抗原抗體反應(yīng)及應(yīng)用

1、第七章 抗原抗體反應(yīng)及應(yīng)用不論天然的還是人工合成的分子，只要能被機(jī)體的免疫系統(tǒng)識(shí)別的都可以誘導(dǎo)機(jī)體的免疫應(yīng)答，產(chǎn)生相應(yīng)的抗體。大多數(shù)抗體和抗原本身是既有免疫原性(誘發(fā)產(chǎn)生特異抗體)，又有反應(yīng)原性(與特異的抗體相結(jié)合)?？乖c抗體的特異性反應(yīng)不僅可以在體內(nèi)進(jìn)行，而且可以在體外進(jìn)行。一切利用血清學(xué)技術(shù)方法所進(jìn)行的各種測(cè)試都是基于這一根本的特性。抗體反應(yīng)技術(shù)的應(yīng)用之廣泛已經(jīng)遠(yuǎn)遠(yuǎn)超出了免疫學(xué)、醫(yī)學(xué)、甚至生命科學(xué)的范圍，成為類微量，靈敏，快速的檢測(cè)分析方法。本章著重介紹抗體制備，抗體抗原反應(yīng)原理及技術(shù)方法的應(yīng)用。第一節(jié)抗體的制備 環(huán)境中的大部分生物(包括病原生物)及其產(chǎn)物分子和一些化合物對(duì)哺乳動(dòng)物的免疫

2、系統(tǒng)而言是外源抗原，這些抗原能通過侵染或其他的途徑刺激免疫系統(tǒng)，產(chǎn)生以抗體為主的體液免疫應(yīng)答。同樣用抗原人工免疫實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，可以獲得含有特異性抗體的血清，稱為抗血清(antiserum)，因血清中抗體是多個(gè)抗原決定簇刺激不同B細(xì)胞克隆而產(chǎn)生的抗體，所以稱多克隆抗體(polyclonal antibody)。一個(gè)B細(xì)胞克隆所分泌的抗體即為單克隆抗體。用免疫動(dòng)物的B細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞融合，在體外可以分離出許多單個(gè)B細(xì)胞克隆，以此方法可制備單克隆抗體(monoclonal antibody)。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，已經(jīng)可以用抗體基因文庫(kù)(antibody combinatorial library)

3、篩選制備單克隆抗體。應(yīng)用基因工程技術(shù)，根據(jù)需要對(duì)抗體進(jìn)行改造，獲得基因工程抗體(engineering antibody)，以及催化性抗體(catalytic antibody 或abozyme)等的全新的抗體。 一、抗血清的制備 1免疫動(dòng)物 (1)抗原：免疫動(dòng)物是制備抗血清的第步。免疫所用的抗原可用病毒、細(xì)菌或者其他蛋白質(zhì)抗原，如果使用半抗原如小分子激素等，必須與大分子載體連接，連接劑見表71?？乖挠昧恳暱乖N類及動(dòng)物而異，次注射小鼠可以少至幾個(gè)微克，免、羊甚至更大的動(dòng)物每次注射的量就相應(yīng)增加，從幾百g次至幾mg次。2)佐劑及乳化：佐劑可以幫助抗原在注射部位緩慢釋放，以增加免疫刺激的效果。

4、佐劑有完全和不完全佐劑之分。完全佐劑加有滅活的分枝桿菌(如卡介苗)或棒狀桿菌。福氏佐劑可從試劑公司購(gòu)買，也可用羊毛脂和石蠟油按1：24混合自行制備。佐劑與抗原按1：1的比例混合乳化為均勻的乳液，放置后不會(huì)發(fā)生油水分離。 (3)免疫動(dòng)物：常用于制備抗血清的動(dòng)物打豚鼠、家免、小鼠、大鼠等，如果大量生產(chǎn)可用動(dòng)物羊、馬等，動(dòng)物接受免疫的乳液量小鼠為1020 mL，家兔為24mL?？乖庖邉?dòng)物的途徑取決于動(dòng)物種類、抗原特性和是否使用佐劑。腹腔注射(ip)，肌肉注射(im)，皮內(nèi)注射(id)和皮下注射(sc)適合于任何抗原，這些途徑主要刺激局部淋巴結(jié)發(fā)生免疫應(yīng)答，初次免疫和免疫加強(qiáng)注射均可使用。靜脈注射(

5、i.v.)則只適合于可溶性抗原及分散的單細(xì)胞懸液，且不能使用佐劑，其誘發(fā)的免疫應(yīng)答主要發(fā)生在脾臟。此外，在單克隆抗體制備時(shí)，亦可用脾臟直接注射或體外免疫方法，尤其對(duì)微量抗原比較實(shí)用。體外免疫方法也常用于人源單克隆抗體的制備。體外免疫時(shí)將脾細(xì)胞或外周血淋巴細(xì)胞(包括B細(xì)胞，T細(xì)胞及抗原遞呈細(xì)胞)與抗原一起作體外培養(yǎng)，然后再與骨髓瘤細(xì)胞融合。初次免疫后要經(jīng)過23次以上的免疫加強(qiáng)以保證能形成較高水平的IgC抗體。兩次免疫注射之間的時(shí)間間隔，一般34周比較適合大部分動(dòng)物，小動(dòng)物可間隔1014d，大動(dòng)物則在2月左右。在免疫加強(qiáng)最后一次注射后的一周內(nèi)采集抗血清，可獲得高水平的抗體。 2抗血清的純化與保存

6、（1）采血：加強(qiáng)免疫的動(dòng)物23次后，可通過耳靜脈或眼球(小鼠)采血，進(jìn)行抗血清效價(jià)測(cè)定。當(dāng)效價(jià)達(dá)到理想的高度后，可以采血。采血方式可以從心臟直接取血，也可通過動(dòng)脈放血。待血液凝固后用針筒或吸管吸取血清。 (2)抗血清的純化與保存：除抗體外血清中含有多種其他蛋白成分。為了避免這些蛋白質(zhì)干擾抗體(免疫球蛋白)標(biāo)記反應(yīng)和抗原抗體反應(yīng)，抗血清可經(jīng)過純化以獲得單一的機(jī)體(常為IgG)組分。常用的純化IgG的方法為飽和硫酸胺鹽析和層析法。蛋白質(zhì)在不同的鹽濃度的溶液中，其溶解度不一樣，鹽離子干擾蛋白質(zhì)和水分子間氫鍵形成，因?yàn)樗}結(jié)合比水蛋白質(zhì)結(jié)合更穩(wěn)定，蛋白質(zhì)即可從溶液中沉淀出來。蛋白質(zhì)分子越大，沉淀時(shí)所需

7、鹽離子濃度越低。免疫球蛋白(Mr 1.5×105)比血清中主要蛋白質(zhì)白蛋白(M r 6.7×104)的分子大得多，抗體在3050飽和度的硫酸鹽中析出，而白蛋白需在7080飽和度才析出，因此常用33飽和度的硫酸胺純化血清中的IgG。鹽析時(shí)為了減少抗體變性，需在4進(jìn)行，同時(shí)用pH8.0緩沖液稀釋抗血清，以減少蛋白濃度過高而發(fā)生共沉淀。銨鹽的溶解度不隨溫度變化而明顯改變，0和25僅差3，而鈉鹽則相差5倍，因此常在低溫沉淀時(shí)用銨鹽，室溫沉淀用鈉鹽。銨鹽對(duì)抗體的標(biāo)記反應(yīng)(如FITC和biotin標(biāo)記時(shí))有一定的干擾作用。 鹽析法只能部分純化抗體，更高純度的抗體制劑可用層析法制備。 I

