蛋白提取方法

1、1 材料和方法 1.1 材料 1.1.1 組織和細(xì)胞的來(lái)源： 1.1.2 儀器設(shè)備 機(jī)械組織勻漿器 低溫高速離心機(jī) (40,000 g) 超速離心機(jī) 超生細(xì)胞裂開(kāi)儀 超純水裝置 1.1.3 試劑 三氯醋酸 (TCA) 丙酮 二硫蘇糖醇 (DTT) 尿素 CHAPS PMSF EDTA 乙醇 磷酸 考馬斯亮藍(lán)R350 抑肽素A 亮肽素 試劑純度均應(yīng)是分析純或以上。1.1.4 溶液配制 (1) PBS： NaCl 8 g, KCl 0.2 g, Na2HPO4 1.44 g, KH2PO4，溶于800 ml水中，用HCl調(diào)pH至7.4，用純水定容至1 L； (2) EDTA 儲(chǔ)存液： 18.61

2、g Na2EDTA2H2O，溶于70 ml純水中，用10 mol/L NaOH調(diào)整pH值至8.0 (約需2 g NaOH顆粒)，定容為100 ml?？筛邏簻缇蠓盅b備用； (3) 亮肽素儲(chǔ)存液 (50 g/ml，100) 10 mg/ml溶于水，-75保存；使用時(shí)配成50 g/ml儲(chǔ)液，-20保存； (4) 抑肽素儲(chǔ)存液 (70 g/ml，100) 1 mg/ml溶于甲醇，-75保存；使用時(shí)配成70 g/ml儲(chǔ)液，-20保存； (5) PMSF儲(chǔ)存液 (10 mM, 100): 17.4 mg PMSF，溶于1ml異丙醇中，-20 保存。 DTT 儲(chǔ)存液 (1 M): 0.31 g DTT溶于

3、2 ml H2O中，-20 保存 (DTT或含有DTT的溶液不能進(jìn)行高壓處理，可過(guò)濾除菌)。 (7) 裂解液: Lysis buffer A (9 M urea, 4% w/v CHAPS, 1% w/v DTT, 0.5% CA and a cocktail of protease inhibitors)Lysis buffer B(7 M urea, 2 M thiourea, 4% w/v CHAPS, 1% w/v DTT, 0.5% CA and a cocktail of protease inhibitors) Lysis buffer C 40 mM Tris-base (pH

4、 9.5) in ultrapure H2OLysis buffer D(8 M urea, 4% CHAPS, 40 mM Tris(base), 40 ml)Lysis buffer E (5 M urea, 2 M thiourea, 2% SB 3-10, 2% CHAPS, 1% w/v DTT, 0.5% CA and a cocktail of protease inhibitors)Lysis buffer F100 L SDS sample solution (1% w/v SDS, 0.375 M Tris-HCl, pH 8.8, 50 mM DTT, 25% v/v g

5、lycerol)CA、蛋白酶抑制劑混合物和DTT在臨用前加入。蛋白酶抑制劑混合物3成分終濃度蛋白酶抑制劑混合物PMSF35 g/ml or 1 mMEDTA0.3 mg/ml (1 mM) 抑肽素0.7 g/ml亮肽素0.5 g/ml1.2 方法 1.1.1組織蛋白提取方法1.2.1.1三氯醋酸/丙酮沉淀法1 (1)冰上取材，稱(chēng)濕重，置液氮中凍存或直接進(jìn)行下一步； (2)在液氮中研碎樣品或使用機(jī)械勻漿器磨碎組織； (3)將粉末懸浮于含DTT(0.2%w/v)的10%三氯醋酸（w/v）的丙酮溶液中； (4)蛋白20沉淀過(guò)夜； (5)35000g(6)離心30min； 將沉淀重懸于含0.2%DTT

6、的預(yù)冷丙酮中； (7)-20放置1h； 35000g(6)離心30min； (9)在通風(fēng)櫥中讓丙酮充分揮發(fā)，得到干燥的沉淀； (10)在裂解液中重新溶解沉淀（50-100mg組織需要1ml裂解液）； (11)15,40000g，離心1hr； (12)用Bradford法2測(cè)定上清的蛋白濃度，分裝后置75保存。 1.2.1.2超速離心法 (1)取材； (2)用研缽在液氮冷凍條件下將樣品研成粉末，每1g樣品加入0.5ml裂解液，使用組織勻漿器勻漿30s； (3)組織懸液15，10000g離心10min； (4)上清液4，150000g超速離心45min； (5)當(dāng)心避開(kāi)上層漂移的脂質(zhì)層，吸取離心上

