光化學(xué)療法對人白血病細(xì)胞凋亡及Fas表達(dá)的影響

1、光化學(xué)療法對人白血病細(xì)胞凋亡及Fas表達(dá)的影響 作者：陳楠楠,黃世林,向陽,張德杰,張晨,張勵【摘要】 目的 觀察光化學(xué)療法(PUVA)誘導(dǎo)人白血病細(xì)胞HL-60、K562、NB4凋亡時對Fas表達(dá)的影響。方法 人白血病細(xì)胞分別與不同濃度補骨脂素(PSO)、接受或不接受長波紫外線(UVA)照射后共同培養(yǎng),電鏡下觀察細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)改變,熒光定量PCR技術(shù)檢測細(xì)胞Fas基因的表達(dá),流式細(xì)胞儀(FCM)檢測細(xì)胞凋亡率和Fas蛋白的表達(dá),采用多因素方差分析法進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)處理。結(jié)果 PUVA處理后的人白血病細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)出現(xiàn)明顯的凋亡形態(tài)學(xué)改變；PSO、UVA照射及PUVA可使細(xì)胞凋亡率增加,可上調(diào)白血病細(xì)胞

2、Fas在基因、蛋白水平的表達(dá),PUVA的作用顯著強于前兩者(P<0.01)。結(jié)論 PUVA可誘導(dǎo)人白血病細(xì)胞發(fā)生凋亡,作用強于PSO及UVA照射。PUVA誘導(dǎo)白血病細(xì)胞凋亡的途徑之一為上調(diào)HL-60細(xì)胞Fas基因表達(dá)。 【關(guān)鍵詞】 光化學(xué)療法；白血??；HL-60細(xì)胞；K562細(xì)胞；NB4細(xì)胞；細(xì)胞凋亡；Fas Key words：PUVA therapy；leukemia；HL-60 cells；K562 cells；NB4 cells；apoptosis；Fas補骨脂素(psoralen,PSO)具有光敏性質(zhì)與抗腫瘤活性。本實驗以不同濃度加波長為360 nm,不同照射時間的長波

3、紫外線(ultraviolet A,UVA)光照作用于人白血病細(xì)胞HL-60、K562、NB4,通過流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞在光化學(xué)療法(PUVA)后的凋亡情況；電鏡下觀察細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)改變；熒光定量PCR及流式細(xì)胞技術(shù)檢測Fas在基因、蛋白水平的表達(dá)情況,以探討PUVA法對人白血病細(xì)胞誘導(dǎo)凋亡的作用及部分作用途徑。1 材料與方法1.1 細(xì)胞株 人急性髓細(xì)胞白血病(FAB-M2)HL-60細(xì)胞、人紅白血病細(xì)胞K562由大連醫(yī)科大學(xué)惠贈；人急性髓細(xì)胞白血病(FAB- M3)NB4細(xì)胞為上海血液學(xué)研究所陳竺院士惠贈。1.2 藥物及主要試劑 PSO由大連理工大學(xué)及本院共同從補骨脂中提取和制備。二甲基亞砜(D

4、MSO)購自北京化工廠,RPMI1640培養(yǎng)液、胎牛血清為Gibco產(chǎn)品,小牛血清系杭州四季青生物材料工程公司產(chǎn)品,Trizol為美國GIBCOBRL產(chǎn)品,Fas基因表達(dá)試劑盒購自中山大學(xué)達(dá)安基因股份有限公司,鼠抗人Fas(CD95)單克隆抗體為美國CALTAG實驗室產(chǎn)品。1.3 儀器和設(shè)備 流式細(xì)胞儀購自美國貝克曼庫爾特公司,GLY-10型光量子血液平衡治療儀由徐州華衛(wèi)醫(yī)療設(shè)備公司研制,熒光定量PCR儀(DA7600型)購自中山大學(xué)達(dá)安基因股份有限公司。1.4 細(xì)胞培養(yǎng) HL-60、K562、NB4細(xì)胞分別常規(guī)培養(yǎng)于含10%小牛血清及10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基(含硫酸慶大霉素0.

