增齡對(duì)體外培養(yǎng)的兔角膜緣干細(xì)胞增殖能力的影響(1)

1、【摘要】目的觀察增齡對(duì)新西蘭兔角膜緣干細(xì)胞體外生長、增殖的影響。方法用酶消化法將不同年齡新西蘭兔角膜緣組織制成細(xì)胞懸液,以相同的細(xì)胞密度種植,觀察體外培養(yǎng)的角膜緣干細(xì)胞的生長情況,細(xì)胞免疫熒光染色鑒定,四甲基偶氮唑藍(lán)(MTT 法檢測(cè)其增殖活性,流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期。結(jié)果2個(gè)月齡組新西蘭兔角膜緣干細(xì)胞的增殖活性和增殖期細(xì)胞所占比例均較1.5年齡組和3年齡組高。結(jié)論角膜緣干細(xì)胞的增殖能力隨著年齡的增加而降低?！娟P(guān)鍵詞】干細(xì)胞;角膜緣;增齡;細(xì)胞增殖角膜緣干細(xì)胞(limbal stem cells,LSCs 是位于角膜緣基底層的一類特殊類型的上皮細(xì)胞。正常情況下角膜緣干細(xì)胞增殖、分化形成角膜上皮細(xì)

2、胞,以取代表層衰老死亡的細(xì)胞;同時(shí)它還具有上皮屏障作用,能阻止結(jié)膜上皮及血管向角膜內(nèi)生長。角膜緣干細(xì)胞缺乏將導(dǎo)致各種眼表功能異常。隨著細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)的發(fā)展,角膜緣干細(xì)胞體外培養(yǎng)后移植用于治療由于角膜緣干細(xì)胞缺乏或者功能不全引起的眼表疾病已成為研究的熱點(diǎn)。由于對(duì)角膜緣干細(xì)胞增殖、分化、遷移的影響因素認(rèn)識(shí)還不完全,體外培養(yǎng)后處于增殖期的未分化的干細(xì)胞數(shù)量還不能保證,有可能會(huì)導(dǎo)致角膜緣干細(xì)胞移植的失敗1。因此,對(duì)角膜緣干細(xì)胞增殖、分化、遷移的影響因素的研究就顯得非常重要,本實(shí)驗(yàn)探討了年齡對(duì)體外培養(yǎng)的新西蘭兔角膜緣干細(xì)胞增殖能力的影響,總結(jié)如下。1材料和方法1.1材料1.1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物:健康無眼疾的新西

3、蘭大白兔15只,雌雄不限,按年齡分為2個(gè)月齡組、1.5年齡組和3年齡組,每組動(dòng)物數(shù)為5只。1.1.2主要試劑:DMEM/F12培養(yǎng)液購自Gibco 公司;胎牛血清(FBS 購自杭州四季青公司;Dispase 購自Roche 公司;重組人表皮生長因子(EGF 、堿性成纖維細(xì)胞生長因子(bFGF 購自Peprotech 公司;胰島素、多聚賴氨酸、四甲基偶氮唑藍(lán)(MTT 購自Sigma 公司;氫化可的松為Solarbio 進(jìn)口分裝;鼠抗兔角蛋白K3抗體(AE5購自Chemicon 公司;鼠抗人p63抗體(4A4、FITC 標(biāo)記的山羊抗小鼠熒光二抗購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。1.2方法1.2.1

4、角膜緣干細(xì)胞的分離與培養(yǎng):動(dòng)物麻醉后,側(cè)臥位固定。青霉素、鏈霉素雙抗水沖洗結(jié)膜囊,眼周碘伏消毒。鋪手術(shù)洞巾,眼球表面麻醉。沿角膜緣環(huán)形剪開球結(jié)膜和結(jié)膜下筋膜后,環(huán)形剪取角膜緣外1mm 、角膜緣和角膜緣內(nèi)2mm 的角膜上皮組織(深約150m 。將其置于1.2U/ml 的Dispase 中消化2h ,剝離上皮層。用吸管反復(fù)吹打、離散細(xì)胞。1000r/min 離心5min ,收集細(xì)胞。細(xì)胞計(jì)數(shù)板下計(jì)數(shù)總細(xì)胞數(shù),加培養(yǎng)液(DMEM/F12+10%FBS ,5g/ml 胰島素,0.5g/ml 氫化可的松,20ng/ml EGF ,10ng/mlbFGF 制成細(xì)胞數(shù)為2×104/ml 的細(xì)胞懸液

