枯草芽孢桿菌的發(fā)酵

1、枯草芽孢桿菌的發(fā)酵學(xué)院：化工學(xué)院專業(yè)：生物工程班級：生物10-2姓名：姜霞摘要枯草芽孢桿菌是我國農(nóng)業(yè)部允許作為飼料添加劑的15種菌種之一 ,其已被越來越多地制成飼用微生態(tài)制劑。因其制劑是無毒、無殘留、無污染 的“綠色”添加劑，故具有廣闊的發(fā)展前景，并已在畜牧業(yè)、飼料業(yè)廣泛應(yīng)用，顯示巨大的社會(huì)效益和生態(tài)效益。通過搖床培養(yǎng)篩選出較適宜于枯草芽孢桿菌發(fā)酵的培養(yǎng)基配方，發(fā)酵培養(yǎng)基配方確定后，在搖床條件下，通過對溫度、初始值、初始接種量、裝液量、搖床轉(zhuǎn)速等發(fā)酵條件的摸索，確定最佳發(fā)酵條件。在搖瓶條件下優(yōu)化發(fā)酵培養(yǎng)基和發(fā)酵工藝后，采用發(fā)酵罐進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，對枯草芽孢桿菌在液體發(fā)酵過程中的菌體數(shù)量、值、總糖含

2、量和總氮含量四個(gè)因素隨時(shí)間的變化進(jìn)行了觀察?？莶菅挎邨U菌，是芽孢桿菌屬的一種。單個(gè)細(xì)胞 0.70.8×23微米，著色均勻。無莢膜，周生鞭毛，能運(yùn)動(dòng)。革蘭氏陽性菌，芽孢0.60.9×1.01.5微米，橢圓到柱狀，位于菌體中央或稍偏，芽孢形成后菌體不膨大。菌落表面粗糙不透明，污白色或微黃色?？莶菅挎邨U菌菌體生長過程中產(chǎn)生的枯草菌素、多粘菌素、制霉菌素、短桿菌肽等活性物質(zhì)，這些物質(zhì)對致病菌或內(nèi)源性感染的條件致病菌有明顯的抑制作用?？莶菅挎邨U菌迅速消耗環(huán)境中的游離氧，造成腸道低氧，促進(jìn)有益厭氧菌生長，并產(chǎn)生乳酸等有機(jī)酸類，降低腸道pH值，間接抑制其它致病菌生長?？莶菅挎邨U菌菌體自身

3、合成-淀粉酶、蛋白酶、脂肪酶、纖維素酶等酶類，在消化道中與動(dòng)物體內(nèi)的消化酶類一同發(fā)揮作用，能合成維生素B1、B2、B6、煙酸等多種B族維生素，提高動(dòng)物體內(nèi)干擾素和巨噬細(xì)胞的活性，在飼料中應(yīng)用廣泛。它還可以用來改善水質(zhì)，應(yīng)用在污水處理和環(huán)境保護(hù)中。和其它微生物混合使用，還可以用于生物肥料和土地改良等 關(guān)鍵詞：枯草芽孢桿菌 生長 發(fā)酵 活菌數(shù)第一章 材料與方法1.1材料菌種枯草芽孢桿菌培養(yǎng)基（1）LB培養(yǎng)基：蛋白胨10g，酵母膏5g，NaCl10g，蒸餾水1000ml，pH為7，（可溶性淀粉20g）瓊脂20g。（2）篩選用培養(yǎng)基：含有2%可溶性淀粉的LB培養(yǎng)基。（3）種子培養(yǎng)基：豆餅粉4%，玉米粉

4、3%，NaHPO0.8%，(NH)SO0.4%，NHCl0.15%，HO。（4）發(fā)酵培養(yǎng)基：豆餅粉5.6%，玉米粉7.2%，NaHPO0.8%，(NH)SO0.4%，NHCl0.13%，CaCl0.13%，淀粉酶50g。主要試劑蔗糖、葡萄糖、淀粉、玉米淀粉、麥芽糖、酵母浸出物、胰蛋白胨、牛肉膏、尿素、氯化銨、硫酸錳、硫酸鎂、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、硫酸亞鐵、氯化鈉和氯化鈣。儀器設(shè)備控溫?fù)u床、高壓蒸氣滅菌鍋、電子天平、pH測定儀、無菌操作臺(tái)和紫外分光光度計(jì)。1.2方法1.2.1 培養(yǎng)基的制備(1)稱量按培養(yǎng)基配比依次準(zhǔn)確地稱取酵母膏、NaCl、蛋白胨放入燒杯中，并在燒杯中加入少量蒸餾水。注：酵母

