DNA的復(fù)制、損傷與修復(fù)

1、DNA的復(fù)制、損傷與修復(fù)第一節(jié) DNA的復(fù)制(Replication, DNA biosynthesis)指DNA雙鏈在細(xì)胞分裂以前進(jìn)行的復(fù)制過(guò)程。哺乳動(dòng)物的細(xì)胞周期哺乳動(dòng)物的細(xì)胞周期（一）半保留復(fù)制（一）半保留復(fù)制 DNA在復(fù)制時(shí)，以親代DNA的每一股作模板，合成完全相同的兩個(gè)雙鏈子代DNA，每個(gè)子代DNA中都含有一股親代DNA鏈，這種現(xiàn)象稱為DNA的半保留復(fù)制(semi-conservative replication)。意義：半保留復(fù)制說(shuō)明意義：半保留復(fù)制說(shuō)明DNADNA在代謝上的穩(wěn)定性。經(jīng)過(guò)許多代的復(fù)制，在代謝上的穩(wěn)定性。經(jīng)過(guò)許多代的復(fù)制，DNADNA鏈仍可鏈仍可保持完整，這在生物的遺

2、傳上是十分重要的保持完整，這在生物的遺傳上是十分重要的。一、一、DNA 復(fù)制特征復(fù)制特征DNA以半保留方式進(jìn)行復(fù)制，是在1958年由M. Meselson 和 F. Stahl 所完成的實(shí)驗(yàn)所證明。該實(shí)驗(yàn)首先將大腸桿菌在含15N的培養(yǎng)基中培養(yǎng)約十五代，使其DNA中的堿基氮均轉(zhuǎn)變?yōu)?5N。將大腸桿菌移至只含14N的培養(yǎng)基中同步培養(yǎng)一代、二代、三代。分別提取DNA，作CsClCsCl密度梯度離心.半保留復(fù)制證據(jù)半保留復(fù)制證據(jù)（以原核生物（以原核生物 大腸桿菌為例）大腸桿菌為例） 原料：原料： dNTP，Mg+ 雙鏈雙鏈DNA模板模板 引物（引物（primer），常是），常是RNA，有游離的，有游離

3、的 3OH。 引物酶（引物酶（primase，DnaG），用于合成復(fù)制所），用于合成復(fù)制所必需的必需的RNA引物引物 解螺旋酶解螺旋酶 ( helicase ) , DnaB, 由由DnaA和和DnaC協(xié)助在復(fù)制的起始點(diǎn)（協(xié)助在復(fù)制的起始點(diǎn)（Ori C）上解開(kāi)雙螺旋。）上解開(kāi)雙螺旋。與復(fù)制有關(guān)的酶和因子與復(fù)制有關(guān)的酶和因子復(fù)制的起始點(diǎn)與方向復(fù)制的起始點(diǎn)與方向 親代DNA開(kāi)鏈，復(fù)制起始點(diǎn)呈叉型移動(dòng)復(fù)制叉復(fù)制叉親代親代DNA DNA 分子分子3535復(fù)制起始點(diǎn)（復(fù)制起始點(diǎn)（oriori）：DNA復(fù)制要從DNA分子的特定部位開(kāi)始，此部位稱復(fù)制起始點(diǎn)復(fù)制起始點(diǎn) 原核：一個(gè)起始點(diǎn)，約245bp,特殊的重

4、復(fù)序列 真核：多個(gè)起始點(diǎn)oriori復(fù)制起始點(diǎn)復(fù)制起始點(diǎn)oriCoriC跨度為跨度為245bp245bp，包括包括兩個(gè)關(guān)鍵序列兩個(gè)關(guān)鍵序列：13bp13bp的序列和的序列和9bp9bp序列序列, ,它是決定和控制染色體復(fù)制的唯一片它是決定和控制染色體復(fù)制的唯一片段。段。 13bp13bp序列區(qū)，每一個(gè)順序都由序列區(qū)，每一個(gè)順序都由GATCGATC開(kāi)始，富含開(kāi)始，富含A A和和T T，有助于螺旋解，有助于螺旋解開(kāi)，控制復(fù)制何時(shí)開(kāi)始。開(kāi)，控制復(fù)制何時(shí)開(kāi)始。 9bp 9bp重復(fù)序列，重復(fù)出現(xiàn)重復(fù)序列，重復(fù)出現(xiàn)4 4次，能與起始蛋次，能與起始蛋白白dnaAdnaA特異結(jié)合，當(dāng)特異結(jié)合，當(dāng)dnaAdna

