聯(lián)合應(yīng)用細(xì)胞遺傳學(xué)、巢式RTPCR和FISH技術(shù)檢測慢性髓系白血病治療過程中的腫瘤負(fù)荷

1、聯(lián)合應(yīng)用細(xì)胞遺傳學(xué)、巢式RTPCR和FISH技術(shù)檢測慢性髓系白血病治療過程中的腫瘤負(fù)荷        【摘要】     本研究探討常規(guī)細(xì)胞遺傳學(xué)(conventional cytogenetics, CC)、巢式逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(nestedreverse transcriptase polymerase chain reaction, nestedRTPCR)及雙色雙融合熒光原位雜交(dualcolor and dualfusion fluorescence i

2、n situ hybridization, DFISH) 三種技術(shù)監(jiān)測慢性髓系白血病(chronic myeloid leukemia，CML)患者造血干細(xì)胞移植治療過程中腫瘤負(fù)荷的靈敏度和特異性。聯(lián)合應(yīng)用CC、巢式RTPCR 和DFISH三種技術(shù)對7例CML患者非清髓性異基因干細(xì)胞移植治療前后的腫瘤負(fù)荷水平進(jìn)行檢測。檢測結(jié)果顯示： 7例CML患者治療前后的40份骨髓標(biāo)本中，有29份標(biāo)本檢出不同比率的Ph染色體；3份因細(xì)胞數(shù)少CC分析失?。?6份標(biāo)本RTPCR檢測結(jié)果為陽性。病例1移植后12、18、26及38個(gè)月的4份標(biāo)本Ph染色體及RTPCR結(jié)果均為陰性。病例1移植后9、10個(gè)月、病例2移植

3、后15個(gè)月、病例3移植后12個(gè)月的4份Ph(-)bcr/abl(+)標(biāo)本經(jīng)FISH檢測，分別檢出5.4%、 0%、 16.5%及1.5%的bcr/abl(+)細(xì)胞。病例5移植后20、60天、病例7移植后40天的3份標(biāo)本因細(xì)胞數(shù)少而CC核型分析失敗，對其行FISH檢測，結(jié)果bcr/abl(+)細(xì)胞檢出率分別為55.0%、27.5%和73.5%。病例1移植后12個(gè)月Ph(-)bcr/abl(-)的標(biāo)本行FISH檢測，結(jié)果bcr/abl(+)細(xì)胞檢出率為0%。結(jié)論： CC可作為監(jiān)測CML患者治療過程中腫瘤負(fù)荷水平的基本手段。在移植后早期細(xì)胞數(shù)太少而無法進(jìn)行CC檢測，以及治療病人體內(nèi)腫瘤負(fù)荷降低到CC

4、不能檢出而RTPCR仍為陽性時(shí)，借助FISH準(zhǔn)確檢測體內(nèi)腫瘤負(fù)荷，以監(jiān)測其動(dòng)態(tài)變化。FISH檢測bcr/abl轉(zhuǎn)陰的病人需靠靈敏度更高的RTPCR監(jiān)測核定。     【關(guān)鍵詞】  慢性髓系白血??；細(xì)胞遺傳學(xué)；聚合酶鏈反應(yīng)；熒光原位雜交    Detection of Tumor Load in Chronic Myeloid Leukemia During Treatment with Transplantation by Conventional Cytogenetics,  NestedRT

5、PCR and FISH    WANG HuiPing1,2 ,LI GuoXia1, QIAO ZhenHua1, WANG HongWei1    1Department of Hematology, The Second Hospital of Shanxi Medical University, Taiyuan 030001,China；2Central Experimental Laboratory, The First People Hospital, Shanghai Jiaotong University, Shan

6、ghai 200080，China    Abstract    This study was purposed to investigate the sensitivity and specificity of conventional cytogenetics (CC),nestedreverse transcriptase polymerase chain reaction (nestedRTPCR) and dualcolor / dualfusion fluorescence in situ hybridization (D