5、膏常用玻棒挑取，放在小燒杯或表面皿中稱量，用熱水溶化后倒入燒杯，也可放在稱量紙上，稱量后直接放入水中，這時(shí)如稍微加熱，酵母膏便會(huì)與稱量紙分離，然后立即取出紙片。(2)溶化可溶性淀粉溶液的配制方法：將所需克數(shù)的可溶性淀粉放入一個(gè)小燒杯中，加入少量蒸餾水，攪拌成糊狀，然后將糊狀溶液均勻倒入少于培養(yǎng)基總體積的沸水中，一邊攪拌一邊加熱，待其溶化成透明狀后繼續(xù)在電爐上加熱5分即制成可溶性淀粉溶液。如果配制固體培養(yǎng)基時(shí)，將已準(zhǔn)備好的可溶性淀粉溶液倒入燒杯中，將稱好的瓊脂放入已溶的藥品中，再加熱溶化，補(bǔ)水到所需的總體積。在制備用三角瓶盛固體培養(yǎng)基時(shí)，一般也可先將一定量的液體培養(yǎng)基分裝于三角瓶中，然后按2%的

6、量將瓊脂直接分別加入各三角瓶中，不必加熱溶化，而是滅菌和加熱溶化同步進(jìn)行，節(jié)省時(shí)間。在瓊脂溶化過程中，應(yīng)控制火力，以免培養(yǎng)基因沸騰而溢出容器。同時(shí)，需不斷攪拌，以防瓊脂糊底燒焦。配制培養(yǎng)基時(shí)，不能用銅或鐵鍋加熱溶化，以免離子進(jìn)入培養(yǎng)基中，影響細(xì)菌生長。(3)調(diào)pH培養(yǎng)基配好以后，先用精密pH試紙測量培養(yǎng)基的原始pH，如果偏酸，用滴管向培養(yǎng)基中逐滴加1mol/LNaOH，邊加邊攪拌，并隨時(shí)用pH試紙測其pH，直到pH達(dá)7為止；反之，用1mol/LHCl進(jìn)行調(diào)節(jié)。對于有些要求pH較精細(xì)的微生物，其pH的調(diào)節(jié)可用酸度計(jì)進(jìn)行。注意：pH不要調(diào)過頭，以避免回調(diào)而影響培養(yǎng)基內(nèi)各離子的濃度，配制pH低的瓊脂

7、培養(yǎng)基時(shí)，若預(yù)先調(diào)好pH并在高壓蒸汽下滅菌，則瓊脂因水解不能凝固，因此應(yīng)將培養(yǎng)基的成分和瓊脂分開滅菌后再混合，或在中性pH條件下滅菌，再調(diào)整pH。(4)分裝按照實(shí)驗(yàn)要求，可將配置的培養(yǎng)基分裝入試管內(nèi)或三角瓶中。液體分裝：分裝的高度以試管高度的1/4左右為宜；分裝三角瓶的量則根據(jù)需要而定，一般以不超過三角瓶的一半為宜。固體分裝：分裝于試管中的應(yīng)不超過試管的1/5，滅菌后制成斜面；分裝三角瓶的量以不超過一半為宜。(5)加塞培養(yǎng)基分裝完畢后，在試管口上塞上棉塞，以阻止外界微生物進(jìn)入培養(yǎng)基內(nèi)而造成污染，并保證有良好的通氣性能。(6)包扎加塞后，將全部試管用麻繩捆好，再在棉塞外包一層牛皮紙，以防止滅菌時(shí)

8、冷凝水潤濕棉塞，外邊再用一道麻繩扎好。用記號筆注明培養(yǎng)基名稱，組別，配制日期。三角瓶加塞后，外包牛皮紙，用麻繩以活結(jié)扎好，使用時(shí)容易解開，同樣注明。(7)滅菌將配置好且包扎完畢的固體、液體培養(yǎng)基及本實(shí)驗(yàn)涉及的試管、三角瓶等及400ml純水于高壓滅菌器中以0.14Mpa，121條件下高壓蒸汽滅菌20分鐘。(8)斜面擱置將培養(yǎng)基冷卻至50左右時(shí)放置斜面，斜面在試管的1/2處為宜，待斜面凝固后，放置于冰箱中待用。菌種的篩選與保藏(1)倒平板將實(shí)驗(yàn)配制好的培養(yǎng)基加熱溶化，待冷卻至5560時(shí)，倒平板9皿。(2)稀釋用接種環(huán)取菌種，放入盛90ml無菌水的三角瓶中，振搖。用一支1ml無菌吸管吸取1ml菌液加