8、gM五聚體相對(duì)分子質(zhì)量達(dá)9.7×105，比血清中任何其他蛋白都大，用分子篩層析很容易將其純化。IgG在PH 80時(shí)帶負(fù)電荷，能與DEAE纖維素上的陽(yáng)離子結(jié)合，因此可用離子交換層析來純化IgG。IgG純化最常用的方法為親和層析。IgG與葡萄球菌A蛋白和鏈球菌G蛋白具合高度的親和性，可用這兩種蛋白質(zhì)交聯(lián)親和層析柱將IgG純化。大部分IgG與蛋白A結(jié)合PH為89，洗脫P(yáng)H為24；而與蛋白G的結(jié)合PH為57，洗脫P(yáng)H為910。C蛋白更適合于IgG的純化，不但反應(yīng)條件為溫和的弱酸性或弱堿性，并且與IgG的結(jié)合力高于A蛋白。G蛋自能與大部分動(dòng)物種類的IgG結(jié)合，而A蛋白對(duì)小鼠IgG1、大鼠IgG

9、2b、人IgG3、馬和綿羊IgG結(jié)合力弱或不能結(jié)合G蛋白和A蛋白均不能與雞IgG結(jié)合。 抗血清或純化的抗體在低溫保存可維持活性數(shù)年，反復(fù)凍融使抗體很快失活，被細(xì)菌或霉菌污染的抗血清或IgG制品也易失去活性。稀釋的抗血清加入防腐劑疊氮化鈉和保護(hù)劑如BSA等可于4保存。長(zhǎng)期保存常用等量甘油于20以下冷藏。也可置于 50飽和硫酸銨中4保存，還可以冷凍干燥保存。 3抗血清的特性鑒定 根據(jù)不同目的制備的抗血清，對(duì)其中所含抗體的濃度，特異性及免疫球蛋白種類的要求也不一樣。為了獲得質(zhì)量和數(shù)量上合符要求的抗血清，在收集動(dòng)物血清前必須對(duì)免疫效果進(jìn)行檢測(cè)，對(duì)收獲后的抗血清也必須對(duì)些參數(shù)進(jìn)行分析，如效價(jià)、親和力及交

10、叉反應(yīng)等。 根據(jù)不同的抗原性質(zhì)選用合適的檢測(cè)方法。最常用的為免疫沉淀，ELISA，放射免疫等。 效價(jià)又稱滴度(titer)，是常用于表達(dá)抗血清中特異性抗體相對(duì)含量的個(gè)半定量指標(biāo)，即在給定的條件下，結(jié)合定量抗原的抗血清的稀釋度?？寡褰?jīng)一系列稀釋后(如倍比稀釋)與定量的抗原反應(yīng)，以能檢測(cè)抗血清最大稀釋倍數(shù)即為該抗血清的效價(jià)。不同的檢測(cè)方法測(cè)定同一種抗血清的效價(jià)，靈敏度不一樣，抗血清的效價(jià)也不一樣，如沉淀反應(yīng)(瓊脂雙擴(kuò)散)與ELISA二者的效價(jià)相差甚大，后者遠(yuǎn)高于前者。放射免疫分析(RIA)常用于標(biāo)記小分子抗原來檢測(cè)抗血清的效價(jià)。 親和力(affinity)表示抗血清與相應(yīng)抗原的結(jié)合強(qiáng)度，是描述抗

11、體持異性的重要指標(biāo)，常用親和常數(shù)K表示。親和常數(shù)K與抗原抗體反應(yīng)的平衡常數(shù)有關(guān)： K+AgAb AgAb KAgAb K+ K= K=AgAb K式中K+為結(jié)合速度常數(shù)，K為解離速度常數(shù)。親和常數(shù)K的測(cè)定見第二節(jié) 抗體特異性與交叉反應(yīng)：抗體是特異的。只與相應(yīng)抗原反應(yīng)。實(shí)際制備的抗體卻常有非特異性反應(yīng)，這是因?yàn)榭乖患冊(cè)斐傻摹６嘟M分抗原之間存在共同的抗原決定簇，或者兩個(gè)抗原決定簇結(jié)構(gòu)類似能與同一抗體結(jié)合，均可出現(xiàn)抗體與異源抗原的交叉反應(yīng)。用瓊脂雙擴(kuò)散能簡(jiǎn)便直觀地反映不同抗原與同一抗血清，或不同抗血清與同一抗原的交叉反應(yīng)。 二、單克隆抗體的制備 1制備原理 單克隆抗體(MAb)與抗血清(又稱多克隆

12、抗體，PAb)最主要的區(qū)別是MAb為單一種B細(xì)胞克隆所產(chǎn)生的一種均一的免疫球蛋白分子。所以MAb是B細(xì)胞克隆的標(biāo)志，是一種獨(dú)特型的抗體，它的特異性是針對(duì)一個(gè)抗原決定簇的。制備單克隆抗體不能用化學(xué)分離的方法從多克隆抗體中去分離純化得到它，而是用分離產(chǎn)生抗體的B細(xì)胞克隆的方法得到它。為了使B細(xì)胞克隆能在體外人工培養(yǎng)下長(zhǎng)期存活并產(chǎn)生完全均一的MAb，GKÖhler合Milstein于1975年創(chuàng)立了雜交瘤方法。所以制備單克隆抗體的技術(shù)又稱雜交瘤技術(shù)(hybredoma technique)。 雜交瘤技術(shù)的基本原理是用分泌抗體但不能長(zhǎng)期培養(yǎng)的B細(xì)胞與能在體外長(zhǎng)期培養(yǎng)并可低溫保存的腫瘤細(xì)胞進(jìn)行

13、雜交。篩選得到的雜交瘤細(xì)胞應(yīng)該是既能分泌抗體又有瘤細(xì)胞的特性，可長(zhǎng)期傳代培養(yǎng)，又可在液氮中保存的細(xì)胞。把這些細(xì)胞單克隆化，用單克隆化的雜交瘤細(xì)胞進(jìn)行單克隆抗體的生產(chǎn)（圖71）。 2B細(xì)胞與瘤細(xì)胞的來源及雜交瘤選擇原理 最常用的單克隆抗體是小鼠的單抗，此外也有大鼠的和人源的單抗。人源單抗制備比較復(fù)雜。小鼠單抗的制備通常是使用Balbc小鼠的B細(xì)胞和它的骨髓瘤細(xì)胞。大鼠的單抗制備通常用Louc大鼠及其骨髓瘤和Y3AO大鼠及其骨髓瘤細(xì)胞(表72)。B細(xì)胞是從免疫動(dòng)物的脾臟中分離出來的。動(dòng)物免疫方法與抗血清制備相同，只是在制備脾臟前3d必須進(jìn)行一次靜脈加強(qiáng)注射以保證得到的B細(xì)胞有旺盛的分泌抗體的活性。