5、。錐蟲藍(lán)測(cè)定細(xì)胞活性后,接種于用多聚賴氨酸處理的培養(yǎng)瓶,置CO 2培養(yǎng)箱中37培養(yǎng)。增齡對(duì)體外培養(yǎng)的兔角膜緣干細(xì)胞增殖能力的影響于花馬蕾基金項(xiàng)目:山西省衛(wèi)生廳科技攻關(guān)基金資助項(xiàng)目(200706作者單位:030001太原,山西醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院眼科通訊作者:馬蕾Effects of aging on the proliferation of in-vitro cultured limbal stem cells from rabbits YU Hua,MA Lei.De-partment of Ophthalmology,Second Hospital of Shanxi Medical Univ

6、ersity,Taiyuan 030001,China【Abstract 】Objective To investigate the effects of aging on the proliferation of in-vitro cultured limbal stemcells (LSCsfrom New Zealand rabbits.Methods Limbal epithelium harvested from New Zealand rabbits of different ages were enzymatically cleft into single cell suspen

7、sion and seeded at a same cell density.The growth status of LSCs was observed,with the use of immunofluorescence to identify cell proliferation,MTT to assess the proliferative capacity and flow cytometry to determine the cell cycle.Results The proliferative capacity of LSCs and percentage of prolife

8、 rating cells were the highest in the 2-month-old group compared with the 1.5-year-old and 3-year-old groups.Con-clusion The proliferation capacity of limbal stem cells was shown to decrease with aging.【Key words 】Stem cell ;Limbus corneae ;Aging ;Cell proliferation1.2.2免疫熒光染色鑒定:第二代細(xì)胞接種于多聚賴氨酸處理的蓋玻片上

9、,70%融合后取出,4%多聚甲醛固定,0.3%Triton×100破膜,5%牛血清白蛋白(BSA封閉30min,一抗在濕盒中4過夜,次日加入熒光標(biāo)記的二抗孵育1.5h,90%甘油封片。1.2.3角膜緣干細(xì)胞生長周期的檢測(cè):有絲分裂選擇法獲取M期的同步化細(xì)胞,接種于六孔板。細(xì)胞達(dá)80%融合時(shí)收集,70%的酒精種固定2h,RNA酶處理30min,加入10mg/ml的碘化丙啶4避光染色30min,流式細(xì)胞儀488nm檢測(cè)。1.2.4角膜緣干細(xì)胞增殖能力的測(cè)定:原代細(xì)胞70%80%融合后消化傳代,以細(xì)胞濃度為1.5×104/ml 接種于96孔板,加入培養(yǎng)液,于17d每天用MTT 法

10、測(cè)量角膜緣干細(xì)胞的增殖能力,用分光光度計(jì)測(cè)定波長595m的吸光度值(A。以時(shí)間(d為橫坐標(biāo),A值的細(xì)胞相對(duì)值為縱坐標(biāo),繪制各年齡段生長曲線。1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以x±s表示,多個(gè)樣本均數(shù)比較用方差分析,多重比較用SNK-q檢驗(yàn)。2結(jié)果2.1體外培養(yǎng)的角膜緣干細(xì)胞的生長特性:原代培養(yǎng)的細(xì)胞貼壁較慢,接種3d大部分細(xì)胞貼壁,可見細(xì)胞單個(gè)散在或三五個(gè)聚集在一起生長。培養(yǎng)6d 左右,即可達(dá)到80%90%融合。原代培養(yǎng)的細(xì)胞可見3種形態(tài):一種是圓形、橢圓形,類似基底的柱狀細(xì)胞;一種是多邊形,類似翼狀細(xì)胞;還有一種細(xì)胞呈大而扁平狀,類似表層上皮細(xì)胞。2個(gè)月齡組細(xì)胞貼壁后,形態(tài)較小,以圓形、橢

11、圓形和多邊形為主,形成的集落較大(圖1。1.5年齡組和3年齡組細(xì)胞較大,呈散在分布,部分細(xì)胞可見絲狀骨架結(jié)構(gòu)。局部細(xì)胞密集處可見典型的上皮“拉網(wǎng)”現(xiàn)象。形成集落較慢較小(圖2。傳代后2個(gè)月齡組角膜緣干細(xì)胞約1h后貼壁,第2天即開始增殖,較1.5年齡組和3年齡組貼壁早,潛伏期短。2.2免疫熒光染色結(jié)果:第二代角膜緣干細(xì)胞部分p63表達(dá)陽性(細(xì)胞質(zhì)綠染(圖3,部分角蛋白K3表達(dá)陽性(細(xì)胞質(zhì)綠染(圖4。2.3角膜緣干細(xì)胞生長周期比較:3個(gè)年齡組各周期所占比例見表1。2個(gè)月齡組增殖期(S+G2+M細(xì)胞比例明顯高于其他組,與1.5年齡組和3年齡組比較差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。3年齡組增殖期細(xì)胞比例較1.5年