5、A蛋白（約蛋白（約2020種）結(jié)合種）結(jié)合于于oriori的的4 4個(gè)部位上時(shí)復(fù)制開(kāi)始。個(gè)部位上時(shí)復(fù)制開(kāi)始。 dnaAdnaA蛋白（一種專一的蛋白）和蛋白（一種專一的蛋白）和oriori結(jié)合結(jié)合后，雙螺旋解開(kāi)形成復(fù)制叉。故后，雙螺旋解開(kāi)形成復(fù)制叉。故dnaAdnaA蛋白與啟蛋白與啟動(dòng)解鏈有關(guān)動(dòng)解鏈有關(guān),dnaA,dnaA蛋白是起始的關(guān)鍵成分。蛋白是起始的關(guān)鍵成分。大腸桿菌大腸桿菌復(fù)制起點(diǎn)成串排列的重復(fù)序列復(fù)制起點(diǎn)成串排列的重復(fù)序列GATCTNTTNTTT成串排列的三個(gè)13bp序列共有序列共有序列TTATCCACA DnaA蛋白結(jié)合位點(diǎn)四個(gè)9bp序列DnaADnaB(解螺旋酶)SSB大腸桿菌DN

6、A復(fù)制起點(diǎn)在起始階段的結(jié)構(gòu)模型基因組能獨(dú)立進(jìn)行復(fù)制的功能單位稱為復(fù)制子基因組能獨(dú)立進(jìn)行復(fù)制的功能單位稱為復(fù)制子(replicon)(replicon)，每個(gè)復(fù)制子都含有控制復(fù)制起始的起點(diǎn)，每個(gè)復(fù)制子都含有控制復(fù)制起始的起點(diǎn)(origin)(origin)，可能還有終止復(fù)制的終點(diǎn)，可能還有終止復(fù)制的終點(diǎn)(terminus)(terminus)。每個(gè)。每個(gè)起起始點(diǎn)產(chǎn)生兩個(gè)移動(dòng)方向相反的復(fù)制叉，復(fù)制完成時(shí)，復(fù)始點(diǎn)產(chǎn)生兩個(gè)移動(dòng)方向相反的復(fù)制叉，復(fù)制完成時(shí)，復(fù)制叉相遇并匯合連接。習(xí)慣上把兩個(gè)相鄰起始點(diǎn)之間的制叉相遇并匯合連接。習(xí)慣上把兩個(gè)相鄰起始點(diǎn)之間的距離定為一個(gè)復(fù)制子。距離定為一個(gè)復(fù)制子。（二）復(fù)制

7、子（二）復(fù)制子 一個(gè)復(fù)制子只含有一個(gè)專一的復(fù)制起點(diǎn)和復(fù)制結(jié)束的終點(diǎn)。一個(gè)完整的復(fù)制子在一個(gè)細(xì)胞周期只復(fù)制一次(真核)。 原核生物染色體和質(zhì)粒都是獨(dú)立（只有單一個(gè)）復(fù)制子；真核細(xì)胞染色體中有多個(gè)復(fù)制子組成。 DNADNA復(fù)制時(shí)，以復(fù)制起始點(diǎn)為中心，向兩個(gè)方向進(jìn)復(fù)制時(shí)，以復(fù)制起始點(diǎn)為中心，向兩個(gè)方向進(jìn)行復(fù)制行復(fù)制. . 但在低等生物中但在低等生物中, ,也可進(jìn)行單向復(fù)制（如滾環(huán)復(fù)也可進(jìn)行單向復(fù)制（如滾環(huán)復(fù)制）制）. . 原核細(xì)胞：染色體和質(zhì)粒原核細(xì)胞：染色體和質(zhì)粒 固定起固定起點(diǎn)點(diǎn) 雙向復(fù)制，雙向復(fù)制，. . 真核生物：染色體真核生物：染色體DNADNA，復(fù)制時(shí)多個(gè)起始，復(fù)制時(shí)多個(gè)起始點(diǎn)。點(diǎn)。（三

