產(chǎn)品臨床試驗工作問題小結(jié)劉遠澤

1、產(chǎn)品臨床試驗工作問題小結(jié)產(chǎn)品臨床試驗工作可分為五方面：1、工作前的計劃與準備：試驗方案擬定與試驗用品的準備； 2、試驗樣本準備：人全血基因組DNA提取及信息整理； 3、試驗樣本檢測：RT-PCR檢測及結(jié)果分析； 4、工作流程中問題的發(fā)現(xiàn)、交流與解決；5、收尾與總結(jié)。針對此次蘇大附一院臨床試驗工作流程中出現(xiàn)的諸多問題，做如下總結(jié)與思考：1、工作前的計劃與準備 - 種類與數(shù)量試驗用品的準備：1、試劑盒：基因型檢測試劑盒：反應(yīng)液/反應(yīng)酶/質(zhì)控品血液基因組DNA提取試劑盒2、耗材：移液器（槍）：1000 ul / 200 ul / 50 ul / 10 ul / 2 ul（白色長尖）吸頭（槍尖）：20

2、 ul （白色長尖）/ 200 ul （黃色）/ 1000 ul （藍色）吸頭盒（三種規(guī)格）熒光PCR管（長且不透明、8聯(lián)排）和蓋子Eppendrof 管（1.5 ml）多空板（96孔 / 60孔）、樣本儲存盒（72孔）、Marker 筆、手套3、樣本信息對照表2、試驗樣本準備（人全血基因組DNA提?。? 節(jié)奏與程度提取前的檢查與準備：1、檢查試劑盒各溶液，若產(chǎn)生沉淀，須在室溫放置一段時間，必要時可在37 水浴預(yù)熱，溶解沉淀；2、依據(jù)提取步驟，為溶液編號；3、緩沖液GD和漂洗液PW 需加入適量無水乙醇；4、剪去吸附柱的蓋子提取步驟：1、第二次加入細胞裂解液CL（裂解紅細胞）時，需要劇烈振蕩，以

3、充分混勻沉淀（可見管中液體深紅，并有較多泡沫，管底無結(jié)塊沉淀）；2、加入緩沖液GB后，充分顛倒混勻（如不充分，可能會產(chǎn)生白色沉淀，一般37放置時會消失，不影響后續(xù)試驗）；3、56水浴時間延長至30 40 min，其間顛倒混勻數(shù)次，觀察溶液是否變得清亮，并為收集管編號（如未變清亮，說明細胞裂解不徹底，可能導(dǎo)致提取DNA量少、純度不加，直接影響熒光檢測）；4、水浴后加入200 ul 無水乙醇，出現(xiàn)絮狀沉淀，輕柔顛倒混勻（此時DNA析出，故自此步驟開始，顛倒要輕柔緩慢，否則破壞DNA結(jié)構(gòu)）；5、最后向吸附膜中間位置懸空滴加100ul 超純水。3、試驗樣本檢測：RT-PCR檢測及結(jié)果分析 - 精細、順

4、序、安全RT-PCR前的準備：1、超凈工作臺紫外光滅菌；2、從-20取出擴增反應(yīng)所需的反應(yīng)液和質(zhì)控品，置于室溫溶解，渦旋混勻約10s，離心待用（可使試劑充分溶解混勻，避免因體系溶質(zhì)不均勻影響反應(yīng)）；3、準備熒光PCR八聯(lián)排管（白色/長管長管與ABI 7500儀器符合度較好，利于充分受熱，否則嚴重影響檢測結(jié)果，導(dǎo)致熒光信號低），并適當標記；RT-PCR 反應(yīng)體系的分裝與加樣：1、移液器的“連續(xù)吸放液” 調(diào)移液器量程至23ul ，將排放按鈕按至第一停點（第一檔），再將吸頭垂直浸入液面，平穩(wěn)松開按鈕，在液面之下，再次將排放按鈕按至第一檔，排出吸頭尖端的氣泡后，松開按鈕，吸入液體，之后放液只需按至第一