12、齡組減小,但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義?？梢哉J(rèn)為隨著年齡的增加,增殖期細(xì)胞比例呈現(xiàn)減小的趨勢(shì)。2.4角膜緣干細(xì)胞的增殖能力及生長曲線:3個(gè)年齡組的第二代細(xì)胞生長曲線見圖5。由圖可見,角膜緣干細(xì)胞的對(duì)數(shù)增殖期大約在第36天,之后增殖緩慢,進(jìn)入生長平臺(tái)期。各年齡組年齡越小其達(dá)到峰值的時(shí)間越早。2個(gè)月齡組與1.5年齡組(q=6.03,P< 0.01以及2個(gè)月齡組與3年齡組(q=5.75,P<0.01峰值相比差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;1.5年齡組與3年齡組之間的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(q=0.28,P>0.05。3討論角膜上皮具有保護(hù)眼球,穩(wěn)定淚膜,維持角膜透明性等功能,其完整性的維持依賴于表淺細(xì)胞不斷

13、脫落和基底層角膜緣干細(xì)胞不斷增殖分化取代脫落細(xì)胞來實(shí)現(xiàn)2。作為角膜上皮細(xì)胞增殖的儲(chǔ)備力量, LSCs不僅可以分化、增殖為上皮細(xì)胞,維持角膜上皮細(xì)胞數(shù)目的平衡;更重要的是,它像一道屏障,阻止結(jié)膜上皮細(xì)胞和新生血管移行至角膜表面,這對(duì)于保持角膜的透明性與正常生理功能具有重要意義3。迄今為止,尚未發(fā)現(xiàn)角膜緣干細(xì)胞特異的標(biāo)志物。本實(shí)驗(yàn)選取目前比較公認(rèn)高表達(dá)的p634作為其陽性標(biāo)記,角蛋白K35作為其陰性標(biāo)記進(jìn)行鑒定。許多細(xì)胞的增殖能力在發(fā)育的不同階段明顯不同。Komiyama和Suzuki6比較了從出生后330d小鼠中分離的雪旺細(xì)胞增殖情況,發(fā)現(xiàn)年輕鼠的雪旺細(xì)胞胸苷攝入明顯大于老齡鼠,而且融合所需要的

14、時(shí)間也短,說明隨著鼠齡的增大,細(xì)胞的增殖能力下降。本研究細(xì)胞周期中,隨著年齡的增大,增殖期S+ G2+M細(xì)胞的百分比例減少,靜止期比例增加,表明細(xì)胞的增殖能力隨著年齡的增加而下降?；罴?xì)胞線表1不同年齡新西蘭兔LSCs細(xì)胞周期所占比例(%(x±s組別G0+G1S G2+M S+G2+M2個(gè)月齡組58±538.0±2.63.5±1.042±4ab1.5年齡組73±712.2±2.714.9±4.127±63年齡組80±47.2±1.312.8±4.020±5注:a與1.

15、5年齡組比較q=4.01,P<0.05;b與3年齡組比較q= 5.99, P<0.01粒體中的琥珀酸脫氫酶能使外源性MTT還原為藍(lán)色甲眃顆粒,且生成量與活細(xì)胞數(shù)量及細(xì)胞活化狀態(tài)呈線性關(guān)系7。二甲基亞砜能溶解顆粒,用酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀測(cè)定其吸收值,可間接反映活細(xì)胞數(shù)量與功能。從MTT生長曲線可以看出2個(gè)月齡組與3年齡組的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,表明3年齡組增殖能力和活性較弱。可見,隨著年齡的增加,角膜緣干細(xì)胞的增殖能力和活性相應(yīng)減弱。這或許是老年患者角膜上皮損傷后愈合緩慢的原因之一。細(xì)胞衰老是細(xì)胞內(nèi)部結(jié)構(gòu)的衰變,細(xì)胞生理功能的衰退和喪失,和細(xì)胞的壽命密切相關(guān)。Hayflick 8報(bào)道,在同一動(dòng)

16、物中由于個(gè)體健康情況及年齡的差異,體外成纖維細(xì)胞的培養(yǎng)壽命不同。例如人胚胎成纖維細(xì)胞可傳5060代,出生后至15歲可培養(yǎng)2040代,而15歲以后則僅能傳1030代,早老癥患者成纖維細(xì)胞只能在體外傳210代。這些說明,體外培養(yǎng)的二倍體細(xì)胞的增殖能力反映了它們?cè)隗w內(nèi)的衰老狀況。本研究通過對(duì)三個(gè)年齡組新西蘭兔角膜緣干細(xì)胞的體外培養(yǎng)、比較,發(fā)現(xiàn)隨著年齡的增長,其增殖能力下降,呈現(xiàn)老化的趨勢(shì)。(本文圖1-4見插頁第5-1頁參考文獻(xiàn)1Dunnwald M,Tomanek-chalkley A,Alexandrunas D,et al.Iso-lating a pure population of epid

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