14、骨髓瘤細(xì)胞有許多細(xì)胞株是經(jīng)過誘變和篩選得到的缺陷型。篩選的標(biāo)準(zhǔn)是瘤細(xì)胞本身不產(chǎn)生抗體或者產(chǎn)生抗體的某種鏈，但不能分泌；是次黃嘌呤鳥嘌呤核苷酸轉(zhuǎn)移酶(HGPRT)和胸腺嘧啶激酶(TK)的缺陷型。因?yàn)檫@種缺陷型的瘤細(xì)胞正常的核酸合成途徑被氨基喋吟(aminopterin)阻斷后，由于缺失這些酶，即使補(bǔ)充它的底物次黃嘌呤(H)和胸腺嘧啶(T)，核酸合成的旁路也不能起到救援的作用，結(jié)果導(dǎo)致瘤細(xì)胞死亡(圖72)。而雜交瘤細(xì)胞因帶有B細(xì)胞的全套基因，在HAT存在的條件下借助于HGPRT和TK的作用通過替代的核酸合成途徑能正常合成DNA和RNA。所以雜交瘤能正常地生長(zhǎng)繁殖而被選擇出來。未被融合的游離的B細(xì)胞

15、只能存活3d而后自行死亡。這就是用HAT培養(yǎng)基進(jìn)行選擇的原理。 3細(xì)胞雜交與選擇培養(yǎng) (1)融合：細(xì)胞雜交之前，要分別準(zhǔn)備好脾臟的B細(xì)胞懸液和小鼠骨髓瘤細(xì)胞(如SP20Agl4細(xì)胞株)。免疫后的小鼠脾臟在無菌條件下破碎，將B細(xì)胞懸浮在沒有血清的培養(yǎng)液中(通常使用RPMIl640商品配制)，并洗滌3次去掉小鼠的血清。SP20細(xì)胞是用加有10胎?；蛐∨Ｑ迮囵B(yǎng)的，每天更換新鮮培養(yǎng)液使成為對(duì)數(shù)分裂期生長(zhǎng)旺盛的細(xì)胞。細(xì)胞用RPMIl640洗滌23次，把兩種細(xì)胞合并在同試管中，用50的聚乙二醇(相對(duì)分子質(zhì)量為10001500)作為融合劑，在37條件下融合l2min。然后用1640培養(yǎng)液緩慢稀釋，然后除去

16、PEG，將細(xì)胞分散至HAT選擇培養(yǎng)板中。電融合方法也可用于單克隆抗體制備，雖融合率較高，但一次融合的細(xì)胞數(shù)少，且需專門設(shè)備，故限制了其廣泛使用。融合時(shí)脾細(xì)胞和骨髓瘤細(xì)胞的比例在5：110：1均可獲得滿意結(jié)果，每次融合細(xì)胞數(shù)量在107108較為合適。融合后的細(xì)胞在40或96孔板上的HAT培養(yǎng)液(RPMIl640含1020胎?；蛐∨Ｑ搴虷AT)中37，5CO2條件下培養(yǎng)。融合后的細(xì)胞懸液中只有脾細(xì)胞和骨髓瘤細(xì)胞形成的雜交瘤細(xì)胞能在HAT培養(yǎng)基中生長(zhǎng)，其他形式的融合細(xì)胞均不能生長(zhǎng)未融合的細(xì)胞也不能在HAT培養(yǎng)液中生存(表73)。 在融合后的細(xì)胞培養(yǎng)過程中，飼養(yǎng)細(xì)胞(feeder cell)有助于雜

17、交瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)。飼養(yǎng)細(xì)胞可用同種動(dòng)物的腹腔細(xì)胞或胸腹細(xì)胞。腹腔細(xì)胞中的吞噬細(xì)胞能清除死亡細(xì)胞碎片。使背景更為清潔“干凈”。同時(shí)飼養(yǎng)細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子或活性物質(zhì)有助于雜交瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)?，F(xiàn)有商品“雜交瘤細(xì)胞生長(zhǎng)因子”可用于替代飼養(yǎng)細(xì)胞。 (2)陽(yáng)性雜交瘤細(xì)胞的篩選與單克降化：雜交細(xì)胞經(jīng)約1014d培養(yǎng)后，形成可用的細(xì)胞集落(克隆)。經(jīng)過幾次更換培養(yǎng)液(HT培養(yǎng)液)后進(jìn)行抗體活性檢測(cè)。常用的篩選槍測(cè)方法是ELISA和凝集試驗(yàn)，前者常用于可溶性抗原，后者適用于細(xì)胞、細(xì)菌等表面抗原。此外，DotELISA、免疫印跡及免疫熒光試驗(yàn)均可用于雜交瘤細(xì)胞的篩選。 使許多細(xì)胞克隆混合生長(zhǎng)的細(xì)胞分離為單個(gè)的細(xì)胞克隆

18、的過程稱克隆化(colonization)最常用的單克隆化方法是有限稀釋法(limited dilution)，即將混合細(xì)胞經(jīng)稀釋后分裝于培養(yǎng)板上，使培養(yǎng)板的大部分孔中只出現(xiàn)一個(gè)細(xì)胞。為了確?？贵w分泌細(xì)胞來源于單個(gè)細(xì)胞，克隆化過程可重復(fù)進(jìn)行，稱為亞克隆化(subclonization)。除有限稀釋法外，熒光激活細(xì)胞分揀法(FACS)也用于雜交瘤細(xì)胞的克隆化過程。 4單克隆抗體的擴(kuò)大生產(chǎn) 產(chǎn)生特異性抗體的單克隆雜交瘤細(xì)胞株應(yīng)立即擴(kuò)大培養(yǎng)，以獲得足夠的細(xì)胞用于保存和生產(chǎn)可供應(yīng)用的抗體。生產(chǎn)大量單克隆抗體的方法目前常用的有3種：小鼠腹水制備，大瓶培養(yǎng)和中空纖維反應(yīng)器，前者多用于實(shí)驗(yàn)室制備，后二者適應(yīng)

19、于工廠化生產(chǎn)。 腹水制備：雜交骨髓瘤細(xì)胞在腹腔中定植，并產(chǎn)生大量腹水。選用與單克隆抗體制備所用相同的動(dòng)物品系或者含有相同基因的Fl代雜交品系。雜交F1代品系更適合于腹水制備，如果用異源動(dòng)物制備腹水時(shí)可選用無MHC限制性的裸鼠。用小鼠制備腹水時(shí)，先用礦物油或Pristane致敏，以抑制其免疫功能，利于腹水的形成。腹腔注射106107個(gè)雜交瘤細(xì)胞，經(jīng)過710 d后形成腹水。每只小鼠可獲得35mL腹水，每mL含IgG抗體可達(dá)510mg。腹水中含有較多的雜蛋白和非特異性IgG，并且含有許多蛋白酶，易使抗體失活，因此腹水收集后應(yīng)盡快純化，以防止降解。 大瓶培養(yǎng)：采用1000mL或更大的搖瓶培養(yǎng)。大瓶培養(yǎng)