8、）復(fù)制方向（三）復(fù)制方向復(fù)制方向復(fù)制方向 DNA合成的方向單向、雙向？ 1個(gè)起始點(diǎn)復(fù)制中的大腸桿菌染色體放射自顯影圖復(fù)制中的大腸桿菌染色體放射自顯影圖(Caims實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)) 將3H-胸苷標(biāo)記大腸桿菌DNA，經(jīng)過(guò)近兩代的時(shí)間，3H-胸苷摻入大腸桿菌DNA 。用溶菌酶把細(xì)胞壁消化掉，使完整的大腸桿菌染色體DNA釋放出來(lái)，放射自顯影，得到上圖。非復(fù)制部分（C）銀粒子密度較低，由一股放射性鏈和一股非放射性鏈構(gòu)成。已復(fù)制部分站整個(gè)染色體的三分之二，其中一條雙鏈（ B ）僅有一股鏈?zhǔn)菢?biāo)記的，另外一股雙鏈（ A ）的兩股鏈都是標(biāo)記的，銀粒子密度為前二者的兩倍。染色體全長(zhǎng)約為1100微米。環(huán)狀DNA的復(fù)制AB

9、CABC雙向復(fù)制雙向復(fù)制oriori復(fù)制子復(fù)制子oriori 真核生物兩個(gè)相真核生物兩個(gè)相鄰復(fù)制起始點(diǎn)之間鄰復(fù)制起始點(diǎn)之間的的DNA片段片段 以起始點(diǎn)為中以起始點(diǎn)為中心，向兩個(gè)方心，向兩個(gè)方向進(jìn)行復(fù)制向進(jìn)行復(fù)制 多個(gè)起始點(diǎn)二、二、 DNADNA復(fù)制的酶學(xué)復(fù)制的酶學(xué)1. 1. 模板：解開(kāi)成單鏈的模板：解開(kāi)成單鏈的DNADNA母鏈母鏈3. DNA3. DNA聚合酶，聚合酶，DNA-polDNA-pol2. 2. 底物底物dNTP dNTP ：dATPdATP，dGTPdGTP，dCTPdCTP，dTTP dTTP 4. 4. 引物（引物（primerprimer）：）：RNARNA引物引物5. 5

10、. 其他酶和蛋白質(zhì)因子其他酶和蛋白質(zhì)因子解鏈相關(guān)酶類解鏈相關(guān)酶類1. 1. 解旋酶解旋酶(helicase)(helicase)2. 2. 拓?fù)洚悩?gòu)酶（拓?fù)洚悩?gòu)酶（topoisomerase Itopoisomerase I、IIII） 3. 3. 單鏈單鏈DNADNA結(jié)合蛋白結(jié)合蛋白(SSB)(SSB) DNA解旋酶(helicase)（解鏈酶） 功能：DNA的雙螺旋解鏈（解DNA雙鏈），解開(kāi)一對(duì)堿基，需2分子ATP， 作用點(diǎn)：DNA上局部單鏈處，向雙鏈方向解鏈。 種類：有四種解螺旋酶，I、II、III和rep蛋白。 I、II、III中任一種沿模板5-3 方向移動(dòng)，rep蛋白沿模板3 -5方

