植物細胞培養(yǎng)及次級代謝產(chǎn)物制備

1、植物細胞培養(yǎng)及次級代謝產(chǎn)物制備第五章 植物細胞培養(yǎng)l根據(jù)培養(yǎng)規(guī)模:小規(guī)模培養(yǎng)和大批量培養(yǎng)；l根據(jù)培養(yǎng)方式:懸浮培養(yǎng)、單細胞培養(yǎng)等；l根據(jù)要求產(chǎn)物:用于誘變的細胞培養(yǎng)和生產(chǎn)次生產(chǎn)物的細胞培養(yǎng)。植物細胞培養(yǎng)（plant cell culture）是指在離體條件下對植物單個細胞或小的細胞團進行培養(yǎng)使其增殖獲得細胞或細胞產(chǎn)物的技術(shù)。l植物細胞直徑一般約為10-200m，平均直徑比微生物細胞大30-100倍。l植物細胞通常以一定細胞數(shù)目的非均相細胞團方式存在于培養(yǎng)液中。l植物細胞具有纖維素細胞壁和大的液泡，很容易被剪切力損傷。l與微生物細胞相比，植物細胞生長速度慢，操作周期長，分批培養(yǎng)一般需要2-3周。

2、l植物細胞培養(yǎng)基成分豐富而復(fù)雜，適合微生物生長，因此防止污染更困難。l植物細胞培養(yǎng)一般需要光照，通過光合作用合成有機物，因此氧氣和CO2的含量與傳遞對細胞培養(yǎng)影響較大。l細菌，真菌、植物細胞都有細胞壁胞。l細菌無成形的細胞核，真菌、植物細胞有成形的細胞核。l細菌只有核糖體一種細胞器。l植物細胞比微生物細胞大。l生命活動與細胞分裂第二節(jié) 植物細胞培養(yǎng)技術(shù)1、植物細胞培養(yǎng)基 無機鹽（大量、微量） 碳源（蔗糖） 有機氮源（水解酪蛋白） 有機酸、維生素 植物生長激素等（1）單細胞分離1、酶解法 選擇專一性水解酶在溫和的條件下將植物細胞壁物質(zhì)（纖維素 果膠 多糖）降解植物細胞壁物質(zhì)，從而使細胞彼此分開，

3、這種方法稱為酶解法。經(jīng)常采用的生物酶包括：纖維素酶、果膠酶、瓊脂酶等生物酶。/機械法外植體搗碎，然后過濾和離心。2、由植物培養(yǎng)組織（愈傷組織）中分離單細胞植物單細胞分離與小規(guī)模培養(yǎng) 酶解法Takebe等（1968）最早報道：用果膠酶處理可以分離大量的葉肉細胞加果膠酶過濾、離心由愈傷組織誘導(dǎo)分離單細胞莖段步驟： 誘導(dǎo)產(chǎn)生愈傷組織； 愈傷組織反復(fù)繼代，使組織不斷增殖，提高愈傷組織的松散性；搖床用于振蕩繼代懸?。⊿uspension culture)將愈傷組織在液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，建立懸浮培養(yǎng)物120rpm culturetransfer 1time/3d 3 weeks100-130目網(wǎng)過濾Cent

4、rifuge(離心） isolation（2）植物單細胞小規(guī)模培養(yǎng)l看護培養(yǎng)l飼養(yǎng)層培養(yǎng)技術(shù)l細胞平板培養(yǎng)l微室培養(yǎng)培養(yǎng)基飼養(yǎng)層細胞看護濾紙層轉(zhuǎn)移碟濾紙培養(yǎng)細胞細胞平板培養(yǎng)法細胞同步化是指同一懸浮培養(yǎng)體系的所有細細胞同步化是指同一懸浮培養(yǎng)體系的所有細細胞的同步化培養(yǎng)體積選擇法：用大、小孔徑篩網(wǎng)過濾、收集單細胞。冷/低溫處理法：4低溫下處理幾天使細胞同步化后，再添加新的培養(yǎng)液培養(yǎng)。饑餓法：控制營養(yǎng)液濃度，通過饑餓使細胞達到同步化，再添加營養(yǎng)液培養(yǎng)。抑制法：使用抑制劑如尿苷、5-氟脫氧尿苷、秋水仙素等使細胞達到同步化。l無論何種細胞同步化處理，對細胞本身或多或少都有一定的傷害。l如果處理的細胞沒有