20、上清體積大，但抗體濃度低，給抗體純化帶來很大困難，消耗人力和培養(yǎng)液，增加生產(chǎn)成本。 中空纖維反應(yīng)器：是比較經(jīng)濟(jì)的單克隆抗體生產(chǎn)方法。該裝置由具有半透膜性質(zhì)的成束的微孔纖維組成，雜交瘤細(xì)胞位于纖維外部的小量培養(yǎng)液中，培養(yǎng)液在纖維的微孔中循環(huán)，供給營(yíng)養(yǎng)和帶走廢物，抗體大分子和小分子化合物被隔開。高密度的雜交瘤細(xì)胞能在此系統(tǒng)中維持?jǐn)?shù)月，每天可產(chǎn)生數(shù)百毫克的抗體，抗體濃度高，體積小易于純化。 胎(小)牛血清一直是細(xì)胞培養(yǎng)所必須的，在單克隆抗體生產(chǎn)過程中培養(yǎng)液中的血清蛋白使抗體的純化增加了困難，近年開發(fā)的無血清培養(yǎng)技術(shù)已逐漸用于單克隆抗體的生產(chǎn)中。 5人單克隆抗體的制備 小鼠的單克隆抗體蛋白應(yīng)用于人體后

21、，作為抗原能引起人的免疫應(yīng)答，大大降低其生物活性，并可能導(dǎo)致變態(tài)反應(yīng)。因此人源單克隆抗體在臨床治療上有廣泛應(yīng)用前景，引起人們的普遍興趣。但是人單克隆抗體制備存在許多技術(shù)上和倫理上的障礙，如人雜交瘤細(xì)胞系不穩(wěn)定，有些抗原不能對(duì)人進(jìn)行人工免疫，人B細(xì)胞只能從外周血中分離而無法從脾臟取得等。盡管如此，一些人源單克隆抗體已經(jīng)獲得，技術(shù)上也在逐步完善起來。 人的瘤細(xì)胞株U266常用來與人外周血B細(xì)胞融合以獲得人源單克隆抗體。另一些淋巴母細(xì)胞抹(LCL)則來源于EB病毒轉(zhuǎn)化的淋巴細(xì)胞，如GMl500，W1L2和ARH77等也用于雜交瘤細(xì)胞的制備。這些細(xì)胞系表現(xiàn)ED病毒核抗原(EBNA)陽(yáng)性，且形成的雜交瘤

22、細(xì)胞抗體的分泌水平不高。 獲得人單克隆抗體的另一方法是用EBV直接轉(zhuǎn)化某些抗體分泌細(xì)胞，使之成為“不死”的細(xì)胞在體外培養(yǎng)。EBV感染人B細(xì)胞后，病毒基因插入人B細(xì)胞基因組中，有1的細(xì)胞轉(zhuǎn)化為“不死”的細(xì)胞。B細(xì)胞轉(zhuǎn)化可通過“病毒驅(qū)動(dòng)”和“細(xì)胞驅(qū)動(dòng)”兩種方法獲得。前者是將B細(xì)胞與分泌EBV的B958細(xì)胞系一同培養(yǎng)，后者則是與EBNA陽(yáng)性的LCL細(xì)胞一同培養(yǎng)?！凹?xì)胞驅(qū)動(dòng)”轉(zhuǎn)化的B細(xì)胞比較穩(wěn)定，抗體分泌能力也較強(qiáng)。 人淋巴母細(xì)胞系和人雜交瘤細(xì)胞較難獲得，人單克隆抗體也可以通過異源雜文的辦法制備，即將EBV轉(zhuǎn)化的B細(xì)胞與小鼠骨髓瘤細(xì)胞融合，將獲得的異源雜交瘤細(xì)胞再與免疫后的B細(xì)胞融合，得到人單克隆抗體

23、分泌細(xì)胞，不產(chǎn)生自身免疫球蛋白，EBVA也是陰性。 三、基因工程抗體的制備 1抗體的化學(xué)修飾 抗體Fc段用雙功能連接劑與熒光素，同位素，酶，發(fā)光化合物，稀土元素以及藥物，毒素等連接后，并不影響其Fab功能區(qū)與特異性抗原結(jié)合。根據(jù)交聯(lián)物的性質(zhì)不同，標(biāo)記的抗體可用作診斷試劑，也可作為藥物的定向載體，引導(dǎo)藥物或毒素到達(dá)抗原存在部位使藥物或使毒素發(fā)揮更有效的作用，即俗稱“生物導(dǎo)彈”。從而減少藥物、毒素、同位素、酶在腫瘤治療過程中引起嚴(yán)重的副作用，大大提高治療腫瘤的效果。 許多毒素如蓖麻毒素，白喉毒素，天花粉，紅豆毒素等均為蛋白質(zhì)或糖蛋白，可用雙功能劑與抗體相連；嗎啡，前列腺素，氨甲喋吟，磷酸酯酶C等含

24、有羧基能用碳二亞胺(EDC)，混合酸酐法與抗體的氨基形成酰胺鍵；同樣，含脂肪胺的藥物如慶大雷素，阿霉素在水溶性EDC的作用下與抗體的羧基連接；而含芳香胺的藥物則先在低溫下與亞硝酸作用形成重氮化合物，再與抗體分子上的酪氨酸或組氨酸殘基形成偶氮鍵?？傊ㄟ^抗體的化學(xué)修飾把抗體的特異性用到定向給藥和定位檢測(cè)上。 2抗體基因文庫(kù) 抗體基因文庫(kù)(antibody recombination library)是將不同的重鏈和輕鏈基因隨機(jī)組合，克隆到合適的表達(dá)載體中，在原核細(xì)胞表達(dá)不同的抗體，形成一個(gè)抗體庫(kù)，從這個(gè)抗體庫(kù)中，用抗原可以篩選到相應(yīng)的抗體基因(圖73)?？贵w基因來源于雜交瘤細(xì)胞或動(dòng)物B細(xì)胞(免疫

25、或未免疫)的DNA和mRNA 。用質(zhì)粒作為抗體文庫(kù)的載體，雖然也可能表達(dá)有活性的抗體分子或片段，但由線狀噬菌體表達(dá)更為方便有效。M13、fd、F1等噬菌體的外殼蛋白由5種蛋白組成：p、p、p、p和p。每種含量不一，其中p含量最多，每個(gè)噬菌體有2700個(gè)p亞基，其余4種蛋白僅5個(gè)拷貝。增加噬菌體外殼蛋白的長(zhǎng)度并不影響噬菌體的裝配，抗體以融合蛋白的形式表達(dá)于噬菌體表面。噬菌體表達(dá)質(zhì)粒常用的有fdCAT1、fdtetDOG1、PHEN1、pComb3和pComb3H等?？贵w融合蛋白構(gòu)建多用p和p，p拷貝數(shù)高，低親和力的抗體蛋白容易篩選出來。在噬菌體表達(dá)抗體時(shí)，常常不表達(dá)完整的抗體分子，（因?yàn)镃H2上

26、不能進(jìn)行糖基化）。根據(jù)不同的引物得到重鏈的VH或VHCH1區(qū)，輕鏈的VL或VLCL區(qū)。VL和VH兩個(gè)片段用一短肽作連接片段，形成單鏈可變區(qū)（singlechain fragment variable，scFv）；VHCH1和VLCL兩片段則形成Fab片段。另外，單獨(dú)的VH和VL也能結(jié)合抗原，如果二者形成同源或異源二聚體(dAb)，則穩(wěn)定性和親和性明顯提高(圖74)。此外在抗體片段DNA末端加上一些功能蛋白(如堿性磷酸酶和蛋白毒素)的基因，則表達(dá)的抗體就帶有一定生物活性功能片段，可用于檢測(cè)或治療。如果在抗體基因末端加上終止子(TAG)則表達(dá)的抗體片段是可溶性的，而不是結(jié)合在噬菌體表面。 用特異性

