全腦缺血再灌注損傷后ERK在大鼠海馬的表達(dá)及熱休克預(yù)處理對(duì)其

1、全腦缺血再灌注損傷后ERK在大鼠海馬的表達(dá)及熱休克預(yù)處理對(duì)其表達(dá)論文【關(guān)鍵詞】 腦缺血；再灌注損傷；熱休克預(yù)處理；細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)MAP激酶類(lèi)Expression of ERK in rat hippocampus after global cerebral ischemia/reperfusion and effect of heat shock preconditioning on it【Abstract】 AIM: To investigate the expression of ERK in hippocampus of SD rats after global cerebral isc

2、hemia/reperfusion and the effect of heat shock preconditioning on it, and to clarify the role of ERK in global cerebral ischemia/reperfusion injury. METHODS: Ninety healthy male SD rats were divided into 3 groups randomly: sham operation group (SO group, n=30), ischemia/reperfusion group (IR group,

3、n=30) and heat shock preconditioning group (HSP group, n=30). Global cerebral ischemia/reperfusion model was produced by 4VO method. The rats were put in 42 for 15 min as heat shock preconditioning, then subjected to 6 min ischemia followed by 2, 6, 12, 24 h, 3, 5 d reperfusion, and all rats were ex

4、ecuted at corresponding time points. HE staining, immunohistochemical staining and TUNEL staining of brain tissue section were performed. RESULTS: In CA1 of IR group, ERK was expressed 2 h after global cerebral ischemia/reperfusion, peaked at 24 h and still lasted at 5 d. Expression in CA3 was weake

5、r than that in CA1 and cellular damage in CA1 was more obvious. Expression of ERK in CA1 and CA3 of HSP group were weaker than that in IR group at each time points (P<0.05). At the same time, cellular damage was weaker and apoptotic cells decreased(P<0.05). CONCLUSION: Overexpression of ERK af

6、ter global cerebral ischemia/reperfusion participated in the neuronal injury procedure and heat shock preconditioning exerted its brain protective function through its suppressive effect on the overexpression of ERK.【Keywords】 brain ischemia; reperfusion injury; heat shock preconditioning; extracell

7、ular signalregulated MAP kinases【摘要】 目的： 研究全腦缺血再灌注損傷后ERK在SD大鼠海馬的表達(dá)及熱休克預(yù)處理對(duì)其表達(dá)的影響，以闡明ERK在腦缺血再灌注損傷中作用機(jī)制. 方法： 健康雄性SD大鼠90只，隨機(jī)分為假手術(shù)組（SO組，n=30），缺血再灌注組（IR組，n=30），熱休克預(yù)處理組（HSP組，n=30），以四血管法建立全腦缺血再灌注模型，將大鼠置于42中15 min行熱休克預(yù)處理，全腦缺血6 min后2, 6, 12, 24 h, 3, 5 d再灌注后處死，取海馬組織行HE染色，ERK免疫組化染色，TUNEL法檢測(cè)凋亡細(xì)胞. 結(jié)果： IR缺血再灌注后2

8、 h ERK在CA1區(qū)開(kāi)始表達(dá)，24 h達(dá)到高峰，5 d仍有表達(dá)，CA3區(qū)弱于CA1區(qū)，同時(shí)CA1區(qū)細(xì)胞損傷明顯，HSP組ERK在CA1和CA3區(qū)相應(yīng)時(shí)點(diǎn)均弱于IR組（P<0.05），細(xì)胞損傷輕微，凋亡細(xì)胞減少（P<0.05）. 結(jié)論： 全腦缺血再灌注損傷后ERK過(guò)度表達(dá)參與了神經(jīng)元損傷過(guò)程，熱休克預(yù)處理通過(guò)下調(diào)ERK過(guò)度表達(dá)具有腦保護(hù)作用. 【關(guān)鍵詞】 腦缺血；再灌注損傷；熱休克預(yù)處理；細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)MAP激酶類(lèi)0引言近來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，腦血流中斷和再灌注使腦組織細(xì)胞產(chǎn)生損傷級(jí)聯(lián)反應(yīng)至少涉及4個(gè)不同機(jī)制：能量障礙、興奮性氨基酸毒性、梗死周?chē)O化、炎癥及程序性細(xì)胞死亡，上述機(jī)制均與信號(hào)

