細(xì)胞mRNA的提取

1、精選優(yōu)質(zhì)文檔-傾情為你奉上技術(shù)方法名稱 細(xì)胞mRNA的提取基本原理 一個(gè)典型的哺乳動(dòng)物細(xì)胞含有約10-5 ug總RNA，其中8085%是核糖體RNA（主要有28S，18S，5.8S和5S四種）。剩余的1520%中大部分由不同的低相對(duì)分子量的RNA組成（如轉(zhuǎn)運(yùn)RNA和小核RNA）。這些高豐度的RNA的大小和序列確定，可通過凝膠電泳、密度梯度離心、陰離子交換層析和高壓液相層析（HPLC）分離。相反，占RNA總量15%的信使RNA即mRNA無(wú)論大小還是序列都是相異，其長(zhǎng)度從幾百堿基到幾千堿基不等，其實(shí)際含量也隨著細(xì)胞類型的不同而不同，隨細(xì)胞生理狀態(tài)的變化而變化。在單個(gè)哺乳動(dòng)物細(xì)胞中，大約有360,0

2、00個(gè)mRNA分子，12,000種不同的mRNA分子。有些mRNA在mRNA群體中的比例約為3%，而其它一些mRNA所占的比例則不超過0.01%。這些稀有或低豐度mRNA的拷貝數(shù)大約是每個(gè)細(xì)胞515個(gè)。然而，這些低豐度mRNA有11,000種，占mRNA群體的45%。在真核生物中，大部分mRNA（組蛋白除外）都是聚腺苷酸化的，其約200個(gè)腺苷酸殘基構(gòu)成的3尾部為分離真核mRNA提供了有效的方法。寡聚（dT）可以與poly（A）尾相結(jié)合，被用于回收mRNA。傳統(tǒng)方法是將提取的總RNA（用酚-氯仿抽提細(xì)胞裂解液）通過寡聚（dT）纖維素柱來制備。但為了能將核酸酶造成的損傷降至最低，現(xiàn)在常采用一種更迅

3、速的方法即直接將結(jié)合著寡聚（dT）的磁珠加入到細(xì)胞裂解液中，再用強(qiáng)磁鐵將磁珠吸出再洗出mRNA。某些情況下，裂解細(xì)胞后用蔗糖梯度來制備mRNA-核糖體復(fù)合物可以作為mRNA提取的替換途徑。因?yàn)楹颂菤埢?和3位帶有羥基，所以RNA比DNA的化學(xué)性質(zhì)更活躍，易于被污染的RNA酶 具有水解核糖殘基和磷酸間二酯鍵能力的酶切割。由于RNA酶從裂解的細(xì)胞中釋放且存在于皮膚上，故要小心防止玻璃器皿、操作平臺(tái)以及浮塵中RNA酶的污染。目前尚無(wú)使RNA酶失活的簡(jiǎn)易辦法。鏈內(nèi)二硫鍵的存在使許多RNA酶可抵抗長(zhǎng)時(shí)間煮沸和溫和變性劑，變性的RNA酶可迅速重新折疊。和大多數(shù)DNA酶不同，RNA酶不需要二價(jià)陽(yáng)離子激活，

4、因此難以被緩沖液中加入的EDTI或其他金屬離子螯合劑失活。防止RNA酶最好的方法就是避免污染。提取細(xì)胞mRNA后，可通過mRNA翻譯、凝膠電泳或Northern Blot分析來檢測(cè)mRNA的完整性，通過紫外分光光度計(jì)來檢測(cè)mRNA的純度。用途及受限因素酶學(xué)研究 cDNA文庫(kù)構(gòu)建 RT-PCR S1核酶分析 引物擴(kuò)增 核糖核酸酶保護(hù) 分子雜交 體外轉(zhuǎn)錄 差異顯示 基因表達(dá)分析mRNA在細(xì)胞總RNA中的比例很低，需要大量的樣本用于mRNA的提取，這就大大限制了稀有樣本的檢測(cè)。細(xì)胞mRNA的提取以Promega公司的PolyATtract System 1000為例基本原理任何一種RNA提取方法都包