11、向移動(dòng)。5353rep拓?fù)洚悩?gòu)酶（拓?fù)洚悩?gòu)酶（TopoTopo）DNADNA正超螺旋與負(fù)超螺旋正超螺旋與負(fù)超螺旋負(fù)超螺旋負(fù)超螺旋正超螺旋正超螺旋DNADNA雙螺旋雙螺旋拓?fù)洚悩?gòu)酶拓?fù)洚悩?gòu)酶 首先在大腸桿菌中被發(fā)現(xiàn)，它可使首先在大腸桿菌中被發(fā)現(xiàn)，它可使DNA的一的一條鏈發(fā)生斷裂和再連接，反應(yīng)無(wú)需供給能量。條鏈發(fā)生斷裂和再連接，反應(yīng)無(wú)需供給能量。 另外，另外，DNA復(fù)制時(shí)負(fù)超螺旋的消除，亦由拓復(fù)制時(shí)負(fù)超螺旋的消除，亦由拓?fù)洚悩?gòu)酶撲異構(gòu)酶來(lái)完成，但它對(duì)正超螺旋無(wú)作用。來(lái)完成，但它對(duì)正超螺旋無(wú)作用。型拓?fù)洚悩?gòu)酶 由兩個(gè)由兩個(gè)A亞基和兩個(gè)亞基和兩個(gè)B亞基組成，即亞基組成，即A2B2。它能使它能使DNA的

12、兩條鏈同時(shí)發(fā)生斷裂和再連接，的兩條鏈同時(shí)發(fā)生斷裂和再連接，當(dāng)它引入負(fù)超螺旋以消除復(fù)制叉前進(jìn)帶來(lái)的扭當(dāng)它引入負(fù)超螺旋以消除復(fù)制叉前進(jìn)帶來(lái)的扭曲張力時(shí)，需要由曲張力時(shí)，需要由ATP提供能量。提供能量。 兩種拓?fù)洚悩?gòu)酶在兩種拓?fù)洚悩?gòu)酶在DNA復(fù)制、轉(zhuǎn)錄和重組中復(fù)制、轉(zhuǎn)錄和重組中均發(fā)揮重要作用均發(fā)揮重要作用。型拓?fù)洚悩?gòu)酶 拓?fù)洚悩?gòu)酶 I 抑制劑：喜樹(shù)堿類 拓?fù)洚悩?gòu)酶 II 抑制劑：依托泊苷，多柔比星，阿霉素類等單鏈單鏈DNADNA結(jié)合蛋白（結(jié)合蛋白（SSBSSB）作用：防止單鏈作用：防止單鏈DNADNA重重新形成雙鏈，防止單新形成雙鏈，防止單鏈鏈DNADNA被核酸酶水解被核酸酶水解DNADNA聚合酶（

13、聚合酶（DNA-polDNA-pol） 即依賴于即依賴于DNADNA的的DNADNA聚合酶（聚合酶（DDDPDDDP） 真核生物有多種：真核生物有多種： DNA-polDNA-pol 、 、 、 、 原核生物有原核生物有3 3種：種： DNA-polDNA-pol、 、 DNA聚合酶功能 5 5 3 3 聚合作用聚合作用 5 5 3 3 外切酶外切酶 3 3 5 5 外切酶活性大腸桿菌三種大腸桿菌三種DNADNA聚合酶比較聚合酶比較DNADNA聚合酶聚合酶分子量分子量每個(gè)細(xì)胞的分子統(tǒng)計(jì)數(shù)每個(gè)細(xì)胞的分子統(tǒng)計(jì)數(shù)5 5 -3 -3 聚合酶作用聚合酶作用3 3 -5 -5 核酸外切酶作用核酸外切酶作用