5、足夠的生活力，不僅不能獲得理想的同步化效果，還可能造成細胞的大量死亡，因此在進行同步化處理之前，細胞必須進行充分的活化培養(yǎng)。l用于處理的細胞系最好處于對數(shù)生長期。l細胞系和細胞株概念細胞系和細胞株概念l原代培養(yǎng)物經(jīng)首次傳代成功即稱為細胞系原代培養(yǎng)物經(jīng)首次傳代成功即稱為細胞系（Cell LineCell Line），因此細胞系可泛指一般可以），因此細胞系可泛指一般可以傳代的細胞。是以一種細胞為主的、能在體外傳代的細胞。是以一種細胞為主的、能在體外長期生存的不均一的細胞群體。長期生存的不均一的細胞群體。l通過選擇法或克隆形成法從原代培養(yǎng)物或細胞通過選擇法或克隆形成法從原代培養(yǎng)物或細胞系中獲得具有特

6、殊性質(zhì)或標志物的培養(yǎng)細胞稱系中獲得具有特殊性質(zhì)或標志物的培養(yǎng)細胞稱為細胞株（為細胞株（Cell StrainCell Strain），也就是說，細胞），也就是說，細胞株是用細胞系單細胞分離培養(yǎng)或通過篩選的方株是用細胞系單細胞分離培養(yǎng)或通過篩選的方法，由單細胞增殖形成的細胞群。細胞株的特法，由單細胞增殖形成的細胞群。細胞株的特殊性質(zhì)或標志必須在整個培養(yǎng)期間始終存在。殊性質(zhì)或標志必須在整個培養(yǎng)期間始終存在。細胞株篩選1、適合于工業(yè)化生產(chǎn)的細胞株必須滿足以下條件：（1）分散性好，適合大規(guī)模懸浮培養(yǎng)。（2）均一性好，細胞大小、生理狀態(tài)一致。（3）生長速度快 培養(yǎng)周期短 不易染菌。（4）目標產(chǎn)物含量高，

7、容易分離提取。（5）細胞遺傳穩(wěn)定。2、適合工業(yè)生產(chǎn)用細胞株的一般篩選流程：（自學(xué)）3、細胞株定向富集馴化4、人工誘變篩選 5 5、細胞株保存、細胞株保存繼代培養(yǎng)保存法 懸浮培養(yǎng)的細胞通過每隔12周換液進行一次繼代培養(yǎng)。這種方法適合于短期保種。低溫保存法 一般選擇5-10的溫度下培養(yǎng)，每隔十天左右更換一次培養(yǎng)液。冷凍保存 包括低溫保存（-20）、超低溫保存（液氮-196 ）。 (1)(1)細胞懸浮培養(yǎng)的概念和意義細胞懸浮培養(yǎng)的概念和意義u懸浮培養(yǎng)是將單個游離細胞或小細胞團懸浮在懸浮培養(yǎng)是將單個游離細胞或小細胞團懸浮在液體培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)增殖的技術(shù)。液體培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)增殖的技術(shù)。意義/優(yōu)點u細胞

8、可以不斷增殖，形成高密度的細胞群體，適于大規(guī)模培養(yǎng)；u能夠提供大量較為均勻的細胞，為研究細胞的生長、分化創(chuàng)造方法和條件。Cell suspensionPlantsArtificial seedsSecondary productsIsolation protoplastsMutation select細胞懸浮培養(yǎng)的應(yīng)用細胞懸浮培養(yǎng)起始培養(yǎng)物的建立l選擇適宜的外植體：幼胚、胚軸、子葉是最常使用的外植體。l 選擇適宜的培養(yǎng)基：較高濃度激素；必要的附加物質(zhì)。l 愈傷組織的要求：松散性好、增殖快、再生能力強。懸浮細胞的生長與增殖懸浮培養(yǎng)與固體培養(yǎng)比較有三個優(yōu)點：一是增加培養(yǎng)細胞與培養(yǎng)液的接觸面，改善營