27、抗原免疫的動(dòng)物B細(xì)胞構(gòu)建抗體的噬菌體文庫(kù)，抗體親和性高，用與免疫抗原不同的抗原篩選得到的抗體親和性普遍較低。可用模擬天然體細(xì)胞突變的方法來提高親和力。如混雜重組法，即將己獲得的輕鏈或重鏈的V片段切下，再克隆至隨機(jī)的文庫(kù)中的V區(qū)構(gòu)成二級(jí)文庫(kù)，使H鏈和L鏈混雜，可以使抗體片段的親和性提高。利用PCR錯(cuò)配將隨機(jī)突變引人至抗體的抗原結(jié)合區(qū)，也能提高對(duì)抗原的親和力。先用低親和力的載體在噬菌體的P表達(dá)，篩選后、將抗體基因片段PCR擴(kuò)增轉(zhuǎn)至P上表達(dá)，可獲得高親和力的抗體片段。 抗體基因文庫(kù)有兩個(gè)優(yōu)點(diǎn)，一是從不適合進(jìn)行人工免疫的物種獲得單克隆抗體，如人源單克隆抗體；二是可快速方便獲得單克隆抗體。 3抗體基因的

28、改造 將鼠源抗體的V區(qū)基因與人源抗體C區(qū)基因重組，獲得的嵌合抗體(chimerical antibody)，可保留鼠抗體對(duì)抗原的高親和性，又減弱鼠源抗體對(duì)人的免疫原性，提高治療性抗體的效果。重組的嵌合抗體基因轉(zhuǎn)化骨髓瘤細(xì)胞或中國(guó)地鼠卵細(xì)胞(CH0)，可在其中表達(dá)。為了進(jìn)一步地消除鼠抗體V區(qū)框架區(qū)(FW)的異源性，可實(shí)行CDR移植(CDR grafting)，以獲得與鼠FW類似的人FW結(jié)構(gòu)的嵌合抗體。 噬菌體表達(dá)的抗體僅含V區(qū)(scFv)或Fab片段，缺乏Fc區(qū)，使抗體的穩(wěn)定性下降，半衰期縮短，與Fc受體結(jié)合功能也消失。因此在抗體功能片段的末端連接A蛋白、酶、細(xì)胞因子、CD4和毒素等分子，既可增

29、加抗體片段的穩(wěn)定性，又可發(fā)揮某些生物學(xué)活性功能。 用抗體基因工程方法獲得的抗體與效應(yīng)分子交聯(lián)物比用化學(xué)交聯(lián)法具有優(yōu)點(diǎn)：可以大量生產(chǎn)，不會(huì)因修飾作用影響抗體及效應(yīng)分子的活性，效應(yīng)分子還可根據(jù)需要進(jìn)行改造。 此外在抗體片段的末端連接一段特異的雙親性螺旋(amphiphilic helixes)結(jié)構(gòu)，如亮氨酸拉鏈結(jié)構(gòu)(leucine zipper)，可使單價(jià)的scFv或Fab片段在體內(nèi)或體外形成穩(wěn)定的雙分子聚合體，從而提高抗體片段的親和力。此法也可用于制備雙特異性抗體。 4基因工程抗體在真核細(xì)胞中的表達(dá) 噬菌體表達(dá)的抗體片段常常是在原核細(xì)胞(E.coli)中完成。原核系統(tǒng)表達(dá)抗體片段產(chǎn)量高，成本低，

30、快速易于操作。但抗體片段在原核表達(dá)系統(tǒng)中不能進(jìn)行CH2糖基化，從而影響抗體的活性。因此重組抗體基因片段可轉(zhuǎn)移至適合的骨髓瘤細(xì)胞系或哺乳動(dòng)物細(xì)胞系(如CHO)，甚至于植物細(xì)胞中表達(dá)，可以得到與淋巴細(xì)胞表達(dá)相同的抗體分子。免疫球蛋白IgA的重鏈和輕鏈及分泌片基因可以分別轉(zhuǎn)化不同的植株，將表達(dá)這些蛋白的植株進(jìn)行有性雜交，在雜交后代中可以裝配成完整的IgA雙分子。以植物作為生物反應(yīng)器進(jìn)行抗體的表達(dá)已有許多成功的研究報(bào)道，與動(dòng)物細(xì)胞相比更為經(jīng)濟(jì)，具有廣泛的應(yīng)用前景。 四、催化性抗體的制備 1抗體催化的原理 1986年，由PGschultz和RALerner分別領(lǐng)導(dǎo)的兩個(gè)小組同時(shí)證明抗體具有催化活性。針對(duì)

31、一個(gè)四面體帶電荷的磷酸酯半抗原產(chǎn)生的抗體，能有選擇性地催化相應(yīng)的碳酸脂和羧酸脂的水解反應(yīng)。他們將這種有催化活性的抗體稱為催化性抗體(catalytic antibody)，又稱抗體酶(abozyme)。催化抗體的作用取決于底物分子水解時(shí)的轉(zhuǎn)換態(tài)(transition state)(圖75)。轉(zhuǎn)換態(tài)的分子結(jié)構(gòu)是分子活化后的一種結(jié)構(gòu)狀態(tài)，處于轉(zhuǎn)換態(tài)的分子具有最高的活化能，分子表現(xiàn)極性。處于這種狀態(tài)的分子也是最不穩(wěn)定的，能與這種分子結(jié)合的酶或者抗體會(huì)使某些化學(xué)鍵發(fā)生斷裂(如酯鍵，碳鍵，胺鍵等)起到酶解作用?？梢娍贵w酶的作用與天然的蛋白質(zhì)酶非常相似?？贵w酶也表現(xiàn)出對(duì)底物的專一性，對(duì)立體結(jié)構(gòu)的專一性。在

32、飽和動(dòng)力學(xué)與競(jìng)爭(zhēng)性抑制方面都與常規(guī)酶相似。所以抗體酶的發(fā)現(xiàn)打破了只有常規(guī)酶才有的分子識(shí)別和加速催化反應(yīng)的傳統(tǒng)概念，為酶工程學(xué)開創(chuàng)了新的領(lǐng)域。 2抗體催化的化學(xué)反應(yīng) 由抗體催化的化學(xué)反應(yīng)特異性高于酶，但催化速率低于常規(guī)的酶，只有l(wèi)03106倍。但有一些未發(fā)現(xiàn)催化劑的反應(yīng)，如DielsAlder反應(yīng)也能被抗體催化。常規(guī)酶一般不能催化胺鍵水解，抗體酶能使胺鍵水解的速度增加25萬倍。訖今為止，已發(fā)現(xiàn)和證明的由抗體催化的化學(xué)反應(yīng)不下40種。 3催化性抗體的制備 抗體酶是抗原決定簇處于轉(zhuǎn)換態(tài)結(jié)構(gòu)的抗體。因?yàn)檗D(zhuǎn)換態(tài)分子極不穩(wěn)定無法制備抗體，所以催化性抗體的獲得主要是通過設(shè)計(jì)穩(wěn)定的轉(zhuǎn)換態(tài)的類似物作為半抗原，與