7、FISH) technique in monitoring the tumor load of chronic myeloid leukemia (CML) during treatment with transplantation. CC, nestedRTPCR and interphase DFISH were simultaneously carried out to detect the tumor load of 7 CML patients during treatment with nonmyeloablative allogentic stem cell transplant

8、ation(alloNSCT).40 specimens from 7 CML patients before and after alloNSCT were analyzed.  The results showed that 29 specimens were Ph(+) with different positive ratio and 3 specimens with lower cells were not analyzed by CC. 36 specimens were bcr/abl mRNA (+) by RTPCR. 4 specimens from case 1

9、 at 12，18，26 and 38 months  after alloNSCT were Ph(-) and bcr/abl mRNA (-),4 Ph(-)bcr/abl(+) specimens containing  2 from case 1 at 9 and 10 months after  alloNSCT, 1 from case 2 at 15 months after  alloNSCT, 1 from case 3 at 12 months after  alloNSCT showed 5.4%, 0%, 16.5%&

10、#160; and 1.5% bcr/abl(+) cells by FISH. 3 specimens with lower cells containing 2 from case 5 at 20 and 60 days after alloNSCT and 1 from case 7 at 40 days after  alloNSCT were analyzed by FISH and showed 55.0%, 27.5%  and 73.5%  bcr/abl(+) cells. The Ph (-) bcr/abl(-) specimen from

11、case 1 at 12 monthss postalloNSCT showed 0% bcr/abl (+) cells by FISH. It is  concluded that CC can be used as a basic tool to monitor the change of tumor load in CML during treatment. When specimen with lower cells can not be analyzed by CC in early period after alloNSCT, or result of CC can n

12、ot evaluate precisely dynamic change of tumor load and when tumor load in treated patient  are lower to Ph(-) by CC while bcr/abl mRNA (+) by RTPCR, FISH must be used to detect precisely tumor load and monitor dynamic change of it. More sensitive RTPCR is used to monitor tumor load when it is l

13、ower to bcr/abl(-) by FISH during treatment.    Key words    chronic myeloid leukemia; cytogenetics; polymerase chain reaction; fluorescence in situ hybridization    J Exp Hematol 2007; 15(2):-    Ph染色體是慢性髓系白血?。–ML）的標(biāo)志染色體，其本質(zhì)是t(9;22)(q34;q1

14、1)易位，易位的結(jié)果使位于9號(hào)染色體長臂3區(qū)4帶 (q34) 上的cabl原癌基因與22號(hào)染色體長臂上一個(gè)功能未明的斷裂點(diǎn)簇集區(qū)(breakpoint cluster region, BCR)發(fā)生拼接，形成bcr/abl融合基因。易位形成的Ph染色體及相應(yīng)的bcr/abl融合基因是CML發(fā)病的分子基礎(chǔ)，也是CML的惡性克隆標(biāo)志。在評價(jià)CML對各種治療如INF、骨髓移植、格列衛(wèi)等的反應(yīng)程度時(shí)，準(zhǔn)確判斷患者骨髓細(xì)胞中的腫瘤負(fù)荷十分重要。我們聯(lián)合應(yīng)用常規(guī)細(xì)胞遺傳學(xué)(CC)、巢式逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(nestedRTPCR)及雙色雙融合熒光原位雜交(DFISH)技術(shù)對7例非清髓性異基因干細(xì)胞移植治療的C

15、ML患者的腫瘤負(fù)荷水平進(jìn)行檢測，探討3種技術(shù)對監(jiān)測CML患者治療過程中腫瘤負(fù)荷的靈敏度和特異性。    病例    7例CML患者系我院血液科2001年9月-2005年1月就診的住院病人,均符合血液病診斷及療效標(biāo)準(zhǔn)臨床診斷標(biāo)準(zhǔn)，其中男性5例,女性2例，年齡19-56歲，中位年齡38歲。7例患者均行非清髓性異基因干細(xì)胞移植，術(shù)后根據(jù)臨床反應(yīng)及嵌和體形成情況給予供體淋巴細(xì)胞輸注。陰性對照為3例健康供體骨髓細(xì)胞,陽性對照為K562細(xì)胞。    常規(guī)細(xì)胞遺傳學(xué)分析    采用骨髓直接