9、養(yǎng)供應(yīng)；二是在振蕩條件下可避免細胞代謝產(chǎn)生的有害物質(zhì)在局部積累而對細胞自身產(chǎn)生毒害；三是振蕩培養(yǎng)可以適當改善氣體的交換。細胞生長各個時期的特點：細胞生長各個時期的特點：滯后期（延遲期）滯后期（延遲期）: : 細胞很少分裂，其長短與接種量、細胞很少分裂，其長短與接種量、大小和繼代時原種細胞所處的生長期有關(guān)；大小和繼代時原種細胞所處的生長期有關(guān)； 成功的懸浮細胞培養(yǎng)體系必須滿足三個條件：成功的懸浮細胞培養(yǎng)體系必須滿足三個條件：l懸浮培養(yǎng)物分散性良好，細胞團較小，一般在懸浮培養(yǎng)物分散性良好，細胞團較小，一般在30305050個細胞，在實際培養(yǎng)中很少有完全由單細胞組成的植個細胞，在實際培養(yǎng)中很少有完全

10、由單細胞組成的植物細胞懸浮系。物細胞懸浮系。l均一性好，細胞形狀和細胞團大小大致相同。懸浮系均一性好，細胞形狀和細胞團大小大致相同。懸浮系外觀為大小均一的小顆粒，培養(yǎng)基清澈透亮，細胞色外觀為大小均一的小顆粒，培養(yǎng)基清澈透亮，細胞色澤呈鮮艷的乳白或淡黃色。澤呈鮮艷的乳白或淡黃色。l細胞生長迅速，懸浮細胞的生長量一般細胞生長迅速，懸浮細胞的生長量一般2 23 3天甚至更天甚至更短時間便可增加一倍。短時間便可增加一倍。 影響懸浮細胞生長的因素：影響懸浮細胞生長的因素：l 起始愈傷組織的質(zhì)量：松散性好、增殖快、再生能力起始愈傷組織的質(zhì)量：松散性好、增殖快、再生能力強。其外觀一般是色澤呈鮮艷的乳白或淡黃

11、色，呈細強。其外觀一般是色澤呈鮮艷的乳白或淡黃色，呈細小顆粒狀，疏松易碎。小顆粒狀，疏松易碎。l 接種細胞密度：接種初期的細胞密度過低往往使延遲接種細胞密度：接種初期的細胞密度過低往往使延遲期加長，懸浮細胞的起始密度一般在期加長，懸浮細胞的起始密度一般在2.52.510105 5個細個細胞胞/ /毫升，低于這一密度則會使細胞生長延遲。毫升，低于這一密度則會使細胞生長延遲。 l 培養(yǎng)條件：方式、溫度、繼代周期培養(yǎng)條件：方式、溫度、繼代周期植物細胞懸浮培養(yǎng)的生物反應(yīng)器自學(xué)生物反應(yīng)器是指用于高等生物細胞批量化培養(yǎng)的裝置及其相應(yīng)控制系統(tǒng)。機械攪拌式培養(yǎng)系統(tǒng)氣升式反應(yīng)器 鼓泡式反應(yīng)器l植物細胞大規(guī)模培養(yǎng)

