蛋白提取方法

1、1 材料和方法 1.1 材料 1.1.1 組織和細胞的來源： 1.1.2 儀器設備 機械組織勻漿器 低溫高速離心機 (40,000 g) 超速離心機 超生細胞裂開儀 超純水裝置 1.1.3 試劑 三氯醋酸 (TCA) 丙酮 二硫蘇糖醇 (DTT) 尿素 CHAPS PMSF EDTA 乙醇 磷酸 考馬斯亮藍R350 抑肽素A 亮肽素 試劑純度均應是分析純或以上。1.1.4 溶液配制 (1) PBS： NaCl 8 g, KCl 0.2 g, Na2HPO4 1.44 g, KH2PO4，溶于800 ml水中，用HCl調pH至7.4，用純水定容至1 L； (2) EDTA 儲存液： 18.61

2、g Na2EDTA2H2O，溶于70 ml純水中，用10 mol/L NaOH調整pH值至8.0 (約需2 g NaOH顆粒)，定容為100 ml?？筛邏簻缇蠓盅b備用； (3) 亮肽素儲存液 (50 g/ml，100) 10 mg/ml溶于水，-75保存；使用時配成50 g/ml儲液，-20保存； (4) 抑肽素儲存液 (70 g/ml，100) 1 mg/ml溶于甲醇，-75保存；使用時配成70 g/ml儲液，-20保存； (5) PMSF儲存液 (10 mM, 100): 17.4 mg PMSF，溶于1ml異丙醇中，-20 保存。 DTT 儲存液 (1 M): 0.31 g DTT溶于

3、2 ml H2O中，-20 保存 (DTT或含有DTT的溶液不能進行高壓處理，可過濾除菌)。 (7) 裂解液: Lysis buffer A (9 M urea, 4% w/v CHAPS, 1% w/v DTT, 0.5% CA and a cocktail of protease inhibitors)Lysis buffer B(7 M urea, 2 M thiourea, 4% w/v CHAPS, 1% w/v DTT, 0.5% CA and a cocktail of protease inhibitors) Lysis buffer C 40 mM Tris-base (pH

4、 9.5) in ultrapure H2OLysis buffer D(8 M urea, 4% CHAPS, 40 mM Tris(base), 40 ml)Lysis buffer E (5 M urea, 2 M thiourea, 2% SB 3-10, 2% CHAPS, 1% w/v DTT, 0.5% CA and a cocktail of protease inhibitors)Lysis buffer F100 L SDS sample solution (1% w/v SDS, 0.375 M Tris-HCl, pH 8.8, 50 mM DTT, 25% v/v g

5、lycerol)CA、蛋白酶抑制劑混合物和DTT在臨用前加入。蛋白酶抑制劑混合物3成分終濃度蛋白酶抑制劑混合物PMSF35 g/ml or 1 mMEDTA0.3 mg/ml (1 mM) 抑肽素0.7 g/ml亮肽素0.5 g/ml1.2 方法 1.1.1組織蛋白提取方法1.2.1.1三氯醋酸/丙酮沉淀法1 (1)冰上取材，稱濕重，置液氮中凍存或直接進行下一步； (2)在液氮中研碎樣品或使用機械勻漿器磨碎組織； (3)將粉末懸浮于含DTT(0.2%w/v)的10%三氯醋酸（w/v）的丙酮溶液中； (4)蛋白20沉淀過夜； (5)35000g(6)離心30min； 將沉淀重懸于含0.2%DTT

6、的預冷丙酮中； (7)-20放置1h； 35000g(6)離心30min； (9)在通風櫥中讓丙酮充分揮發(fā)，得到干燥的沉淀； (10)在裂解液中重新溶解沉淀（50-100mg組織需要1ml裂解液）； (11)15,40000g，離心1hr； (12)用Bradford法2測定上清的蛋白濃度，分裝后置75保存。 1.2.1.2超速離心法 (1)取材； (2)用研缽在液氮冷凍條件下將樣品研成粉末，每1g樣品加入0.5ml裂解液，使用組織勻漿器勻漿30s； (3)組織懸液15，10000g離心10min； (4)上清液4，150000g超速離心45min； (5)當心避開上層漂移的脂質層，吸取離心上

7、清640,000g再次離心50min； 取離心上清。Bradford法定量，分裝后置75保存。 1.2.2培育細胞蛋白提取 1.2.2.1循環(huán)凍融法 (1)吸出培育液棄去，0.01mol/LPBS洗一次； (2)加入PBS，用橡膠刮收集細胞于10ml離心管中； (3)500g，離心5min； (4)棄上清，PBS洗三次（室溫,500g，5min）， (5)在離心管中加入1mlPBS，重懸細胞，用1ml微量加液器移入Eppendorf管中； 執(zhí)行Biofuge存儲程序8，500g5min離心； (7)用200l微量加液器吸出PBS，棄去； 吸干殘留的PBS，估量樣品體積，加入5倍體積裂解液，巴氏

8、滴管混勻，液氮中反復凍融三次(每次置液氮中3s，室溫溶化)，DTT在第一次凍融后加入； (9)執(zhí)行Biofuge存儲程序6，15，40000g，離心1hr(Biofuge)； (10)上清Bradford法定量，沉淀-75保存?zhèn)溆谩?1.2.2.2超聲裂開法 (1)取對數生長期的細胞，吸出培育液棄去，0.01mol/LPBS洗一次； (2)加入PBS，用橡膠刮收集細胞于10ml離心管中； (3)室溫，500g，離心5min； (4)棄上清，PBS洗3次（室溫,500g，5min）； (5)在離心管中加入1mlPBS，重懸細胞，用1ml微量加液器移入Eppendorf管中，500g離心5min；

9、 吸干殘留的PBS，估量樣品體積，加入5倍體積裂解液，混勻，移入1.5mlEppendorf管中，冰浴中以最大功率超聲裂開細胞（310s）； (7)15,40000g，離心1hr(Biofuge)； 上清Bradford法定量，沉淀-75保存?zhèn)溆谩?2結果和爭辯 蛋白質提取的基本步驟包括清洗組織或細胞、裂解細胞、離心除去膜組分等獲得溶解的蛋白質上清。 我們裂開細胞接受循環(huán)凍融法和超聲波法；裂開組織接受液氮研磨法和機械勻漿法。循環(huán)凍融法操作簡便，比較適合提取培育細胞的穩(wěn)定蛋白，我們后期試驗對培育細胞主要實行這種裂開方式。使用超聲裂開必需留意的是把握強度在肯定限度，即剛好低于溶液產生泡沫的水平。由

10、于產生泡沫會導致蛋白質變性，同時要留意散熱。勻漿是機體軟組織裂開最常用的方法之一。由于勻漿過程中蛋白質被蛋白酶降解的可能性較小，所以勻漿是簡便、快速和風險小的組織裂開方法，我們試驗室在裂開腦和脊髓組織時常用此法；由于神經組織比較松軟，液氮研磨法也很適合，本試驗中我們使用了這一方法裂開大鼠脊髓組織，中樞神經組織由于富含脂類，沉淀法和高速離心法可以使蛋白和脂類干擾物質有效分別，但沉淀法的缺點是再溶解時蛋白損失嚴峻。高速離心的缺點是需要樣品量大，如BeckmanL7-65超速離心機的離心管容量為8ml，不適用小量樣品的制備。 在眾多的裂解液配方中，我們主要接受9M尿素,4%w/vCHAPS,1%w/vDTT,0.5%兩性電解質加蛋白酶抑制劑混合物，緣由是這一配方經長期使用很穩(wěn)定，裂解效率也較高，格外適合小量細胞蛋白提取要求。針