9、入盛有9ml無菌水的大試管中充分混勻，然后用無菌吸管從此試管中吸取1ml加入另一盛有9ml無菌水的試管中，混合均勻，以此類推制成10、10、10、10、10、10不同稀釋度的菌液。(3)劃線將平板底面分別用記號筆寫上10、10、10三種稀釋度（共三組）然后用接種環(huán)分別沾取濃度為10、10、10稀釋液并對號在相應(yīng)平板上劃線，室溫下靜止510min，使菌液吸附進(jìn)培養(yǎng)基。(4)培養(yǎng)將培養(yǎng)基平板倒置于37的培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)23天，觀察淀粉圈。對有淀粉圈的菌落，測量淀粉圈的直徑D，菌落直徑，計(jì)算的比值，可進(jìn)行拍照，選擇淀粉圈較大的菌落作為后續(xù)實(shí)驗(yàn)的菌種。(5)接種接種到斜面培養(yǎng)基中，標(biāo)注上日期等信息。放入

10、恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)作為一級種子。(6)保藏斜面置于37的培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)23天，觀察菌種長勢好壞，若菌種長勢好則將其放入冰箱中保藏，若長勢不好則需多次斜面轉(zhuǎn)接。枯草芽孢桿菌生長曲線測定(1)取 12支無菌大試管，用記號筆分別標(biāo)明培養(yǎng)時(shí)間即12,13,14,15,16,17,18,19,20,21,22和23h。(2)接種用1ml無菌吸管吸取2ml枯草芽孢桿菌培養(yǎng)液（培養(yǎng)1012h）轉(zhuǎn)入盛有100mlLB液的三角瓶內(nèi)，混合均勻。(3)培養(yǎng)將已接種的三角瓶放置37振蕩培養(yǎng)（振蕩頻率為100r/min）分別在培養(yǎng)12,13,14,15,16,17,18,19,20,21,22和23h時(shí)，用無菌吸管吸取1

11、ml菌液放入標(biāo)有相應(yīng)時(shí)間的無菌試管中，立即放入冰箱中儲(chǔ)存，最后一同比濁測定光密度值。(4)比濁測定用無菌水作空白對照，選用660nm波長進(jìn)行光電比濁測定，從早取出的培養(yǎng)液開始依次測定，對細(xì)胞密度大的培養(yǎng)液用無菌水適當(dāng)稀釋后，使其光密度值在0.10.65之內(nèi)的生長情況。菌體進(jìn)入對數(shù)生長期即可作為二級種子液用于分批培養(yǎng)發(fā)酵實(shí)驗(yàn)。（測定PH值前，將待測定的培養(yǎng)液震蕩，使細(xì)胞均勻分布）。PH值測定結(jié)果培養(yǎng)時(shí)間（h）12345678PH值6.56.76.97.17.37.06.86.4菌種搖瓶培養(yǎng)（1）稱量 根據(jù)需要量計(jì)算并依此稱取豆餅粉、玉米粉、NaHPO、(NH)SO、NHCl放入三角瓶中，配成20

12、0ml溶液。（2）加塞包裝。（3）滅菌 0.14Mpa，121,20min。（4）接種 接種前一級種子需先放在恒溫培養(yǎng)箱活化（37、12h），冷卻后接種。（5）培養(yǎng) 放入氣浴恒溫振蕩器中37,100r/min培養(yǎng)13h后，鏡檢，觀察菌的生長情況。菌體進(jìn)入對數(shù)生長期即可作為二級種子液用于分批培養(yǎng)發(fā)酵實(shí)驗(yàn)。產(chǎn)淀粉酶枯草芽孢桿菌分批培養(yǎng)發(fā)酵（1）稱量 根據(jù)需要量計(jì)算并依次稱量豆餅粉、玉米粉、NaHPO、(NH)SO、NHCl、CaCl、淀粉酶，放入發(fā)酵罐中加入蒸餾水配制2.5L發(fā)酵液。（2）滅菌 0.14Mpa，121,20min。（3）接種（4）啟動(dòng)發(fā)酵罐，調(diào)節(jié)發(fā)酵系數(shù)，開始發(fā)酵。發(fā)酵參數(shù)：溫度