12、，根據(jù)一個培養(yǎng)周期中是植物細胞大規(guī)模培養(yǎng)，根據(jù)一個培養(yǎng)周期中是否添加培養(yǎng)基，可分為成批培養(yǎng)、連續(xù)培養(yǎng)、否添加培養(yǎng)基，可分為成批培養(yǎng)、連續(xù)培養(yǎng)、半連續(xù)培養(yǎng)方式等。半連續(xù)培養(yǎng)方式等。l成批培養(yǎng)（成批培養(yǎng)（batch culturebatch culture）: :指在一個培養(yǎng)體指在一個培養(yǎng)體積中，接種細胞和添加培養(yǎng)基后，中途不添加積中，接種細胞和添加培養(yǎng)基后，中途不添加培養(yǎng)基也不更換培養(yǎng)基的方式。培養(yǎng)基也不更換培養(yǎng)基的方式。l連續(xù)培養(yǎng)（連續(xù)培養(yǎng)（continuous culturecontinuous culture）: :在培養(yǎng)過程中，不在培養(yǎng)過程中，不斷地向反應(yīng)器中添加培養(yǎng)基，同時以相同的流量

13、從系斷地向反應(yīng)器中添加培養(yǎng)基，同時以相同的流量從系統(tǒng)中取出培養(yǎng)液，從而維持培養(yǎng)系統(tǒng)的內(nèi)在細胞密度、統(tǒng)中取出培養(yǎng)液，從而維持培養(yǎng)系統(tǒng)的內(nèi)在細胞密度、產(chǎn)物濃度以及物理狀態(tài)相對平衡的培養(yǎng)方式。產(chǎn)物濃度以及物理狀態(tài)相對平衡的培養(yǎng)方式。l半連續(xù)培養(yǎng)（半連續(xù)培養(yǎng)（semi-continuous culturesemi-continuous culture）: :這是一種這是一種介于成批培養(yǎng)與連續(xù)培養(yǎng)之間的培養(yǎng)方式，其基本方介于成批培養(yǎng)與連續(xù)培養(yǎng)之間的培養(yǎng)方式，其基本方法是在完成上述成批培養(yǎng)的一個周期后，只從反應(yīng)器法是在完成上述成批培養(yǎng)的一個周期后，只從反應(yīng)器中取出大部分細胞懸液，保留小部分細胞懸液作為下中

14、取出大部分細胞懸液，保留小部分細胞懸液作為下一個培養(yǎng)周期的種子細胞，然后加入新鮮培養(yǎng)基進行一個培養(yǎng)周期的種子細胞，然后加入新鮮培養(yǎng)基進行培養(yǎng)。培養(yǎng)。 植物細胞固定化需要采用固定劑，是一些多糖和多聚類化合物，常用的包括海藻酸鹽、瓊脂糖、卡拉膠等。1、海藻酸鹽固定化在Ca2+離子等多價陽離子的存在下，海藻酸鹽的羧基和Ca2+之間以離子鍵形成不溶于水的海藻酸鈣，從而在細胞表面形成凝膠。如果采用磷酸、檸檬酸、EDTA等螯合劑處理將Ca2+離子除去，又能使膠體溶解釋放出細胞。無菌空氣入口玻璃瓶細胞和褐藻酸鈉混合液空氣出口形成膠體顆粒的噴射口隔濾板裝有CaCl2溶液的燒瓶 植物細胞固定化方法海藻酸鹽固定化

15、細胞步驟l常用方法：（1）滴入法：將細胞懸浮液與滅菌的含NaCl的卡拉膠溶液混勻，然后滴入含中KCl的培養(yǎng)基中，使其分散成小顆粒。過濾、清洗顆粒后轉(zhuǎn)入適當?shù)呐囵B(yǎng)基中進行培養(yǎng)。（2）模鑄法：將細胞-卡拉膠溶液注入柱形鑄模中形成顆粒。（3）兩相法：將細胞-卡拉膠溶液與無菌豆油或石蠟油攪拌混勻，形成液滴置于冰浴中不斷攪拌，凝固成均勻顆粒，再離心除去油相和大部分溶液。2、卡拉膠固定化l瓊脂糖(Agarose)固定化：（1）凝塊法：將細胞懸浮于滅菌的瓊脂糖中，攪拌待凝結(jié)包埋細胞后，將凝塊擠進無菌金屬網(wǎng)中，使其分散成小顆粒。清洗顆粒后轉(zhuǎn)入適當?shù)呐囵B(yǎng)基中進行培養(yǎng)。（2）模鑄法：同卡拉膠法（3）兩相法：同卡拉

