產(chǎn)氣莢膜梭菌ε毒素及其疫苗研究進(jìn)展.docx

1、產(chǎn)氣莢膜梭毒素及其疫苗研究進(jìn)展王光華】，黃生蓮2,周繼章1,邱昌慶（1.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所家畜疫病病原生物學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室農(nóng)業(yè)部草食動物疫病重點(diǎn)開放實(shí)驗(yàn)室甘肅蘭州730046,2.青海省大通縣朔北獸醫(yī)站，青海大通810100）摘要：產(chǎn)氣莢膜梭菌病是由產(chǎn)氣英膜梭菌引起的一種重要的人善共患傳染病，可導(dǎo)致山羊、綿羊等動物的腸毒血癥或壞死性腸炎，并且可引起動物腦、心、肺和腎組織的水腫。B型和D型產(chǎn)氣莢膜梭菌所產(chǎn)生的e毒素是引起動物上述病理變化和死亡的重要因素之一。雖然甲醛滅活的毒素疫苗能對動物產(chǎn)生保護(hù)性抗體，但是，滅活苗潛在的安全性原因使其在應(yīng)用上受到限制。因此，基于E毒素基因的重組疫苗和弱

2、毒疫苗就成為人們研究的目標(biāo)。關(guān)鍵詞：產(chǎn)氣莢膜梭菌；&毒素；疫苗中圖分類號：S852.616.3文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A文章編號:1007-5038（2009）05-0073-03產(chǎn)氣莢膜梭菌（Clostridiumperfringens）,也稱魏氏梭菌（Clostridiumzvelchii）,是一種廣泛分布于自然界和動物腸道中的條件性致病菌。根據(jù)細(xì)菌產(chǎn)生外毒素（主要為a、B、c）的種類差別，可將產(chǎn)氣莢膜梭菌分成A、B、C、D、E5型。毒素的編碼基因etx位于質(zhì)粒上，etx基因編碼的蛋白&毒素前體在分泌初期是無毒性的，通過蛋白酶去除毒素前體N端的13個氨基酸和C端22個氨基酸后成為有活性的成熟肽，成熟肽

3、分子質(zhì)量為32ku0e毒素為B型和D型產(chǎn)氣莢膜梭菌產(chǎn)生，是D型菌的主要致病因子，可導(dǎo)致山羊、綿羊等動物的致死性腸道疾病,對畜牧業(yè)造成很大的經(jīng)濟(jì)損失。由于B型和D型產(chǎn)氣莢膜梭菌不是從人類分離的病原體，因此作毒素對人類或靈長類動物的危害還不是很清楚，當(dāng)前的疫苗研究只能以反芻動物和嚙齒類動物為研究對象。1 毒素引起的臨床癥狀Uzal和Finnie已將產(chǎn)氣莢膜梭菌e毒素對綿羊和山羊產(chǎn)生的臨床和神經(jīng)學(xué)上的癥狀做了詳細(xì)的闡述。一般而言，綿羊感染D型產(chǎn)氣莢膜梭菌后會發(fā)生突然死亡，有時并不表現(xiàn)出神經(jīng)癥狀家和胃腸炎并發(fā)癥，而山羊感染后會產(chǎn)生嚴(yán)重的小腸結(jié)腸炎或慢性消耗性癥狀，往往預(yù)后不良。嚙齒類動物現(xiàn)已作為用于e

4、毒素產(chǎn)生神經(jīng)病理性損害的研究模型。用&毒素注射小鼠后，臨床上表現(xiàn)為癲癇、過度興奮或抑郁并伴有輕微的腸氣，剖檢可發(fā)現(xiàn)腦水腫，組織學(xué)上出現(xiàn)多病灶性的急性腎小管壞死以及肺水腫。該毒素是致死性毒素，給小鼠靜脈注射納克級的e毒素，在30min內(nèi)即可引起小鼠死亡，并且其毒力僅次于肉毒素和破傷風(fēng)毒素。將毒素用生理鹽水稀釋后注入小鼠的胃和結(jié)扎的腸段中，比較后發(fā)現(xiàn)，除胃部以外小腸和大腸都能吸收該毒素，并且發(fā)現(xiàn)從結(jié)腸吸收毒素后的致死率高于從小腸吸收后的致死率，可見&毒素能在小鼠的任意腸段吸收。動物試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)任毒素發(fā)揮作用時首先可以使大腦、腎臟和小腸中的血管通透性增高，多種組織器官發(fā)生充血和水腫，死于腸毒血癥的羔羊也