5、檔即是23ul（如吸頭尖端仍有氣泡，可反復(fù)吸放，直至排凈氣泡）；2、樣本放置順序、吸頭安裝順序、試驗者感知順序三者形成“校正機制”，保障順序加樣（校正機制的建立，有助于連貫而正確地加樣）；3、移液器的吸放液要“慢吸快放”，且試驗者要觀察吸頭尖端，進行視覺“校正”，避免吸空放空；4、放液時，吸頭先伸入液面以下放出液體，再在管壁處打凈殘液（如吸頭仍存殘液，將移液器按至第二檔，將殘液打至吸頭尖端處，拔掉吸頭，并再次安裝回去，將殘液打回管中）；5、不能直接用手觸摸PCR管，因為人的手上含有熒光素，沾染在管壁上的熒光素會影響熒光儀檢測。操作時必須戴不含熒光物質(zhì)的一次性手套并且要經(jīng)常更換（應(yīng)使用鑷子夾取管

6、子和管蓋）；6、吸頭不要長時間暴露于空氣中，避免氣溶膠的污染；7、加樣完成后，蓋緊蓋子，并離心；8、超凈工作臺使用后，用次氯酸鈉擦拭，避免試驗環(huán)境污染；結(jié)果分析：分析的思路：1、基線和閾值的選擇和設(shè)置是否正確（直接與Ct值相關(guān)）；2、陽性和空白對照的結(jié)果是否正常（既可驗證PCR反應(yīng)的可靠性，又可以協(xié)助判斷擴增系統(tǒng)的可信性，空白對照的污染將導(dǎo)致結(jié)果失信。如空白對照出現(xiàn)陽性，則為污染，需檢查試劑準備區(qū)域是否污染、檢查使用的器材是否污染、檢查實驗室的區(qū)域分離和人流物流的單向流動等）；3、擴增曲線的線形關(guān)系如何（“S”型擴增曲線，分為四個階段：基線期、指數(shù)增長期、指數(shù)擴增期、平臺期）；分析中遇到的問題

7、：Q1：擴增曲線不正常，剛進入指數(shù)期就很快進入平臺期并向右下彎曲；1.基線等設(shè)置不當：按儀器說明書重新操作；2.模板量過多：當擴增曲線在10個循環(huán)內(nèi)起峰時，應(yīng)將模板稀釋后使用。Q2：Ct值出現(xiàn)過晚；1.反應(yīng)條件不佳：未最佳反應(yīng)條件，可重新設(shè)計引物或探針，適當降低退火溫度，增加鎂離子濃度等；2.PCR各種反應(yīng)成分的降解或加樣量不夠；3.擴增產(chǎn)物片段過長：一般采用 100200bp 的擴增長度。Q3：無Ct值（信號）出現(xiàn)；1.反應(yīng)循環(huán)數(shù)不夠：一般都要在 35 個循環(huán)以上，可根據(jù)實驗情況增加循環(huán)，但高于45個循環(huán)會增加過多的背景信號；2.檢測熒光信號的步驟有誤：一般采用延伸時采集熒光，Taqman 方法則一般在退火結(jié)束或延伸結(jié)束采集信號；3.引物或探針降解：可通過PAGE電泳檢測其完整性；4.探針設(shè)計不佳：設(shè)計探針溫度低于引物，造成探針未雜交上而產(chǎn)物已延伸；5.模板量少：提高樣品提取的濃度；6.模板降解：避免樣品制備中雜質(zhì)的引入以及模板反復(fù)凍融的情況發(fā)生。Q4：空白對照也出現(xiàn)明顯的起飛；1.熒光 PCR mix 或水被污染；2.引物二聚體的出現(xiàn)：在 35 循環(huán)后出現(xiàn)擴增屬正常情況，可配合溶解曲線進行分析；3.反應(yīng)過程中探針降解：用PAGE電泳對探針進行檢測。Q5：擴增效率低；1.反應(yīng)試劑中部分成分降解；2