5、括以下四個(gè)步驟：1）高效裂解細(xì)胞或組織；2）變性核蛋白復(fù)合物；3）滅活內(nèi)源性的RNase活性；4）純化RNA。所有這些步驟中最重要的是，立即滅活細(xì)胞裂解后從膜包圍的細(xì)胞器中釋放出的內(nèi)源性RNase。用強(qiáng)烈變性如鹽酸胍或硫氰酸胍溶液能迅速溶解蛋白質(zhì)，導(dǎo)致細(xì)胞結(jié)構(gòu)破碎。PolyATtract® System 1000利用硫氰酸胍（GTC）和-巰基乙醇來滅活細(xì)胞抽提液中的核酸酶，利用GTC和SDS來變性核蛋白復(fù)合物。核蛋白由于其二級(jí)結(jié)構(gòu)的破壞而從核酸上解離下來，使得RNA從溶液中釋放出來，并與蛋白質(zhì)分離。最終GTC的濃度允許mRNA的poly(A)與合成的生物素化的Oligo(dT)探針退

6、火，但仍能完全抑制細(xì)胞內(nèi)的RNases。短暫的離心完成雜交，并去除細(xì)胞碎片和沉淀的蛋白質(zhì)。離心后，用Streptavidin MagneSphere® Paramagnetic Particles (SA-PMPs)來捕獲生物素化的Oligo(dT) : mRNA雜交分子。先用高嚴(yán)謹(jǐn)性的條件洗滌磁珠，然后用Nuclease-Free Water洗脫，便可獲得純化的mRNA。實(shí)驗(yàn)材料實(shí)驗(yàn)耗材 細(xì)胞刮子、微量移液器、量筒、燒杯、鹽水瓶、止血鉗、錫箔紙、藥勺；進(jìn)口Tip、Tube試劑 NaAc、NaCl、KCl、Na2HPO4、KH2PO4、無(wú)水乙醇、異丙醇等，均為分析純，且最好是新的未開

7、封的； DEPC，焦碳酸二乙酯，購(gòu)自Invitrogen公司；PolyATtract System 1000，Cat# Z5400購(gòu)自Promega公司。實(shí)驗(yàn)前的準(zhǔn)備（包括溶液的配制及無(wú)RNAase和DNAase環(huán)境的建立）1.無(wú)RNAase和DNAase環(huán)境的建立² 玻璃制品、鐵制品、塑料制品和電泳槽 無(wú)菌的一次性使用的塑料制品（進(jìn)口）基本上無(wú)RNA酶，可以不經(jīng)預(yù)處理直接用于制備和貯存RNA。但為了保險(xiǎn)起見，將它們裝入無(wú)RNase和DNase的鐵飯盒（干烤：300，4h），加0.1 焦碳酸二乙酯（DEPC）的水溶液浸泡，37，至少2h，或室溫下過夜。隨后，高壓蒸汽滅菌，15 psi

8、（1.05 kg/cm2），15 min。再烘干，100，23h。實(shí)驗(yàn)室用的普通玻璃器皿、鐵制品和塑料制品經(jīng)常有RNA酶法染，使用前必須于300 干烤4 h或更長(zhǎng)時(shí)間（玻璃器皿、鐵制品，若是敞口的器皿，需用錫箔紙封口后再干烤）或用氯仿沖洗（塑料制品）。另一種方法是用0.1 焦碳酸二乙酯（DEPC）的水溶液浸泡用于制備RNA的燒杯，試管和其他用品。灌滿DEPC的玻璃或塑料器皿在37放置小時(shí)，然后用滅菌水淋洗數(shù)次， 并于100干烤15 min。在15 lbf/in2(1.034x105 Pa)高壓蒸氣滅菌15 min。上述處理可以除去器皿上痕量的DEPC，以防DEPC通過羧甲基化作用對(duì)RNA的嘌呤

