QIAamp-DNA-FFPE-Tissue

1、石蠟切片提取DNA步驟注意事項：1所有離心步驟在室溫（15-25）下完成2 新鮮組織樣品取樣量約為20 mm3, 從石蠟塊上切下的組織，每次制備最大量每片10 µm，最多8片,每片大約 250 mm2,如果對樣品總量和產(chǎn)量沒有把握，建議用2-3片樣品進(jìn)行一次預(yù)實(shí)驗(yàn)。準(zhǔn)備事項：1將樣品置于室溫2將水浴鍋或其他加熱設(shè)備預(yù)熱至56，以備第11步使用3若Buffer AL產(chǎn)生沉淀，可在70水浴鍋中水浴將其融解4向Buffer AW1中加入25 ml乙醇（96%-100%），向Buffer AW2中加入30 ml乙醇（96%-100%），每次使用之前搖一搖使溶液混勻，室溫下保存一年操作步驟1.

2、 使用手術(shù)刀，修剪多余的石蠟樣本塊。2. 至少切割8個樣品截面，厚度為5 10 µm。如果樣品表面暴露在空氣中，丟棄第一個2 - 3部分。3. 立即將切割樣品放在1.5或2 ml微型離心管（試劑盒中沒有提供），然后向樣品中添加1毫升二甲苯。合上離心管蓋子，充分渦旋大于10秒。4. 離心機(jī)在室溫(15 - 25°C)全速離心2分鐘。5. 使用移液器除去上清，小心不要移除任何沉淀顆粒。6. 向沉淀顆粒加入1 ml乙醇（96 - 100%），并且渦旋混勻。乙醇可以溶解樣品中殘余的二甲苯。7. 離心機(jī)在室溫全速離心2分鐘。8. 使用移液器除去上清，小心不要移除任何沉淀顆粒。使用適當(dāng)

3、的微量移液器小心除去殘存乙醇9. 打開離心管，在室溫或者37°C下孵育10分鐘或直到樣品中的殘留乙醇蒸發(fā)干凈。10. 向離心管中加入180 µl的ATL和20 µl的蛋白酶K，渦旋混勻。11. 56°C孵育一個小時（或者孵育至樣品完全溶解）。12. 90°C孵育一個小時。樣品在ATL緩沖溶液中90°C孵育時可以部分逆轉(zhuǎn)甲醛對核酸的損害。但是過長的孵育時間和過高的孵育溫度可能會導(dǎo)致更多的斷裂的DNA產(chǎn)生。如果孵育采用同一個模塊進(jìn)行，再上一步56°C孵育后樣品要降至室溫，直到加熱模塊達(dá)到90°C后，再進(jìn)行孵育。13.

4、將1.5 ml離心管瞬時離心，將管蓋上的液體離心下來。如果需要RNA-free基因組DNA，則需要在繼續(xù)步驟14之前加入2 µl RNaseA(（100 mg/ml），孵化2分鐘。再加入RNaseA之前，樣品需要冷卻到室溫。14. 加入200 µl緩沖夜AL到樣品中，渦旋混勻。然后再加入200 µl乙醇(96 - 100%)，渦旋混勻。至關(guān)重要的是樣品、緩沖液AL、和乙醇需要立即徹底渦旋混勻，或者使用移液器將溶液混勻。緩沖液AL和乙醇可以提前進(jìn)行預(yù)混， 緩沖液AL和乙醇可以提前預(yù)混后一起加入待處理的樣品中。在加入緩沖液AL和乙醇后會有白色沉淀物產(chǎn)生，這種

5、白色沉淀并不會影響QIAamp的提取過程。15. 將1.5 ml離心管瞬時離心，將管蓋上的液體離心下來。16. 將全部裂解液小心的轉(zhuǎn)移到2 ml收集管里的QIAamp提取柱中（盡量將溶液轉(zhuǎn)移至提取柱中央），蓋緊離心管蓋，以6000×g(8000 rpm)離心1分鐘。將離心管取出，放入一支潔凈的2 ml收集管中，丟棄收集管及其中液體。如果離心后還有裂解溶液沒有通過柱膜，再次以更高轉(zhuǎn)速離心直到QIAamp提取柱中沒有殘留溶液。17. 小心打開QIAamp提取柱的蓋子，向柱心加入500 µl緩沖液AW1。蓋緊離心管蓋，以6000×g(8000 rpm)離心1分鐘。將離心

6、管取出，放入一支潔凈的2 ml收集管中，丟棄收集管及其中液體。18. 小心打開QIAamp提取柱的蓋子，向柱心加入500 µl緩沖液AW2。蓋緊離心管蓋，以6000×g(8000 rpm)離心1分鐘。將離心管取出，放入一支潔凈的2 ml收集管中，丟棄收集管及其中液體。避免QIAamp提取柱與收集管中的流出液接觸。某些離心機(jī)轉(zhuǎn)子在離心減速時會發(fā)生振動，使含有乙醇的收集管中的流出液接觸到QIAamp提取柱。將QIAamp提取柱和收集管從離心機(jī)中取出時要小心，避免收集管中的流出液接觸到QIAamp提取柱。19. 將QIAamp提取柱置于一支新的2 ml收集管中，離心機(jī)全速離心(20000 x g，14000 rpm)盡量甩干柱膜。這個步驟非常重要，因?yàn)樵诹鞒鲆褐械囊掖紩蓴_下游的核酸擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)。20. 將QIAamp提取柱置于一支潔凈的1.5 ml的離心管中（自卑），丟棄收集管及其中液體。小心打開QIAamp提取柱的蓋子，向柱心加入20-200 µl緩沖液ATE。注：確保ATE在使用前已平衡置室溫。如果采取小量洗脫（< 50 µl），將緩沖液ATE加入到離心柱的柱心，確保柱膜上吸附的DNA可以被完全洗脫。QIAamp提取柱在洗脫液體系的選擇性上有很大的靈活性，可以根據(jù)下游擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)而選擇適當(dāng)?shù)南疵擉w積。得到的洗脫產(chǎn)物