5、025 U/mL)中,于37 、5%CO2、飽和濕度培養(yǎng)箱中進(jìn)行連續(xù)培養(yǎng)。1.5 分組 依據(jù)紫外線照射時間將實驗組分為下列2組：長波紫外線照射0 min組；長波紫外線照射5 min組。1.6 細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)觀察 收集濃度為5.0×105/mL,經(jīng)PUVA處理的白血病細(xì)胞10 mL,用PBS清洗2次,轉(zhuǎn)入2.0 mL離心管,離心(2 000 r/min)3 min,棄上清,緩緩加入2.5%戊二醛2 mL,4 冰箱靜置2 h以上。磷酸緩沖液沖洗,鋨酸固定,水洗、脫水,浸透、包埋,制定超薄切片,透射電鏡下觀察。1.7 光化學(xué)療法24 h后白血病細(xì)胞的凋亡情況 取濃度為4.0×105

6、/mL、處于對數(shù)生長期的白血病細(xì)胞株5 mL,分別加入0、5、10、20、40 L的PSO,使其在反應(yīng)體系中的終濃度分別為0、10、20、40、80 g/mL,放入石英比色皿中,在GLY-10型光量子血液平衡治療儀(360 nm)上以1 J/m2輻射量邊照射邊震蕩,照射時間分別為0、5 min。處理后各實驗組細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)24 h后,收集5.0×105/mL細(xì)胞,用PBS洗2次,棄上清,加入100 L碘化丙啶(PI)染液,避光反應(yīng)30 min,加入PBS 400 L,上機檢測,并用Multicycle軟件分析得出相應(yīng)的細(xì)胞凋亡百分率。1.8 光化學(xué)療法24 h后白血病細(xì)胞Fas基因表達(dá)

7、情況 總RNA提取,采用Trizol一步法提取mRNA,按照試劑盒說明書操作。cDNA合成,反應(yīng)體系包括：5×反轉(zhuǎn)錄buffer 4 L(含Mg2+4 mmol/L),反轉(zhuǎn)錄酶(200 U/L)1 L,dNTPs (10 mmol/L)0.5 L,上游引物0.4 L,下游引物0.4 L,DEPC水9.7 L,RNA模板4 L,總體積20 L；反應(yīng)條件：37 1 h, 95 3 min。將cDNA進(jìn)行PCR擴增,反應(yīng)體系包括：5×定量PCR buffer 10 L(含Mg22 mmol/L),Taq酶(3 U/L)1 L,Fas上游引物1.0 L,下游引物1.0 L,各自的熒

8、光探針1.0 L(注：上、下游引物,探針的終濃度均為10 pmol/L),dNTP 1 L,ddH2O 30 L,cDNA模板5 L,總體積50 L；同時,將制備的定量模板按照2×108/mL、2×107/mL、2×106/mL、2×105/mL、2×104/mL梯度稀釋,加入不同反應(yīng)管中,在DA7600型熒光PCR儀進(jìn)行擴增；反應(yīng)條件：93 2 min,93 1 min, 55 1 min,共40個循環(huán)。反應(yīng)結(jié)束后用由計算機計算定量結(jié)果,再通過換算得出每微克總RNA中Fas的mRNA拷貝數(shù)。上、下游引物及探針序列：Forward Primer

9、：5-GGGCAT CTGGACCCTCCTA-3；Reverse Primer：5-GGCATTAACACTTTTGGA CGATAA-3；Probe：5-FAM-CTCTGGTTCTTACGTCTGTTGCTAG- TAMRA-3。1.9 光化學(xué)療法24 h后白血病細(xì)胞Fas蛋白表達(dá)情況 收集白血病細(xì)胞1×106個,PBS洗滌1次后棄上清液,加入FITC-Fas抗體10 L,避光孵育20 min,加500 L PBS上機檢測Fas蛋白表達(dá),以FITC-IgG1做對照。1.10 統(tǒng)計學(xué)方法 所有實驗結(jié)果均來自至少3組平行或3次重復(fù)實驗。各種計量資料以x±s表示,采用多因素

10、方差分析；所有統(tǒng)計計算均用SPSS11.5統(tǒng)計軟件進(jìn)行,P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。2 結(jié)果2.1 光化學(xué)療法后細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的改變 白血病細(xì)胞HL-60、K562、NB4均出現(xiàn)細(xì)胞體積縮小,胞漿濃縮,胞核體積減小,可裂解成一個或數(shù)個致密體,可見核小體碎裂,核染色質(zhì)聚集或邊集,部分染色質(zhì)致密成斑塊狀或沿核膜收縮成新月體狀,整個細(xì)胞可裂解成大小不一凋亡小體。2.2 光化學(xué)療法誘導(dǎo)白血病細(xì)胞凋亡的作用(見表1表3)表1 PUVA后24 h HL-60細(xì)胞凋亡率(略)注：與0 min組 0 g/mL比較,*P<0.01；與0 min組比較,P<0.01(下