14、5 5 -3 -3 核酸外切酶作用核酸外切酶作用轉(zhuǎn)化率轉(zhuǎn)化率主要功能主要功能活性（活性（nt/minnt/min） DNADNA聚合酶聚合酶DNADNA聚合酶聚合酶（復(fù)合物）（復(fù)合物）109109，000000400400+ + + +1 1校讀校讀, ,修復(fù)修復(fù)10001000120120，0000004040+ + +- -0 .050 .05400400，00000010-2010-20+ + + +5050復(fù)制復(fù)制100000100000特特 性性不清不清填補(bǔ)缺口填補(bǔ)缺口5050引物酶引物酶( (PrimasePrimase) )和引發(fā)體和引發(fā)體 5 5 5 5 催化催化RNARNA引

15、物合成的酶叫引物酶，它是一種特引物合成的酶叫引物酶，它是一種特殊的殊的RNARNA聚合酶聚合酶 DNADNA合成需在合成需在RNARNA引物的基礎(chǔ)上進(jìn)行引物的基礎(chǔ)上進(jìn)行RNARNA引物引物5 5 3 3 5 5 3 3 DnaADnaA引發(fā)體（引發(fā)體（primosomeprimosome）：包括解螺旋酶）：包括解螺旋酶 、DnaCDnaC、引物酶及、引物酶及DNADNA復(fù)制的起始區(qū)域復(fù)制的起始區(qū)域 5 5 3 3 3 3 5 5 引物酶引物酶DnaCDnaC引發(fā)體引發(fā)體解螺旋酶解螺旋酶 小小 結(jié)結(jié)主要成員主要成員 主要作用主要作用DnaA DnaA 識(shí)別復(fù)制起始位點(diǎn)識(shí)別復(fù)制起始位點(diǎn)解螺旋酶解螺

16、旋酶 解開(kāi)解開(kāi)DNADNA雙鏈雙鏈SSB SSB 維持已解開(kāi)單鏈維持已解開(kāi)單鏈DNADNA的穩(wěn)定的穩(wěn)定引物酶引物酶 合成合成RNARNA引物引物 TOPO TOPO 使打結(jié)、纏繞、正超螺旋的使打結(jié)、纏繞、正超螺旋的DNADNA松馳松馳DNA-pol DNADNA-pol DNA復(fù)制復(fù)制DNA-pol DNA-pol 水解引物、填補(bǔ)空隙、修復(fù)作用水解引物、填補(bǔ)空隙、修復(fù)作用DNADNA連接酶連接酶 催化雙鏈催化雙鏈DNADNA中單鏈缺口的連接中單鏈缺口的連接三、復(fù)制的化學(xué)反應(yīng)三、復(fù)制的化學(xué)反應(yīng)生成磷酸二酯鍵生成磷酸二酯鍵N N1 1OHOH3 3 5 5 + dN+ dN2 2TPTPN N1

17、1N N2 2-OH-OH3 3 5 5 +PPi+PPiDNA polDNA pol3 3TAGAAGACCTATTGGCCTAGAAGACCTATTGGCC5 55 5ATCTTCTGGATAACCGGATCTTCTGGATAACCGG3 3第三節(jié) DNA生物合成過(guò)程1.復(fù)制的起始2.鏈的延長(zhǎng)3.復(fù)制的終止一 復(fù)制的起始( (一一) DNA) DNA解成單鏈解成單鏈 由特定蛋白質(zhì)識(shí)別復(fù)制起始位點(diǎn)（由特定蛋白質(zhì)識(shí)別復(fù)制起始位點(diǎn)（oriori），），在解螺旋酶、在解螺旋酶、TOPOTOPO酶及單鏈酶及單鏈DNADNA結(jié)合蛋白的共結(jié)合蛋白的共同作用下，同作用下，DNADNA解鏈，解旋，形成復(fù)制叉解鏈，解旋，形成復(fù)制叉 倒倒Y Y( (二二) )引發(fā)體的生成引發(fā)體的生成 解旋酶解開(kāi)雙鏈后引物酶進(jìn)入形成解旋酶解開(kāi)雙鏈后引物酶進(jìn)入形成引發(fā)體引發(fā)體5 5 3 3 3 3 5 5 引物酶引物酶DnaCDnaC引發(fā)體引發(fā)體解旋酶解旋酶（三）（三） RN