16、法和(或)24小時(shí)短期培養(yǎng)法按常規(guī)制備染色體并進(jìn)行顯帶核型分析。染色體核型異常按人類細(xì)胞遺傳學(xué)國際命名體制(ISCN)(1995)進(jìn)行描述,每份標(biāo)本至少分析10個(gè)中期細(xì)胞。    bcr/abl融合基因轉(zhuǎn)錄本的巢式RTPCR檢測    巢式RTPCR按我室常規(guī)方法進(jìn)行。外測引物序列為：C:5GCTTCTCCCTGACATCCGTG3，D:5CGAGCGGCTTCACTCAGACC3內(nèi)測引物序列為：A:5CTCCAGACTGTCCACAGCATTCCG3，B:5CAGACCCTGAGGCTCAAAGTCAGA3，每次實(shí)驗(yàn)均設(shè)陽性和陰性對

17、照，只有陽性對照為陽性，陰性對照為陰性時(shí)結(jié)果才視為可靠。    bcr/abl融合基因的DFISH法檢測1    bcr/abl融合基因探針  LSI BCRABL DFISH探針由美國Vysis公司提供。    FISH檢測  取出保存于 -20的染色體標(biāo)本,換上新鮮固定液(甲醇冰醋酸=31)滴片, 室溫氣干后放入37預(yù)溫的2×SSC中30分鐘，分別在70%、85%、100%的乙醇(體積比)中室溫梯度脫水,每梯度2分鐘, 晾干。 在73變性液(70%的甲酰胺/2×

18、SSC)中變性5分鐘, 70%、85%、100%冰乙醇(-20)系列脫水, 每梯度2分鐘, 晾干備用。將1 l混合探針與9 l雜交稀釋液（hybridization buffer，購自Vysis公司)混合,在73水浴中變性5分鐘, 然后加在染色體標(biāo)本上,蓋片封膠, 放入預(yù)熱的濕盒中, 37雜交過夜。雜交后標(biāo)本在73 0.4×SSC/0.3% Triton100中洗滌2分鐘,再用2×SSC/0.1% Triyon100室溫洗滌1分鐘, 避光晾干后加10 l二氨基酚吲哚(DAPI)復(fù)染標(biāo)本, 20分鐘后熒光顯微鏡檢測。    熒光顯微鏡檢查

19、0; 在NikonE600熒光顯微鏡下通過三色濾光塊(DAPI/TRITC/FITC)觀察雜交信號(hào),每例至少分析200個(gè)間期細(xì)胞,不計(jì)數(shù)重疊細(xì)胞，計(jì)算陽性細(xì)胞的百分比率。FISH結(jié)果判斷標(biāo)準(zhǔn):紅色(red, R)信號(hào)為abl,綠色(green, G)信號(hào)為bcr,將R信號(hào)與G信號(hào)重疊或接觸定義為融合信號(hào)(fusion, F), 融合信號(hào)在熒光顯微鏡下呈黃色，為bcr/abl或abl/bcr融合基因。具有典型t(9;22)易位的細(xì)胞顯示2個(gè)黃色的融合信號(hào)和1個(gè)紅色及1個(gè)綠色信號(hào)(2F1R1G),而正常細(xì)胞則顯示2個(gè)分離的紅色信號(hào)和2個(gè)分離的綠色信號(hào)(2R2G)。   

20、; 結(jié)    果    正常分界值的確定    正常分界值的取值為正常對照組中所觀察到的陽性細(xì)胞數(shù)平均值+3個(gè)標(biāo)準(zhǔn)差(分界值=X+3SD)1-3,陽性細(xì)胞率大于分界值的標(biāo)本我們將其定義為異常。本研究陰性對照組DFISH檢測到陽性細(xì)胞率為0%-0.5%,平均值0.17%,標(biāo)準(zhǔn)差0.24%,分界值為0.17%+3×0.24%=0.89%。K562細(xì)胞用DFISH重復(fù)2次檢測,陽性率為100%。    移植前后CC、RTPCR及FISH檢測結(jié)果  &#