11、同)表2 PUVA后24 h K562細(xì)胞凋亡率(略)3 PUVA后24 h NB4細(xì)胞凋亡率(略)2.3 光化學(xué)療法24 h后白血病細(xì)胞Fas基因表達(dá)情況(見表4表6)表4 PUVA后24 h HL-60細(xì)胞Fas mRNA的表達(dá)(略)表5 PUVA后24 h K562細(xì)胞Fas mRNA的表達(dá)(略)表6 PUVA后24 h NB4細(xì)胞Fas mRNA的表達(dá)(略)2.4 光化學(xué)療法24 h后白血病細(xì)胞Fas蛋白表達(dá)情況(見表7表9)表7 PUVA后24 h HL-60細(xì)胞Fas蛋白表達(dá)(略)表8 PUVA后24 h K562細(xì)胞Fas蛋白表達(dá)(略)表9 PUVA后24 h NB4細(xì)胞Fas蛋

12、白表達(dá)(略)3 討論 PSO的抗腫瘤、抗白血病作用,以及其具有的光敏活性已被人們所認(rèn)識1-5。本院開展了PUVA體外凈化自體骨髓移植治療各類白血病的臨床研究,初步結(jié)果令人鼓舞。 本實驗采用紫外波長為360 nm的GLY-10型光量子血液平衡治療儀和/或補骨脂中提取的PSO對人白血病細(xì)胞HL-60、K562、NB4進(jìn)行處理,結(jié)果從電鏡下的細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)改變和流式細(xì)胞儀檢測的細(xì)胞凋亡率兩個方面證實了PUVA對白血病細(xì)胞誘導(dǎo)凋亡的作用。 Fas/FasL系統(tǒng)在傳遞細(xì)胞凋亡信號中起著重要作用6。結(jié)果顯示HL-60、K562、NB4細(xì)胞Fas的表達(dá)下降。當(dāng)Fas水平下調(diào)至低于Fas/FasL途徑誘導(dǎo)凋亡的

13、閾值時,凋亡受到抑制,從而導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞逃避機體免疫系統(tǒng)監(jiān)視,在體內(nèi)無限增殖。熒光定量PCR技術(shù)檢測結(jié)果顯示,PUVA上調(diào)Fas基因的表達(dá),經(jīng)PUVA作用后,HL-60細(xì)胞Fas基因表達(dá)拷貝數(shù)的數(shù)量級由對照組的103上升至106,K562細(xì)胞Fas基因表達(dá)拷貝數(shù)的數(shù)量級由對照組的104上升至107,NB4細(xì)胞Fas基因表達(dá)拷貝數(shù)的數(shù)量級由對照組的105上升至108,均上調(diào)了3個數(shù)量級。流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果在Fas蛋白質(zhì)水平上進(jìn)一步證實上述結(jié)果。由此我們認(rèn)為,PUVA誘導(dǎo)人白血病細(xì)胞發(fā)生凋亡的作用途徑之一是對Fas/FasL系統(tǒng)的調(diào)控,通過上調(diào)Fas基因而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。 另外,實驗結(jié)果顯示,PSO、

14、UVA及PUVA均有誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡及上調(diào)Fas基因、蛋白表達(dá)的作用,但無論從直觀角度還是從統(tǒng)計分析結(jié)果上看,PUVA的作用要顯著強于前兩者,再一次證明PSO光敏活性的同時,也反映出中藥成分PSO的光敏活性在PUVA對白血病治療作用中的重要性?！緟⒖嘉墨I(xiàn)】 1 陳楠楠,黃世林,張德杰.等.補骨脂素加長波紫外線對人白血病細(xì)胞株NB4、HL-60、K562作用的研究J.中國中醫(yī)急癥,2007,16(4)：444446.2 吳少華,張仲海,趙建斌.補骨脂素體內(nèi)外抗癌活性的實驗研究J.中國中藥雜志,1998,23(5)：303305.3 Garneiro LV, Ferreira SR, Chen CL,

15、 et al. Psoralen derivatives and longwave ultraviolet irradiation are active in vitro against human melanoma cell lineJ. J Photochem Photobiol B,2004, 76(1/3)：4953.4 Plumas J,Drillat P,Jacob MC,et al.Extracorporeal photochemotherapy for treatment of clonal T cell proliferationsJ. Bull Cancer, 2003,90(8/9)：6370.5 Effect T, Fabry U, Osieka R, et al. Induction of apoptosis, depletion of