9、通路調(diào)節(jié)有關(guān)1. 絲裂素活化蛋白激酶（MAPK）家族成員是連接細(xì)胞膜表面受體與決定性基因表達(dá)之間重要調(diào)節(jié)酶，但對(duì)其成員之一ERK1/2（細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶）在腦缺血再灌注損傷中作用的研究結(jié)果卻相互矛盾，熱休克預(yù)處理可通過(guò)誘發(fā)產(chǎn)生熱休克蛋白而具有腦保護(hù)作用2，因此我們觀察SD大鼠全腦缺血再灌注損傷后ERK蛋白在海馬的表達(dá)及熱休克預(yù)處理對(duì)其表達(dá)的影響，以闡明ERK在全腦缺血再灌注損傷中的作用機(jī)制.1材料和方法1.1材料健康雄性SD大鼠90只，由西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院動(dòng)物中心提供，鼠齡5060 d，體質(zhì)量(300±12) g，隨機(jī)分為3組，假手術(shù)組（SO, n=30），缺血再灌注組（IR, n

10、=30）和熱休克預(yù)處理組（HSP, n=30），各組6個(gè)時(shí)間段每時(shí)段5只. TUNEL試劑盒購(gòu)自德國(guó)寶靈曼公司，ERK多克隆兔抗鼠抗體及辣根酶標(biāo)記鏈霉卵白素試劑盒由美國(guó)Santa Gruz Bioteohnolgy公司生產(chǎn). 1.2方法1.2.1動(dòng)物模型制備所有動(dòng)物均以20 g/L戊巴比妥鈉40 mg/kg行腹腔內(nèi)注射麻醉，待翻正反射消失后俯臥固定于手術(shù)臺(tái)上，在大鼠枕頸正中切開(kāi)皮膚顯露枕后三角，在顯微鏡下于枕后三角外側(cè)與第一橫突之間找到椎動(dòng)脈博動(dòng)后，以25 mV電凝器凝斷雙側(cè)椎動(dòng)脈，逐層縫合，術(shù)畢回籠，使其體溫維持37左右. 24 h后以同樣方法麻醉，在胸鎖乳突肌后氣管旁，顯露頸總動(dòng)脈，用無(wú)創(chuàng)

11、動(dòng)脈夾同時(shí)夾閉6 min，期間密切觀察其瞳孔變化，無(wú)瞳孔散大者予以剔除，逐層縫合后回籠. 給予2, 6, 12, 24 h, 3, 5 d再灌注后處死. HSP組： 將SD大鼠置于可控溫箱中42 15 min，于24 h后和IR組同樣處理. SO組： 除不凝斷椎動(dòng)脈和夾閉頸總動(dòng)脈外，其他處理同IR組. 1.2.2組織學(xué)檢查到要求時(shí)間時(shí)麻醉后于劍突下橫向剪開(kāi)腹壁顯露膈肌，將其沿胸壁左右向剪開(kāi)，將胸前壁離斷掀起，顯露心臟，用9號(hào)針從心尖插入心室，剪開(kāi)右心房，先用生理鹽水然后再用4 g/L多聚甲醛200 mL灌注至肝臟變白、四肢僵硬，斷頭取腦，在視交叉后1 mm及4 mm處冠狀切面切開(kāi)，取中間塊，固

12、定后石蠟包埋，在海馬齒狀回互包平面連續(xù)冠狀切片，片厚4 m. 行HE染色，光鏡下觀察SD大鼠海馬CA1，CA3區(qū)細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化，采用TUNEL法原位檢測(cè)凋亡細(xì)胞，顯示細(xì)胞核有明顯的黃棕色顆?；虬咂瑸殛?yáng)性細(xì)胞，即凋亡細(xì)胞，定量分析方法為： 光鏡下計(jì)算凋亡指數(shù). 凋亡指數(shù)（apoptosis index, AI）計(jì)算方法： 每只動(dòng)物隨機(jī)兩張切片，每張切片觀察CA1或CA3區(qū)，分別計(jì)算各區(qū)凋亡細(xì)胞數(shù)和總細(xì)胞數(shù). AI=凋亡細(xì)胞數(shù)/總細(xì)胞數(shù)×100%. 1.2.3免疫組織化學(xué)將切片脫蠟，微波修復(fù)抗原，置入30 mL/L H2O2室溫下孵育10 min，滴加正常山羊血清封閉液，室溫10 min，滴加ERK多克隆抗體，為濃縮一抗，使用時(shí)用PBS稀釋為150進(jìn)行滴定，滴加辣根酶標(biāo)記鏈霉卵白素，37孵育30 min, DAB顯色試劑顯色. 組織切片中顯示細(xì)胞漿或細(xì)胞核有明顯黃棕色顆?；虬咂瑸镋RK陽(yáng)性. 1.2.4灰度測(cè)定及結(jié)果判斷采用德國(guó)LeicaQ550E高清晰彩色圖文分析計(jì)算機(jī)系統(tǒng)對(duì)陽(yáng)性結(jié)果進(jìn)行半定量測(cè)定，將攝