21、160; 討    論    95%以上的CML具有(9;22)(34;11)易位, 易位形成的Ph染色體及相應(yīng)的bcr/abl融合基因是CML發(fā)病的基礎(chǔ)。因此Ph染色體和bcr/abl融合基因是CML診斷、療效觀測和微小殘留病監(jiān)測的有效指標(biāo)。在評價(jià)CML對各種治療如INF、骨髓移植等的反應(yīng)程度時(shí)，從定量角度準(zhǔn)確判斷患者骨髓細(xì)胞中的腫瘤負(fù)荷有重要的臨床意義。研究表明4,病人骨髓或造血干細(xì)胞移植后殘留腫瘤負(fù)荷的水平提示了疾病復(fù)發(fā)的可能性大小。目前進(jìn)行定量研究常用的檢測手段有CC、FISH和實(shí)時(shí)定量PCR等5-7。我們應(yīng)用這3種技術(shù)對7例

22、非清髓性異基因干細(xì)胞移植治療中CML患者的腫瘤負(fù)荷水平進(jìn)行了檢測。    對7例CML患者非清髓性異基因干細(xì)胞移植治療前后的 40 份骨髓標(biāo)本檢測發(fā)現(xiàn)， 移植后早期(3個(gè)月)由于細(xì)胞數(shù)少，CC分析往往不敏感，甚至失敗。對病例5移植后20、60天、病例7移植后40天的3份因細(xì)胞數(shù)少CC核型分析失敗的標(biāo)本行FISH檢測，bcr/abl(+)細(xì)胞檢出率分別為55.0%、27.5%和73.5%，可見在移植后早期用FISH可以準(zhǔn)確檢測體內(nèi)腫瘤負(fù)荷水平，從而判定是否成功植入。移植后3個(gè)月至CC檢測Ph染色體轉(zhuǎn)陰前階段，可以用CC對體內(nèi)腫瘤負(fù)荷進(jìn)行動(dòng)態(tài)監(jiān)測。當(dāng)應(yīng)用CC檢測Ph(

23、-)而用RTPCR檢測bcr/abl(+)時(shí)，應(yīng)該用FISH監(jiān)測體內(nèi)腫瘤負(fù)荷的動(dòng)態(tài)變化。我們對病例1移植后9、10個(gè)月、病例2移植后15個(gè)月、病例3移植后12個(gè)月的4份Ph(-)bcr/abl(+)標(biāo)本進(jìn)一步行FISH檢測，分別檢出5.4%、0%、16.5%及1.5%的bcr/abl(+)細(xì)胞，說明CC檢測Ph轉(zhuǎn)陰后，體內(nèi)仍可能有一定數(shù)量的微小殘留病存在。病例1移植后10個(gè)月Ph(-)bcr/abl(+)標(biāo)本及移植后12個(gè)月Ph(-)bcr/abl(-)的標(biāo)本行FISH檢測，bcr/abl(+)細(xì)胞檢出率均為0%，提示FISH檢測bcr/abl轉(zhuǎn)陰的病人需靠靈敏度更高的RTPCR監(jiān)測，一旦RT