33、載體蛋白交聯(lián)后，免疫動(dòng)物，獲得針對(duì)半抗原的抗體，從中篩選具有催化活性的抗體。篩選催化性單克隆抗體所用的ELISA與篩選一般抗體的方法不完全一樣，應(yīng)根據(jù)催化反應(yīng)的特點(diǎn)而進(jìn)行適當(dāng)?shù)男薷?。?jīng)典的方法是先篩選出與底物或半抗原結(jié)合的抗體，然后從中再篩選出有催化活力的抗體，這種方法費(fèi)時(shí)費(fèi)力。利用催化性抗體對(duì)底物的催化活性，對(duì)底物進(jìn)行適當(dāng)修飾，使催化反應(yīng)的產(chǎn)物可直接表現(xiàn)抗體的催化活性，這樣可以簡(jiǎn)化檢測(cè)步驟。 轉(zhuǎn)換態(tài)類似物半抗原的設(shè)計(jì)，必須了解催化反應(yīng)的轉(zhuǎn)換態(tài)模型的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)。催化抗體的抗原結(jié)合位點(diǎn)上與轉(zhuǎn)換態(tài)互補(bǔ)的某些催化基團(tuán)的形成，能穩(wěn)定轉(zhuǎn)換態(tài)分子。此外有人把單克隆抗體分子用化學(xué)修飾方法引入一些活性基團(tuán)，提高

34、催化性抗體的催化與親和效率。應(yīng)用噬菌體抗體文庫(kù)也可以篩選催化性抗體，可省去制備轉(zhuǎn)換態(tài)類似物的復(fù)雜過程，直接用底物從文庫(kù)中篩選有催化活性的抗體片段。如用半抗原免疫后制備的文庫(kù)或文庫(kù)經(jīng)過多次混雜重組，則可以得到更高的親和力的催化性抗體?？躬?dú)特型抗體也用于催化性抗體的制備，用酶作為抗原免疫小鼠獲得能夠封閉酶活性位點(diǎn)的單克隆抗體，將這個(gè)抗體用蛋白酶除去Fc片段，用Fab免疫其他品系的小鼠或家兔，得到的抗體具有相應(yīng)的酶催化活性。 從理論上看，B細(xì)胞具有全套免疫球蛋白的多樣性的胚系基因，當(dāng)然也包括有催化作用的自身抗體在內(nèi)。然而1989年P(guān)aul W.首次報(bào)道了人體的一種能催化蛋白質(zhì)水解的免疫球蛋白。它是種

35、自身抗體，能水解血管活性腸肽(vasoactive intenstinal peptide，VIP)的Glnl6Met17鍵。用VIP作為抗原能得到有催化作用的單克隆抗體，也能催化Glnl6Met17鍵。大約有17的人有這種自身抗體酶，但患有氣喘的病人中該抗體與VIP的親和力比健康人高50倍。由于VIP是一種氣管松弛劑，因此有人認(rèn)為這種VIP自身抗體的長(zhǎng)期作用可能與氣喘的過敏應(yīng)答有一定關(guān)系。由此推測(cè)除了人工設(shè)計(jì)催化抗體以及發(fā)現(xiàn)的自身催化抗體外，用篩選單抗的方法，也有可能找到所需要的催化抗體。第二節(jié) 抗原抗體反應(yīng)原理 抗體能特異性地識(shí)別相應(yīng)的抗原，并與之結(jié)合。這種結(jié)合在體外也能發(fā)生，這種特性就是

36、許多免疫檢測(cè)方法的基礎(chǔ)?？乖c抗體相互作用是非共價(jià)的，可逆的，其特性符合許多化學(xué)反應(yīng)的基本原理。但因?yàn)榭贵w分子的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，以及抗原分子結(jié)構(gòu)的多樣性，使抗原抗體結(jié)合反應(yīng)表現(xiàn)出復(fù)雜性。 一、抗原抗體作用的熱力學(xué)與動(dòng)力學(xué) 1溶液中抗原抗體的化學(xué)平衡 抗體與抗原的結(jié)合是非共價(jià)結(jié)合，二者在結(jié)構(gòu)互補(bǔ)適應(yīng)的基礎(chǔ)上通過范德華力(van der Waals force)、靜電引力、氫鍵和疏水作用等次級(jí)鍵相互作用。因?yàn)榻Y(jié)合是可逆的，結(jié)合與解離的強(qiáng)度在定條件下取決于抗原與抗體的親和力。如果以S代表抗體結(jié)合位，即互補(bǔ)位(paratope)；以L代表抗原決定簇；以SL代表抗原與抗體的復(fù)合物，則抗原(Ag)與抗體(Ab)

37、在溶液中的反應(yīng)如下： K+ K+AgAb AgAb 即SL SL K KKSL/SLK+/ K 抗原抗體結(jié)合形成的復(fù)合物的濃度為SL，游離的抗體結(jié)合位的濃度為S，抗原決定簇的濃度為L(zhǎng)。在反應(yīng)早期復(fù)合物形成很快，一定時(shí)間后逐漸慢下來，直至復(fù)合物的形成與解離達(dá)到平衡(圖76)。此時(shí)抗原抗體復(fù)合物的濃度SL與游離抗原表位的濃度S和游離抗體結(jié)合位的濃度L之比K是平衡常數(shù)，又稱為內(nèi)在結(jié)合常數(shù)，或稱內(nèi)在親和力(intrinsic affinity)。K+和K分別為結(jié)合和解離反應(yīng)速度常數(shù)。 在恒定的條件下，如溫度、pH、離子強(qiáng)度等一定時(shí)，K是一個(gè)常數(shù)。改變抗原或抗體的濃度，復(fù)合物的濃度也相應(yīng)改變以達(dá)到新的平

38、衡，在一定范圍內(nèi)如果S與L增加2倍，則SL應(yīng)該增加4倍，但實(shí)際上會(huì)少于4倍，因?yàn)锳gAb復(fù)合物的濃度SL是抗原抗體的一部分。如果上述濃度都以摩爾濃度molL表示，則是K的單位為濃度的倒數(shù)(Lmol)。如抗體的K在1071012 Lmol為高親和力抗體，K低于107 Lmol為低親和力抗體。 如果以解離常數(shù)(K)描述抗體的親和力，比K更簡(jiǎn)單方便，Kd為K的倒數(shù)，即Kd1/K，單位為mol/L。Kd值越大親和力越小，Kd越小親和力越大。 2抗原抗體反應(yīng)的自由能變化 抗原抗體反應(yīng)的自由能改變與K相關(guān)：F0RTln K，KeF/RT，這里R摩爾氣體常數(shù)8.31J(mol·K)；T絕對(duì)溫度；l

39、n自然對(duì)數(shù)；e自然對(duì)數(shù)的底數(shù)；F0標(biāo)準(zhǔn)的自由能變化，規(guī)定F01molS與1mol L形成1mol SL時(shí)自由能的變化。負(fù)號(hào)表示自由能為負(fù)的變化。 從上式可以估計(jì)：當(dāng)抗原抗體結(jié)合親和力增加l0倍，則1n102303，37(3l015K)時(shí)的F05.94KJmol，溫度低于37時(shí)F0更小。這種自由能變化還不足單個(gè)氫鍵的能量(約1881KJmol的13。即使親和力非常高，K1010Lmol，F(xiàn)0只有594KJmol，僅相當(dāng)于3個(gè)氫鍵的結(jié)合能。當(dāng)抗原與抗體間形成氫鍵時(shí)，水的氫鍵被破壞，因此每個(gè)氫鍵的凈能接近于4.18KJmol。由此可見抗體與抗原結(jié)合時(shí)，吸力與斥力幾乎相等，即使在很高親和力下，也只有幾