16、膠法l優(yōu)點：與海藻酸鹽、卡拉膠等固定化方法相比，不需要其它離子來保證膠的穩(wěn)定性。l不足：制得的顆粒較大、形狀不規(guī)則。3、瓊脂糖(Agarose)固定化l固定化后需要測定細胞存活率大小，方法有：（1）熒光染色觀察法：根據(jù)活細胞對FDA（二乙酸熒光素）黃綠色熒光染料能被吸收，而死細胞無法吸收原理鑒定。（2）呼吸強度測定： 用氧電極法測定固定化細胞的呼吸強度判斷存活率。（3）細胞生長速率的測定： 通過測定細胞的濕重或干重增加率反映細胞活性大小。固定化細胞活力測定l概述概述l培養(yǎng)系統(tǒng)培養(yǎng)系統(tǒng)l植物細胞規(guī)模培養(yǎng)技術(shù)要點植物細胞規(guī)模培養(yǎng)技術(shù)要點l提高細胞次生代謝產(chǎn)物的途徑提高細胞次生代謝產(chǎn)物的途徑l細胞規(guī)

17、?；囵B(yǎng)中的有關(guān)技術(shù)問題細胞規(guī)?；囵B(yǎng)中的有關(guān)技術(shù)問題l長期以來，植物一直是許多化學(xué)品的主要資源，特別在制藥和食品加工業(yè)中更是不可缺少；l據(jù)不完全統(tǒng)計，至少有20%左右的藥物是由植物衍生而來，而且每年都有發(fā)現(xiàn)許多植物來源的新化合物。細胞代謝產(chǎn)物分為初級代謝產(chǎn)物、次級代謝產(chǎn)物。初級代謝產(chǎn)物（Primary metabolites） 是通過初級代謝產(chǎn)生的維持細胞生命活動必需的物質(zhì)，如氨基酸、核苷酸、多糖、脂類等。次級代謝產(chǎn)物（Secondary metabolites）是指植物中一大類并非植物生長發(fā)育所必需的小分子有機化合物，其產(chǎn)生和分布通常有種屬、器官組織和生長發(fā)育期的特異性。 大多是分子結(jié)構(gòu)比

18、較復(fù)雜的小分子化合物，例如抗生素、激素、生物堿、毒素等。植物次生代謝產(chǎn)物次生產(chǎn)物在植物中的合成與分解過程稱為次生代謝。l不同種類的生物所產(chǎn)生的次級代謝產(chǎn)物不同種類的生物所產(chǎn)生的次級代謝產(chǎn)物不相同，它們可能積累在細胞內(nèi)，也可不相同，它們可能積累在細胞內(nèi)，也可能排到外環(huán)境中。由于次級代謝產(chǎn)物大能排到外環(huán)境中。由于次級代謝產(chǎn)物大多具有生物活性，因此是植物代謝產(chǎn)物多具有生物活性，因此是植物代謝產(chǎn)物研究的重點。研究的重點。 由于資源短缺和需求量增加，依靠從栽培植物提取天然的次級代謝產(chǎn)物途徑很難滿足人類需求，而利用植物細胞生物反應(yīng)器大量培養(yǎng)次生代謝產(chǎn)物成為最有效途徑。優(yōu)點：l減少耕地占用，不受季節(jié)、地域限