13、37轉(zhuǎn)速 200r/min通氣量 1.33VVm（012h）2.67VVm（12h發(fā)酵結(jié)束）pH值 6.5（5）測PH值，繪制生長曲線，并進(jìn)行鏡檢，觀察菌體生長狀況。（6）發(fā)酵結(jié)束，放罐。第二章 結(jié)果與分析2.1菌種篩選及保藏由于實(shí)驗(yàn)要篩選的菌種已經(jīng)很純了，所以此次實(shí)驗(yàn)所提到的“篩選”，是要篩選出有活力的、生長狀態(tài)良好的純種枯草芽孢桿菌。通過加入少量的可溶性淀粉酶，可以使菌種進(jìn)行選擇性培養(yǎng)，這樣篩選出來的菌株可以更好地產(chǎn)淀粉酶。篩選出來的菌種要進(jìn)行保藏，此實(shí)驗(yàn)的保藏方法是放在冰箱中保藏。2.2擴(kuò)大培養(yǎng)此次實(shí)驗(yàn)采用一次擴(kuò)大培養(yǎng)，方法是搖瓶培養(yǎng)。擴(kuò)大培養(yǎng)用的培養(yǎng)基與發(fā)酵培養(yǎng)基相似。在氣浴恒溫振蕩器

14、中，發(fā)現(xiàn)搖瓶中變渾濁，而且表面有很多氣泡，這說明菌體開始生長了。培養(yǎng)特定時(shí)間后，生長出來的菌種就可以用于發(fā)酵了。2.3發(fā)酵發(fā)酵采用的方式是分批培養(yǎng)發(fā)酵，在一切做好準(zhǔn)備后，進(jìn)行無菌操作，把菌體放入發(fā)酵罐中進(jìn)行發(fā)酵。整個(gè)過程都是需要時(shí)刻進(jìn)行調(diào)節(jié)的，主要的調(diào)節(jié)項(xiàng)目為溫度、pH值，因?yàn)榫w在生長的各個(gè)階段，溫度和pH都有所變化，而想要生產(chǎn)出產(chǎn)品，就要控制好這兩個(gè)參數(shù)。溫度控制主要通過加冷卻水來進(jìn)行，但要注意適量，不能太過。pH值的控制主要通過加氨水來調(diào)節(jié)，因?yàn)殡S著菌體生長和產(chǎn)物產(chǎn)生，環(huán)境pH值會(huì)不斷下降呈酸性，所以要不斷加氨水來控制。第三章 結(jié)論枯草芽孢桿菌在培養(yǎng)過程中，由于培養(yǎng)條件掌握不好，常出現(xiàn)活

15、菌數(shù)量低，芽孢形成率低等問題。本研究通過一系列單因素實(shí)驗(yàn),確定了枯草芽孢桿菌的最佳發(fā)酵條件。通過對枯草芽孢桿菌進(jìn)行篩選、擴(kuò)大培養(yǎng)和發(fā)酵的控制，很好的了解了生物產(chǎn)品生產(chǎn)的中游部分的各個(gè)步驟，初步學(xué)習(xí)了這幾部分的主要注意事項(xiàng)，尤其對發(fā)酵有了一個(gè)初步的認(rèn)識，學(xué)會(huì)了控制發(fā)酵的相關(guān)參數(shù)。通過測量PH值，也了解了菌體的生長趨勢。培養(yǎng)基優(yōu)化方法多是在單因素水平試驗(yàn)的基礎(chǔ)上進(jìn)行正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)或是在正交試驗(yàn)基礎(chǔ)上應(yīng)用均勻設(shè)計(jì)理論，或者采用通用旋轉(zhuǎn)組合設(shè)計(jì)，均能對培養(yǎng)基優(yōu)化取得較好的效果。在工業(yè)化生產(chǎn)中，還需要對接種量、pH、溫度、轉(zhuǎn)速、通風(fēng)比、溶氧、以及消泡劑用量等一系列因素進(jìn)行嚴(yán)格控制，才能保證枯草芽孢桿菌發(fā)酵活菌數(shù)達(dá)到最高、發(fā)酵效果最好、在動(dòng)物飼料里的添加效果最理想。第四章 參考文獻(xiàn)1 吳玲, 何穎. 瑞士乳桿菌增菌培養(yǎng)基的篩選J. 常州工程職業(yè)技術(shù)學(xué)院學(xué)報(bào), Vol. 4 2007 December No.54.2 西北農(nóng)林科技大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版）, Vol.38 No.7 Ju.1.2010.3 馮宇，高年發(fā)，張穎. 短乳桿菌生產(chǎn)-氨基丁酸培養(yǎng)基的優(yōu)化J. 現(xiàn)代