40、個(gè)千卡的微小差別。因而F的輕微增加會(huì)導(dǎo)致抗原抗體結(jié)合的親和力增高，這就不難理解當(dāng)抗原結(jié)構(gòu)發(fā)生某些微小改變(如化學(xué)修飾)時(shí)，會(huì)引起抗原抗體的親和力的很大變化。自由能對(duì)K的影響取決于溫度，然而自由能本身也受溫度的影響：F 0H0TS 0H0 為焓變，S 0為熵變，T為絕對(duì)溫度。K隨溫度的變化如下:dlnK/dT=H0 / RT2 或dlnK/d(1/T)= H0 /R 當(dāng)氫鍵和極性鍵形成時(shí)，較大的負(fù)焓變驅(qū)動(dòng)放熱，親和力會(huì)隨溫度的增加而下降。因此抗原抗體相互作用在4比在25或37有更高的親和力，可見在給定的濃度下，最大眼度的結(jié)合在較低溫度下達(dá)到的。相反，非極性或者疏水的相互作用受到熵的影響，TS 0

41、和H0接近于零，所以這時(shí)溫度對(duì)親和力影響較小。 3.抗原抗體反應(yīng)的動(dòng)力學(xué) 抗原抗體反應(yīng)達(dá)到平衡時(shí)的參數(shù)測(cè)定在實(shí)際操作時(shí)是困堆的。反應(yīng)完成90，只需幾分鐘或幾小時(shí)，而從90至99則需幾倍的時(shí)間，而欲達(dá)到999完成時(shí)所費(fèi)時(shí)則更長(zhǎng)，因?yàn)榇藭r(shí)的Ag和Ab已減少到極低的水平。測(cè)定一些參數(shù)在反應(yīng)的早期或者未到平衡時(shí)是可行的，利用動(dòng)力學(xué)可以計(jì)算出抗原抗體反應(yīng)的特征性參數(shù)，用以描述抗原抗體反應(yīng)的規(guī)律：K+ Ag（S）Ab(L) AgAb （SL）K結(jié)合反應(yīng)速度K·S·L·M-1·S-1 解離反應(yīng)速度=K-·SL·S-1達(dá)到平衡時(shí)，則K+·S

42、·LK-·SLKK+K-KK+K-表明相同親和力的抗體，其結(jié)合速度常數(shù)和解高速率常數(shù)并不一致。如果K+和K-均很大則抗原抗體復(fù)合物形成很快，但不穩(wěn)定；而K+和K-均小時(shí)抗原抗體復(fù)合物形成較慢，但很穩(wěn)定。前者適合于親和層析，后者適合于標(biāo)記分析。 抗原抗體結(jié)合成復(fù)合物后解離的速度常數(shù)(K-)取決于結(jié)合鍵的強(qiáng)度。已知抗體的親和力和結(jié)合速度常數(shù)K+，根據(jù)動(dòng)力學(xué)基本公式KK+K-可以計(jì)算解離常速度數(shù)K-。例如抗葡萄球菌核酸酶的抗體對(duì)酶蛋白抗原的親和力是8.3×l08Lmol，結(jié)合速度常數(shù)K+41×l05 L(mol·s)，比對(duì)半抗原的結(jié)合常數(shù)低。由公式K

43、K+K-計(jì)算得到K-4.9×10-4 L(mol·s)。然后根據(jù)公式t1/21n2K-，計(jì)算半解離期(halftime for dissociation)，得到該抗體與抗原復(fù)合物的半解離期為23min。了解抗原抗體復(fù)合物的半解離期便可知道結(jié)合物在多大的時(shí)間范圍內(nèi)稀釋而不影響結(jié)合物的解離，這對(duì)在免疫親和層析等許多其他免疫方法的應(yīng)用中有重要意義。 抗原抗體反應(yīng)的速度在很大程度上取決于抗原分子和抗體分子的擴(kuò)散速率及碰撞的機(jī)率。擴(kuò)散速度常數(shù)用下式表示： Kdl4D(6×1020) 為抗原和抗體分子半經(jīng)之和(單位為cm)；D為反應(yīng)系統(tǒng)中抗原和抗體分子的擴(kuò)散常數(shù)之和(單位為c

44、m2s)；6×1020為轉(zhuǎn)換函數(shù)，為了把單位轉(zhuǎn)換為L(zhǎng)(mol·s)。例如10-6cm，D107cm2s，Kdl=7.5×108L(mol·s)。通常大的蛋白抗原比半抗原與抗體結(jié)合的速率要慢，大部分蛋白質(zhì)的結(jié)合速度在105106L(mol·s)，而理論上限為109 L(mol·s)。 二、抗體與單價(jià)抗原的作用 1抗體親和力的測(cè)定 抗體親和力的測(cè)定的方法常采用作圖法?？乖贵w反應(yīng)最簡(jiǎn)單的情況是單克隆抗體與單價(jià)抗原的反應(yīng)，如半抗原與單克隆抗體或單克隆抗體與大分子抗原上單一的非重復(fù)的位點(diǎn)(抗原決定簇)的作用。以最簡(jiǎn)單的單克隆抗體與半抗原反應(yīng)為

45、例的作圖法，首先用平衡透析(equilibrium dialysis)(圖77A)來測(cè)定系列游離抗原及結(jié)合抗原的濃度。根據(jù)不向抗原濃度進(jìn)行平衡透析所獲得的結(jié)合抗原，游離抗原?？贵w濃度是已知的。根據(jù)這些數(shù)據(jù)，進(jìn)行Scatchard分析，即可計(jì)算出Ka的值(圖77B)。 Scatchart分析方法是將KaSL/SL分子和分母都除以抗體的濃度，SL/Ah=r,r代表每個(gè)抗體分子結(jié)合的抗原(單價(jià))分子數(shù)SL/Ab=S/Ab.L(nr)C，S/Ab;表示每個(gè)抗體分子上未被抗原占有的游離抗體結(jié)合位的濃度。這濃度實(shí)際上是抗體分子上等于全部抗體結(jié)合位(n)減去以被抗原占據(jù)了的結(jié)合位數(shù)。因?yàn)橛玫氖菃蝺r(jià)抗原，因此

46、也就是減去結(jié)合的抗原分子數(shù)r，即(nr)。這里的n實(shí)際上代表抗體的價(jià)數(shù)。C在這里代表抗原的濃度L。由此得到公式：當(dāng)固定抗體的濃度用不同濃度的抗原進(jìn)行一系列的平衡透析實(shí)驗(yàn)，得到一系列相應(yīng)的r數(shù)據(jù)，然后根據(jù)以r/C對(duì)r作圖。如果所用抗體是均質(zhì)的（單克隆抗體），r/C與r的關(guān)系為線性關(guān)系，它的斜率即為親和力Ka（圖77B）。從公式可見，當(dāng)抗原的濃度很大的r/C0，所以Ka（nr）0或Ka·n=Ka·r,由圖77B可見橫坐標(biāo)r的截距就等于抗體價(jià)n。2親和力的異質(zhì)性 當(dāng)與單價(jià)抗原結(jié)合的抗體是多克隆抗體時(shí)，其Scatchard圖呈非線性關(guān)系(圖77B)。由于多克隆抗體來源于多個(gè)細(xì)胞克隆

