，采用較大劑量也只能維持20 min,而且到達(dá)高峰的時間相對電解法達(dá)高峰時間長,本實驗也證實如此，加之,黃嘌呤氧化酶易失活，間隔一段

27、時間所產(chǎn)生的氧自由基量有較大差異,重復(fù)性相對較差。此外,試劑昂貴也是該方法在一般實驗室使用受到限制的原因。本實驗所用的電解灌流液產(chǎn)生氧自由基的方法簡便實用,設(shè)備易得,成本低,操作簡單,重復(fù)性好,產(chǎn)生時間可控,本室曾多次采用本法研究絞股藍(lán)總皂甙對心臟、血管功能的影響3-5,結(jié)果比較穩(wěn)定可靠。    本實驗結(jié)果顯示電解灌流液產(chǎn)生的氧自由基能明顯升高冠脈灌注壓，抑制離體豚鼠心肌收縮力，增加心肌組織TABRS含量，降低SOD活性。同時，電解灌流液產(chǎn)生的氧自由基能使支氣管平滑肌收縮，離體豚鼠氣道阻力增加，灌注壓升高,且此作用可被羥自由基清除劑甘露醇、DMSO抑制，

28、此外,電解性氧自由基還能引起支氣管對組織胺反應(yīng)性明顯升高，中藥絞股藍(lán)總皂甙及自由基清除劑甘露醇和DMSO均可拮抗或逆轉(zhuǎn)電解性氧自由基的損傷作用。 電解性氧自由基可損傷血管內(nèi)皮細(xì)胞，NO和PGI2釋放減少，血管收縮2；氧自由基也可損傷氣道上皮細(xì)胞，釋放內(nèi)皮素等，引起氣道反應(yīng)性增高10。    需要指出的是電解灌流液產(chǎn)生氧自由基是一種混合自由基，包括H2O2,OH*,O?2,ClO3-等。而黃嘌呤+黃嘌呤氧化酶所產(chǎn)生的氧自由基絕大部分是O?2。因此，若想研究某一特定種類自由基的作用，則不宜采用電解法。    基金項目

29、國家自然科學(xué)基金資助(No.39200151)    Tel:#160;   參 考 文 獻(xiàn)    1 廖端芳,陳 修.一種觀察血管內(nèi)皮損傷與自由基關(guān)系的新方法J.中國藥理學(xué)與毒理學(xué)雜志,1991,5:231-234.    2 廖端芳，余 麟,陳劍雄,等.一種觀察血管內(nèi)皮損傷與自由基關(guān)系的新方法. 內(nèi)皮掃描電鏡觀察J. 衡陽醫(yī)學(xué)院學(xué)報,1992,20(4):341-345.    3 肖觀蓮，廖端芳,余 麟,等.一種篩選抗自由基藥物的簡便方法J. 衡陽醫(yī)學(xué)院學(xué)報，1993，22(2):224-225.