24、PCR結(jié)果呈陽性，即需配合FISH監(jiān)測，以便及早發(fā)現(xiàn)病情變化，實(shí)施干預(yù)措施。    我們的研究還發(fā)現(xiàn)，非清髓性異基因干細(xì)胞移植后病人體內(nèi)Ph（+）細(xì)胞殘留時(shí)間較長，但這并不意味著移植失敗。大多數(shù)病人隨者時(shí)間延長及輔以供體淋巴細(xì)胞輸注(DLI)，Ph（+）細(xì)胞會(huì)逐漸減少并最終消失。其原因可能是嵌合的供者T淋巴細(xì)胞通過識(shí)別宿主殘留細(xì)胞的次要組織相容性抗原（mMHC）或殘留的抗原呈遞細(xì)胞（DC）提呈遞的白血病相關(guān)抗原，活化并產(chǎn)生移植物抗白血病反應(yīng)(graft versus leukemia,GVL)，從而清除宿主體內(nèi)的腫瘤細(xì)胞或遺傳學(xué)異常的造血干細(xì)胞。T 細(xì)胞、NK細(xì)胞

25、協(xié)同參與了GVL效應(yīng)，CD4+ T細(xì)胞在GVL效應(yīng)中起主要作用，CD8+ Tc2亞群細(xì)胞可介導(dǎo)GVL效應(yīng)并在降低移植物抗宿主病（GVHD）發(fā)生率的同時(shí)防止移植物被排斥。這與非清髓性預(yù)處理干細(xì)胞移植后實(shí)施供者淋巴細(xì)胞輸注后產(chǎn)生的效應(yīng)一致8-10。    移植后病人體內(nèi)殘留的Ph（+）細(xì)胞比率下降不明顯、停滯甚至有增高趨勢時(shí)，應(yīng)實(shí)施臨床干預(yù)。病例6移植后8個(gè)月仍殘留70%的Ph（+）細(xì)胞，多次給予DLI, Ph（+）細(xì)胞比率反復(fù)升降，效果不好，后又輔以干擾素治療，效果仍然不好。目前病人仍處于血液學(xué)緩解期，正在考慮二次移植。    另外，移

26、植成功也并不意味著病人就一定能夠長期生存。病例2移植后Ph（+）細(xì)胞漸降，并于移植后15個(gè)月CC檢測Ph轉(zhuǎn)陰，但病人一般狀況卻一直不是很好，有嚴(yán)重的慢性移植物抗宿主?。╟GVHD）表現(xiàn),最終于移植后22個(gè)月因骨轉(zhuǎn)移而死亡。由于病人一直處于血液學(xué)緩解期，骨髓檢查并無復(fù)發(fā)傾向，所以我們考慮其骨轉(zhuǎn)移可能早在移植前就已發(fā)生，提示移植要把握好時(shí)機(jī)，及早進(jìn)行。病例5為一老年患者，年齡56歲，移植前已進(jìn)入加速期，但移植非常成功，移植后5個(gè)月Ph（+）細(xì)胞就降至20%，術(shù)后發(fā)生cGVHD，于術(shù)后1年死于間質(zhì)性肺炎。因此，如何防治cGVHD成為移植成功的關(guān)鍵之一。    綜上所述，

27、CC、RTPCR和FISH 3種方法在檢測CML病人對治療的反應(yīng)時(shí)各有其特點(diǎn)：CC可作為監(jiān)測CML患者治療過程中腫瘤負(fù)荷水平的基本手段；在移植后早期細(xì)胞數(shù)少時(shí)，CC檢測結(jié)果無法準(zhǔn)確判斷體內(nèi)腫瘤負(fù)荷動(dòng)態(tài)變化時(shí)，以及治療病人體內(nèi)腫瘤負(fù)荷降低到CC不能檢出而RTPCR仍為陽性時(shí)，需借助FISH來準(zhǔn)確檢測體內(nèi)腫瘤負(fù)荷，監(jiān)測其動(dòng)態(tài)變化；FISH檢測bcr/abl轉(zhuǎn)陰的病人需靠靈敏度更高的RTPCR監(jiān)測。根據(jù)病人所處的時(shí)期及體內(nèi)的腫瘤負(fù)荷量選擇適當(dāng)?shù)姆椒?，可以在不增加病人?jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)的前提下，對病人體內(nèi)腫瘤負(fù)荷實(shí)行動(dòng)態(tài)監(jiān)測，為實(shí)施臨床干預(yù)提供可靠的依據(jù)。    【參考文

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