9、堿基進(jìn)行修飾。 用于RNA電泳的電泳槽應(yīng)用去污劑洗干凈，再用水沖洗，用乙醇干燥，然后灌滿3的H2O2溶液，于室溫放置10 min，然后用0.1DEPC處理過的水徹底沖洗電泳槽。最好能留出一些玻璃器皿、塑料制品和電泳槽作上特殊標(biāo)記，存放在指定地點(diǎn)，為RNA實(shí)驗(yàn)專用。附 DEPCDEPC是具有高度活性的烷基化試劑，它通過組胺基團(tuán)的乙氧基甲酸化形式破壞RNase的酶活性。雖然DEPC是RNase的強(qiáng)烈抑制劑，但是它的作用并不是絕對(duì)的。在水溶液中，DEPC迅速水解為CO2和乙醇，在pH6.0的磷酸緩沖液中半衰期為20 min，在pH為7.0的磷酸緩沖液中為10 min。這種水解過程通過Tris和其它胺

10、類大大加速，它們自己本身也在這一過程中消耗了。因此，DEPC不能用來處理含有這些緩沖液的溶液。無(wú)親核體（例如：水和乙醇）的DEPC樣品是非常穩(wěn)定的，但是甚至小量的上述溶質(zhì)也能導(dǎo)致DEPC完全轉(zhuǎn)化成碳酸二乙酯。由于這個(gè)原因，DEPC應(yīng)該防潮，并小份儲(chǔ)存于干燥的條件下，在開啟瓶子前，應(yīng)該使瓶子達(dá)到足夠的溫度。² 溶液的處理用干烤過的藥匙稱取試劑，用DEPC處理過的無(wú)菌去離子水溶解和稀釋試劑，將溶液裝入無(wú)RNase的玻璃器皿。可能的話，溶液均應(yīng)用0.1DEPC于37至少處理12 h，然后于100加熱15 min或在15 lbf/in2(1.034x105 Pa)的高壓下蒸氣滅菌15 min

11、。 DEPC可與胺類迅速發(fā)生化學(xué)反應(yīng)，因此不能用來處理含有Tris一類的緩沖液?？纱鎺灼啃碌奈撮_封的Tris晶體以制備無(wú)RNA酶的溶液。² 操作者及其操作環(huán)境RNase最主要的潛在污染源是操作者和灰塵。操作者應(yīng)該戴一次性手套，并勤換手套；應(yīng)該戴口罩和帽子，盡量不要對(duì)著RNA樣品呼氣或說話?；覊m中含有細(xì)菌和霉菌，所以應(yīng)該保持操作環(huán)境整潔。對(duì)于多次使用的試劑，最好無(wú)菌操作。2.溶液的配制² 無(wú)DNase和RNase的去離子水將新鮮制備的去離子水裝入干烤過的鹽水瓶，加入DEPC，使其終濃度達(dá)到0.1%，振蕩混勻后，置于37過夜。高壓蒸汽蒸汽滅菌，15 lbf/in2(1.034x

12、105 Pa)，15 min。² 3M 醋酸鈉溶液（100 ml）NaAc3H2O 40.81 g新鮮制備的去離子水 80 ml攪拌溶解后，用冰乙酸調(diào)pH至5.2，約需1.85 ml，再加去離子水調(diào)至100 ml。加入100 ul DEPC，振蕩混勻后置于37過夜，然后高壓蒸汽滅菌，15 lbf/in2(1.034x105 Pa)，15 min。² PBS（200 ml）NaCl 16 gKCl 0.4g Na2HPO4·12H2O 7.26 gKH2PO4 0.48 g用160 ml DEPC處理過的無(wú)菌去離子水溶解上述試劑，用濃HCl調(diào)pH至pH7.4，再用D

13、EPC處理過的無(wú)菌去離子水定容至200 ml。高壓蒸汽滅菌，15 lbf/in2(1.034x105 Pa)，15 min。² 70%乙醇 采用DEPC處理過的無(wú)菌去離子水配制。² 無(wú)血清培養(yǎng)基1640 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)可以根據(jù)起始材料的量來確定試劑的用量。對(duì)于培養(yǎng)細(xì)胞，每次mRNA提取所用的細(xì)胞數(shù)量上下限分別為108和106。對(duì)于純化的mRNA，則分別用紫外分光光度計(jì)測(cè)定數(shù)量和純度，用凝膠電泳分析完整性。操作步驟及每步需注意的事項(xiàng)按照PolyATtract System 1000的protocol進(jìn)行，并作了些修改，具體如下。1.收集細(xì)胞² 清潔工作 用干凈紗布擦拭桌面