19、制；l可以排除病菌和害蟲的影響(密閉無菌操作)；l可通過選擇優(yōu)良株系和優(yōu)化培養(yǎng)條件提高代謝物產(chǎn)量；l能通過改造生物合成途徑獲得新有用物質(zhì)。l植物次生代謝產(chǎn)物在醫(yī)藥、食品、輕化工業(yè)等植物次生代謝產(chǎn)物在醫(yī)藥、食品、輕化工業(yè)等領(lǐng)域具有重要意義領(lǐng)域具有重要意義 李時珍（李時珍（15931593）在本草綱目中所開列）在本草綱目中所開列的的18921892種藥物絕大多數(shù)是植物藥物，目前仍種藥物絕大多數(shù)是植物藥物，目前仍有約有約2525的法定藥品來自植物。其藥物的有的法定藥品來自植物。其藥物的有效成分均為次生產(chǎn)物。效成分均為次生產(chǎn)物。 1、藥用代謝產(chǎn)物 這是重要應(yīng)用領(lǐng)域，包括生物堿、萜類、苷類、酮類等。 例

20、如，紫杉醇（Taxol）是從紅豆杉屬植物中分離得到的一種二萜烯類化合物，治療乳腺癌、肺癌、卵巢癌等的藥物。通過植物細胞培養(yǎng)技術(shù)生產(chǎn)有價值的次生代謝產(chǎn)物需求：僅美國每年就有50 000名婦女患卵巢癌，每年需約24kg紫杉醇；還有約40 000名婦女死于乳腺癌，年需求量將增至100kg。全世界每年需要500kg紫杉醇才能滿足廣大癌癥患者需求。 生產(chǎn)1 kg紫杉醇需要砍伐60年生大樹3000-4000棵。紫杉醇在樹皮、嫩芽中含量最高。若光從樹皮中提取紫杉，每年需砍伐150-200萬棵左右的大樹。2、天然食品和食品添加劑 如胡蘿卜素、葉黃素、甜菊苷、辣椒素等，因為化學(xué)合成色素和甜味劑越來越受到擔心和嚴

21、格限制。3、殺蟲劑和殺菌劑 如利用萬壽菊細胞生產(chǎn)噻吩烷，香草生產(chǎn)魚藤酮殺蟲劑。4、飼料、精細化工等產(chǎn)品 如用培養(yǎng)的槡、榆等細胞，再加入大豆粉、糖、淀粉等可充足供應(yīng)蠶養(yǎng)殖業(yè)的飼料。 精細化工產(chǎn)品種類繁多（36類），附加值高，具有功能性或最終使用性。除上述醫(yī)藥、農(nóng)藥、添加劑外，還包括染料、涂料、香精、洗滌劑、化妝品、金屬表面處理劑、芳香消臭劑等產(chǎn)品。產(chǎn)品成分產(chǎn)品成分用途用途年銷售額年銷售額/ /億美元億美元長春花堿（長春花）長春花堿（長春花）治療白血病治療白血病18182020（美國）（美國）阿嗎靈阿嗎靈循環(huán)系統(tǒng)障礙藥循環(huán)系統(tǒng)障礙藥5 52525（全世界）（全世界）奎寧（金雞納樹）奎寧（金雞納樹）

22、治療瘧疾治療瘧疾5 51010（美國）（美國）致熱素致熱素殺蟲劑殺蟲劑2020（全世界）（全世界）毛地黃毛地黃心臟病藥心臟病藥20205555（美國）（美國）l聚酮途徑：又稱乙酸丙二酸途徑，乙酰輔酶聚酮途徑：又稱乙酸丙二酸途徑，乙酰輔酶A A通過直線式聚合生通過直線式聚合生成脂肪酸和環(huán)狀次級代謝產(chǎn)物。聚酮類化合物的合成。成脂肪酸和環(huán)狀次級代謝產(chǎn)物。聚酮類化合物的合成。l莽草酸途徑：生物堿、類黃酮、香豆素等產(chǎn)物。莽草酸途徑：生物堿、類黃酮、香豆素等產(chǎn)物。l甲戊二羥酸途徑：又稱甲瓦龍酸途徑，合成萜類、甾體、蒽醌等甲戊二羥酸途徑：又稱甲瓦龍酸途徑，合成萜類、甾體、蒽醌等產(chǎn)物。產(chǎn)物。（1）細胞株l植物不同部位的細胞產(chǎn)生次生代謝產(chǎn)物的能力是不同的，所以在進行植物細胞培