7、清640,000g再次離心50min； 取離心上清。Bradford法定量，分裝后置75保存。 1.2.2培育細(xì)胞蛋白提取 1.2.2.1循環(huán)凍融法 (1)吸出培育液棄去，0.01mol/LPBS洗一次； (2)加入PBS，用橡膠刮收集細(xì)胞于10ml離心管中； (3)500g，離心5min； (4)棄上清，PBS洗三次（室溫,500g，5min）， (5)在離心管中加入1mlPBS，重懸細(xì)胞，用1ml微量加液器移入Eppendorf管中； 執(zhí)行Biofuge存儲(chǔ)程序8，500g5min離心； (7)用200l微量加液器吸出PBS，棄去； 吸干殘留的PBS，估量樣品體積，加入5倍體積裂解液，巴氏

8、滴管混勻，液氮中反復(fù)凍融三次(每次置液氮中3s，室溫溶化)，DTT在第一次凍融后加入； (9)執(zhí)行Biofuge存儲(chǔ)程序6，15，40000g，離心1hr(Biofuge)； (10)上清Bradford法定量，沉淀-75保存?zhèn)溆谩?1.2.2.2超聲裂開(kāi)法 (1)取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，吸出培育液棄去，0.01mol/LPBS洗一次； (2)加入PBS，用橡膠刮收集細(xì)胞于10ml離心管中； (3)室溫，500g，離心5min； (4)棄上清，PBS洗3次（室溫,500g，5min）； (5)在離心管中加入1mlPBS，重懸細(xì)胞，用1ml微量加液器移入Eppendorf管中，500g離心5min；

9、 吸干殘留的PBS，估量樣品體積，加入5倍體積裂解液，混勻，移入1.5mlEppendorf管中，冰浴中以最大功率超聲裂開(kāi)細(xì)胞（310s）； (7)15,40000g，離心1hr(Biofuge)； 上清Bradford法定量，沉淀-75保存?zhèn)溆谩?2結(jié)果和爭(zhēng)辯 蛋白質(zhì)提取的基本步驟包括清洗組織或細(xì)胞、裂解細(xì)胞、離心除去膜組分等獲得溶解的蛋白質(zhì)上清。 我們裂開(kāi)細(xì)胞接受循環(huán)凍融法和超聲波法；裂開(kāi)組織接受液氮研磨法和機(jī)械勻漿法。循環(huán)凍融法操作簡(jiǎn)便，比較適合提取培育細(xì)胞的穩(wěn)定蛋白，我們后期試驗(yàn)對(duì)培育細(xì)胞主要實(shí)行這種裂開(kāi)方式。使用超聲裂開(kāi)必需留意的是把握強(qiáng)度在肯定限度，即剛好低于溶液產(chǎn)生泡沫的水平。由

10、于產(chǎn)生泡沫會(huì)導(dǎo)致蛋白質(zhì)變性，同時(shí)要留意散熱。勻漿是機(jī)體軟組織裂開(kāi)最常用的方法之一。由于勻漿過(guò)程中蛋白質(zhì)被蛋白酶降解的可能性較小，所以勻漿是簡(jiǎn)便、快速和風(fēng)險(xiǎn)小的組織裂開(kāi)方法，我們?cè)囼?yàn)室在裂開(kāi)腦和脊髓組織時(shí)常用此法；由于神經(jīng)組織比較松軟，液氮研磨法也很適合，本試驗(yàn)中我們使用了這一方法裂開(kāi)大鼠脊髓組織，中樞神經(jīng)組織由于富含脂類(lèi)，沉淀法和高速離心法可以使蛋白和脂類(lèi)干擾物質(zhì)有效分別，但沉淀法的缺點(diǎn)是再溶解時(shí)蛋白損失嚴(yán)峻。高速離心的缺點(diǎn)是需要樣品量大，如BeckmanL7-65超速離心機(jī)的離心管容量為8ml，不適用小量樣品的制備。 在眾多的裂解液配方中，我們主要接受9M尿素,4%w/vCHAPS,1%w/vDTT,0.5%兩性電解質(zhì)加蛋白酶抑制劑混合物，緣由是這一配方經(jīng)長(zhǎng)期使用很穩(wěn)定，裂解效率也較高，格外適合小量細(xì)胞蛋白提取要求。針