5、可發(fā)生腎臟壞死區(qū)。這種毒素可以通過血腦屏障在大腦中蓄積，從而提高了腦血管通透性并導(dǎo)致外周血管水腫，所以，中毒后發(fā)生腸毒血癥的動物末期會有一些神經(jīng)癥狀，如角弓反張、驚厥、瀕死期掙扎等口。雖然,A型和C型產(chǎn)氣莢膜梭菌（不產(chǎn)e毒素）感染人以后能引起胃腸疾病，但是至今還沒有&毒素對人和靈長類動物致病的報道。從小動物試驗(yàn)中推測，e毒素靜脈注射人體的致死劑量約為100ng/kgC10氣溶膠或口服方式對人的致死劑量主要取決于人體呼吸道和胃腸道與毒素的相互作用，而這方面國內(nèi)外還未見研究報道。2 e毒素的生物學(xué)特點(diǎn)收稿日期:200902-23基金項(xiàng)目:國家科技基礎(chǔ)性工作專項(xiàng)（2008FY210200）作者簡介：

6、王光華（1978），男（蒙古族），青海大通人.博士研究生，主要從事動物傳染病分子免疫學(xué)研完。*通訊作者E毒素前體在分泌初期是無毒性的，通過蛋白酶去除毒素前體N端的13個氨基酸和C端22個氨基酸后成為有活性的成熟肽，參與活化的蛋白酶包括產(chǎn)氣莢膜梭菌產(chǎn)生的人蛋白酶和消化性蛋白酶如胰蛋白酶、a胰凝乳蛋白酶。這種通過切除N、C末端兩段序列且還有菌體自身蛋白參與的活化過程較為少見。MiyataS等口日證明，去除C末端賽基酸殘基是活化作用的關(guān)鍵，而且不同的酶切產(chǎn)生的毒素的N、C末端及其活性也不相同。其中以胰蛋白酶加胰凝乳蛋白酶活化的毒素毒力最強(qiáng)，而N末端氨基酸殘基去除與否對毒素活性基本沒有影響。惟有C末端

7、的切除位點(diǎn)對毒素活性，包括在神經(jīng)突觸膜上形成七聚體的能力有影響。去除C末端氨基酸殘基后的成熟毒素其毒性是毒素前體的1000倍。目前對e毒素的作用模型還不十分明確，但基本上認(rèn)定其是一種成孔毒素，對犬腎細(xì)胞（MDCK）具有致死作用；可以在其細(xì)胞膜上形成一種復(fù)合物進(jìn)入細(xì)胞并導(dǎo)致胞內(nèi)K+外流；與細(xì)胞膜形成的復(fù)合物不會被SDS解離；晶體結(jié)構(gòu)顯示其主要由p片層構(gòu)成;這些都是成孔毒素的主要結(jié)構(gòu)特點(diǎn)C12-13OPetitL等I試驗(yàn)證明任毒素在與大鼠突觸小體和MDCK膜上的受體結(jié)合后可形成七聚體復(fù)合物，該復(fù)合物并不能被細(xì)胞內(nèi)吞入細(xì)胞中，而是在細(xì)胞膜表面形成一個大的孔隙，并導(dǎo)致細(xì)胞膜通透性改變，使得大量（約90

8、%）的K離子外溢，Na離子和C1離子濃度大幅增高，Ca離子濃度稍微增高，一些有害的物質(zhì)，如碘化丙錠進(jìn)入細(xì)胞，導(dǎo)致細(xì)胞死亡。該毒素的靶位是細(xì)胞膜上具有抗去污劑性質(zhì)的結(jié)構(gòu)域（DMRs）,這種結(jié)構(gòu)域與毒素形成七聚體的能力要強(qiáng)于它與其它成分的作用，所以e毒素的受體主要存在于DMRs上，毒素與之結(jié)合后會誘發(fā)形成毒素七聚體，毒素從與受體結(jié)合到在細(xì)胞膜上成孔的過程都在同一個DMRs中完成，而形成七聚體的過程是毒素發(fā)揮作用的前提C15-163o此外，亞致死量或致死量的a或0毒素與e毒素同時注射小鼠后的死亡時間比單獨(dú)注射e毒素的時間短，表明a和。都具有增強(qiáng)毒素對腸毒血癥宿主的致死效果成，其機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。