14、；用酒精棉球擦拭桌面、微量移液器、試管架、止血鉗、磁架等；² 預(yù)熱試劑將試劑盒中的下列組分取出置于桌面上，暖至室溫。GTC Extraction Buffer、Biotinylated Oligo(dT) Probe、Nuclease-Free Water、SSC（0.5×）² 洗滌細(xì)胞 先用無(wú)血清培養(yǎng)基1640洗滌細(xì)胞，10 ml/T75瓶/次，共3次。² 刮細(xì)胞 每個(gè)培養(yǎng)瓶中分別加入6 ml 1640，用細(xì)胞刮子刮下細(xì)胞，注意培養(yǎng)瓶的四個(gè)角。鏡檢判斷是否還有殘余細(xì)胞。將刮下的細(xì)胞連同1640轉(zhuǎn)移至50 ml離心管。用1640洗滌培養(yǎng)瓶，以回收殘留在培

15、養(yǎng)瓶中的細(xì)胞，盡量減少損失。1640的用量為：6 ml/5瓶。然后將液體與上一步合并。² 洗滌細(xì)胞 離心，1,500 rpm，10 min。去上清，加入預(yù)冷的PBS，輕輕重懸細(xì)胞沉淀，并使細(xì)胞完全分散。離心，1,500 rpm，10 mim，去上清，備用。期間，預(yù)熱Dilution Buffer至70。2.裂解細(xì)胞 在一個(gè)新的無(wú)RNase和DNase污染的50 ml離心管中混和4 ml GTC Extraction Buffer和164 ul -巰基乙醇。Vortex混勻后加到含細(xì)胞沉淀的50 ml離心管中，高速Vortex至細(xì)胞完全裂解。3.探針退火² 在一個(gè)新的無(wú)RNa

16、se和DNase污染的50 ml離心管中分別加入8 ml 70預(yù)熱的Dilution Buffer和164 ul -巰基乙醇。Vortex混勻后加到細(xì)胞裂解液中，上下顛倒混勻。² 加入10 ul Biotinylated Oligo(dT) Probe，混勻后70水浴5 min。² 將裂解液轉(zhuǎn)移至12個(gè)1.5 ml eppendorf管中，室溫下離心，12,000 rpm，10 min（離心前平衡離心機(jī)溫度至室溫。在室溫下離心目的是避免溶液中的鹽分和去污劑的析出）。² 將上清分別轉(zhuǎn)移至12個(gè)新的1.5 ml eppendorf管中，室溫下離心，12,000 rpm

17、，10 min。4.洗滌偶聯(lián)有鏈霉親和素的磁珠SA-PMPs可以安排在步驟3中的離心期間進(jìn)行。² 輕搖瓶子，使SA-PMPs完全重懸。² 轉(zhuǎn)移6 ml SA-PMPs至一個(gè)新的RNase Free的50 ml離心管中，將離心管置于磁架上，慢慢放平。待磁珠完全聚集到管子一側(cè)時(shí)，小心倒掉儲(chǔ)存緩沖液。² 加入6 ml 0.5×SSC重懸SA-PMPs，磁架捕獲后倒掉上清，具體作法同上一步。² 重復(fù)洗滌步驟2次，即洗滌3次，然后加入6 ml 0.5×SSC重懸SA-PMPs。5.捕獲和洗滌磁珠² 當(dāng)步驟3完成后，小心轉(zhuǎn)移上清至洗滌過