9、E毒素與宿主細(xì)胞表面的作用機(jī)制還不是很清楚，但是現(xiàn)已證明它可以識別小鼠腦細(xì)胞和突觸小體膜上的唾液糖蛋白受體。目前只有兩種細(xì)胞系對e毒素敏感，分別為MDCK和人成平滑肌瘤G402細(xì)胞,據(jù)推測這與這兩種細(xì)胞表面存在有效結(jié)合毒素的受體有關(guān)。3 毒素的免疫和疫苗目前，家畜用產(chǎn)氣莢膜梭菌滅活苗的免疫效果不一，如果能掌握D型產(chǎn)氣莢膜梭菌產(chǎn)生致死毒素的特征以及培養(yǎng)上清中毒素的致死效果，則有可能提高此類疫苗的效果。SayeedS等口刃研究了D型產(chǎn)氣莢膜梭菌培養(yǎng)上清中的e毒素水平與小鼠致死率的關(guān)系，隨后用&毒素的單克隆抗體證明D型產(chǎn)氣莢膜梭菌培養(yǎng)上清中的&毒素就是引起小鼠死亡的主要毒素。對于類毒素疫苗在反芻類和

10、嚙齒類動物上的免疫效果主要用其產(chǎn)生的抗體評價。用小鼠單克隆抗體已經(jīng)確定出在&毒素上至少有兩個中和表位，并且這些抗原表位和抗體的作用機(jī)制已經(jīng)研究的比較清楚。Pitit等證明抗e毒素多克隆抗體或單克隆抗體能夠在體外阻止毒素在MDCK細(xì)胞膜上形成七聚體，表明抗體能阻止毒素對組織的破壞。滅活疫苗在反芻動物上的有效性還有質(zhì)疑，但已經(jīng)廣泛應(yīng)用于綿羊和山羊2?！?。用于人類和靈長類動物的e毒素甲醛滅活苗至今還未見報道，因此，有必要開發(fā)一種既能用于人類又能用于動物的e毒素重組、減毒苗。目前已有很多這方面的報道，如對已經(jīng)確定的對小鼠有致死活性的關(guān)鍵氨基酸殘基進(jìn)行化學(xué)修飾,這些氨基酸殘基包括組氨酸、色氨酸和酪氨酸。

11、根據(jù)這些研究結(jié)果，OystenPC等小對e毒素毒性起關(guān)鍵作用的組氨酸、色氨酸等氨基酸殘基進(jìn)行定向突變，共得到10個突變體,其中只有一個突變體H106P,靜脈注射小鼠后沒有發(fā)現(xiàn)毒性。這很可能是由于脯氨酸的替換改變了毒素蛋白的三級構(gòu)象,從而影響了蛋白的活性位點(diǎn)，因?yàn)樵谙嗤奈稽c(diǎn)用絲氨酸替換后毒素蛋白仍然保持生物學(xué)活性七由此可見，要想獲得更加有效的e毒素位點(diǎn)突變體作為候選疫苗，必須更加全面研究e毒素分子的結(jié)構(gòu)和功能。4結(jié)語針對產(chǎn)氣莢膜梭菌e毒素在人類和動物上潛在的危害，以及世界范圍內(nèi)生物恐怖襲擊的威脅促使科學(xué)家們加快對該毒素的疫苗研制?？茖W(xué)的疫苗研制應(yīng)從以下兩個方面去研究：第一，發(fā)展重組、減毒（或完

12、全無毒）的疫苗。雖然e毒素的類毒素疫苗在動物上具有保護(hù)作用，但是出于安全性考慮這種疫苗不太可能適用于人類。因此將來的疫苗研究必須基于對毒素結(jié)構(gòu)和分子功能的完全理解。第二，必須重視研究毒素與呼吸道和胃腸道表面的相互作用關(guān)系。因?yàn)楫a(chǎn)氣莢膜梭菌e毒素有可能作為恐怖襲擊的生物武器以氣溶膠或食品的方式散布。毒素分子基本上是通過以上兩種方式引起機(jī)體發(fā)病，而目前對這兩方面研究的還不是很清楚，這主要表現(xiàn)為:與毒素分子結(jié)合的細(xì)胞表面受體研究；毒素與黏膜表面細(xì)胞的相互作用；黏膜免疫在防止毒素吸收中的作用。相信隨著對上述兩個方面的研究，在不久的將來一定能研制出針對各種毒素的安全疫苗，從而造福于人類和動物。參考文獻(xiàn)：

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