18、的SA-PMPs中，上下顛倒混勻。注：勿吸沉淀。吸到沉淀會(huì)導(dǎo)致整個(gè)系統(tǒng)的效能。² 室溫下孵育10 min。² 用磁架捕獲SA-PMPs，將上清轉(zhuǎn)移至一個(gè)新的RNase Free的50 ml離心管中，冰浴保存至確認(rèn)有滿意的結(jié)果為止。² 用1.8 ml（分兩次，第一次用1 ml，第二次用0.8 ml）0.5×SSC重懸SA-PMPs并轉(zhuǎn)移至一個(gè)2 ml mRNA User Tube中。用磁架捕獲磁珠后，用微量移液器小心地移去上清。² 重復(fù)洗滌4次，即共洗滌5次。最后一次洗滌完成后，盡可能地移去上清，但不擾動(dòng)SA-PMPs。注：洗滌時(shí)應(yīng)遠(yuǎn)離磁架，同時(shí)

19、應(yīng)上下顛倒2 ml mRNA User Tube以達(dá)到充分洗滌SA-PMPs為止。6.洗脫mRNA² 加入總量為1 ml的RNase Free Water，上下顛倒數(shù)次后，室溫下孵育3 min。用磁架捕獲SA-PMPs后，將上清轉(zhuǎn)移至2個(gè)1.5 ml eppendorf管中，每管0.5 ml，分別編號(hào)為1，2。² 重復(fù)上一步驟一次，eppendorf管的編號(hào)分別為3，4。² 往2 ml mRNA User Tube中加入1 ml RNase Free Water，冰浴保存至mRNA產(chǎn)量和純度的測(cè)定完成為止。7.沉淀mRNA² 往1，2，3，4號(hào)eppen

20、dorf管中分別加入50 ul 3 M NaAc和500 ul 異丙醇，上下顛倒混勻后，-20沉淀過夜。² 4下離心，13,000 rpm，25 min。離心完成后，看不到沉淀，但磁珠可指示沉淀的位置。² 沿著與沉淀面相背的一側(cè)吸出上清。注意勿吸丟沉淀。² 分別加入1 ml 70%乙醇。注意：用微量移液器輕輕而又緩慢地將70%乙醇從與沉淀面相背的一側(cè)加入。² 4下離心，13,000 rpm，25 min。² 沿著與沉淀面相背的一側(cè)緩慢地將70%乙醇吸去。注意勿吸丟沉淀。² 室溫下晾干。注意：沉淀不能太干，否則可能難溶解。²

21、用5 ul RNase Free Water溶解沉淀。溶解沉淀時(shí)，用微量移液器反復(fù)吸放，以達(dá)到充分溶解的目的。8.紫外分光光度計(jì)測(cè)定mRNA的數(shù)量和純度9.瓊脂糖凝膠電泳分析mRNA的完整性10.mRNA的保存短期保存（<30 d）：以0.5-1.0 mg/ml的濃度溶解在水中，并保存于-70。長(zhǎng)期保存（>30 d）：將RNA沉淀保存在70%乙醇中，置于-70。結(jié)果觀察及分析的原則1）紫外分光光度計(jì)測(cè)定mRNA的數(shù)量和純度280、320、230、260nm下的吸光度分別代表了核酸、背景（溶液渾濁度）、鹽濃度和蛋白等有機(jī)物的值。對(duì)于純凈的樣品，A320一般是0，A260 / A230 的比值大于2.0。若A260 / A230小于2，則表明樣品中仍存在GTC或-巰基乙醇。對(duì)于A260 / A280（Ratio，R），當(dāng)R>1.82時(shí)，說明RNA中蛋白或者其他有機(jī)物的污染是可以容忍的，不過要注意，當(dāng)用Tris作為緩沖液檢測(cè)吸光度時(shí)，R值可能會(huì)大于2（一般應(yīng)該是<2.2的）。當(dāng)R<1.8時(shí)，溶液中蛋白或者時(shí)其他有機(jī)物的污染比較明顯，你可以根據(jù)自己的需要決定要不要使用這份RNA（不同的實(shí)驗(yàn)對(duì)RNA質(zhì)量的要求不同）。當(dāng)R>2.2時(shí)，說明RNA已經(jīng)水解成單核酸了。測(cè)定mRNA的純度