47、，其內(nèi)在親和力不同。內(nèi)在親和力的平均值Ko常用于表示異質(zhì)的多克隆抗體的親和力，Ko為抗體結(jié)合位點(diǎn)12被占據(jù)時(shí)的游離抗原濃度。 3抗體結(jié)合抗原的特異性半抗原反應(yīng)抗體與單價(jià)半抗原反應(yīng)的特異性極強(qiáng)，半抗原上化學(xué)基團(tuán)的細(xì)小差別或位置的改變，則與抗體的反應(yīng)性會(huì)表現(xiàn)明顯的差別(圖78)?？贵w與同源抗原(homologous antigen)反應(yīng)最強(qiáng)，與異源抗原(heterologous antigen)反應(yīng)相對(duì)較弱。有些抗體與異源抗原的反應(yīng)比同源強(qiáng)，稱為變態(tài)抗體(heteroclitic antibody)。抗原分子表面或末端的一些突出的基團(tuán)，具有免疫優(yōu)勢(shì)，是抗原決定簇的主要結(jié)構(gòu)，影響決定簇的特異性?？贵w

48、的抗原結(jié)合部位是疏水的，微溶于水的三硝基苯半抗原與相應(yīng)抗體形成親和力很高的復(fù)合物，而水溶性很高的糖類、有機(jī)離子(如苯甲酸鹽)只能與抗體結(jié)合形成低親和力的復(fù)合物。 三、抗體與大分子多價(jià)抗原的反應(yīng) 1多抗原決定簇大分子抗原的特征 能與一個(gè)抗體結(jié)合的大分子抗原的特異性部分稱為抗原決定簇(antigen determinants)。一個(gè)大分子抗原常常有多個(gè)抗原決定簇而成為多價(jià)抗原?？乖瓫Q定簇的序列結(jié)構(gòu)已清楚的稱為抗原表位(epitope)。半抗原相當(dāng)于一個(gè)抗原決定簇。大分子抗原上含有多個(gè)抗原決定簇能與相應(yīng)的特異抗體結(jié)合。在一些情況下，決定簇之間相距較遠(yuǎn)的各自與抗體結(jié)合而互不影響，這種決定簇是不重疊的決

49、定簇。當(dāng)一個(gè)抗體與某一決定簇結(jié)合后，在空間上干擾了其他抗體與相應(yīng)決定簇的結(jié)合，這些靠得較近的決定簇稱為重疊決定簇。在少數(shù)情況下，前一抗體的結(jié)合導(dǎo)致抗原結(jié)構(gòu)的空間變化，影響了另外抗體的結(jié)合，稱為變構(gòu)效應(yīng)(allosteric effect)。 許多大分子如蛋白質(zhì)、核酸、復(fù)合多糖常常形成重復(fù)結(jié)構(gòu)，因而每個(gè)分子內(nèi)有多個(gè)相同的抗原決定簇。顆粒性抗原細(xì)胞、細(xì)菌及病毒等還可形成多亞基聚合物，也可產(chǎn)生重復(fù)的抗原決定簇，成為多價(jià)的(multivalent)抗原。單抗原決定簇的分子即半抗原可吸附在固相載體上，其結(jié)構(gòu)也類似多價(jià)抗原，如ELISA中的包被抗原，其結(jié)合特性和溶液中單價(jià)抗原有所不同。 2抗原抗體的親和力

50、和親合力 單價(jià)抗原與抗體反應(yīng)取決于親和力(affinity)的大小，而天然多價(jià)抗原與小分子半抗原不同，含有1個(gè)以上的抗原決定簇，因此能與1個(gè)以上的抗體結(jié)合。如果沒有空間限制，對(duì)重復(fù)的多價(jià)抗原分子，一個(gè)IgG或IgE分子有兩個(gè)結(jié)合位點(diǎn)，而個(gè)IgM有10個(gè)結(jié)合位點(diǎn)。對(duì)任何一個(gè)位點(diǎn)的親和力是不變的，總的結(jié)合強(qiáng)度包括抗體上所有的結(jié)合位的親和力，抗體對(duì)抗原分子總的結(jié)合強(qiáng)度，稱為親合力(avidity)。親合力大大強(qiáng)于每一位點(diǎn)的親和力，其強(qiáng)度增加不僅僅是親和力的簡(jiǎn)單相加，而是呈幾何級(jí)數(shù)上升的。因此，一個(gè)低親和力的IgM分子，或者多個(gè)低親和力的IgG分子對(duì)一個(gè)多價(jià)抗原的結(jié)合是相當(dāng)緊密的。 3抗體與多價(jià)抗原結(jié)

51、合的濃度帶現(xiàn)象 抗體與單價(jià)抗原形成的復(fù)合物都是可溶性的，但抗體與多價(jià)抗原形成的復(fù)合物大多數(shù)能形成沉淀。沉淀反應(yīng)可用于研究抗體與大分子抗原結(jié)合的特性。用非蛋白大分子(如多糖)抗原與相應(yīng)抗體形成的沉淀，其中只有抗體是蛋白質(zhì)，為抗體的定量測(cè)定提供了方便。在一定量的抗體中，逐漸增加抗原濃度，沉淀的形成與抗原抗體的比例密切相關(guān)。圖79是典型的單特異性沉淀曲線。沉淀反應(yīng)的曲線分為3個(gè)區(qū)：抗體過量區(qū)，抗原與抗體形成小分子復(fù)合物，不形成沉淀或沉淀很少，稱為前帶(prozone)現(xiàn)象；抗原過量區(qū)，雖然沒有游離的抗體，但沉淀仍很少，稱為后帶(postzone)現(xiàn)象；在抗原抗體等帶區(qū)(equizone)形成大量沉淀

52、，也沒有游離的抗原和抗體存在。如果抗原是多抗原決定簇的多價(jià)抗原如細(xì)菌、細(xì)胞、乳膠顆粒等表面，則形成凝集反應(yīng)。 抗原抗體相遇時(shí)，不管二者比例如何，很快發(fā)生特異性結(jié)合，一般在幾秒鐘內(nèi)完成，稱為初級(jí)反應(yīng)階段。初級(jí)反應(yīng)沒有可見的沉淀。從特異性結(jié)合到可見沉淀形成稱為次級(jí)反應(yīng)階段。這階段通常需要更長(zhǎng)的時(shí)間，從幾分鐘到幾小時(shí)甚至幾天，才能看見沉淀。次級(jí)反應(yīng)除受抗原抗體濃度比例影響外，pH值、離子強(qiáng)度和補(bǔ)體的存在也影響沉淀的形成。 抗原抗體形成沉淀的機(jī)理，用Marrack等人提出的網(wǎng)格理論可得到合理的解釋?？乖贵w的結(jié)合包括許多抗原與許多抗體相互連接形成網(wǎng)格。當(dāng)這些聚合物達(dá)到一定大小時(shí)，便從溶液中沉淀出來?？?/p>

53、體分子大多為二價(jià)(1gG)，而大分子抗原一般是多價(jià)的，一個(gè)抗體可以與兩個(gè)抗原上相同的決定簇結(jié)合，一個(gè)抗原分子也能與多個(gè)抗體分子結(jié)合，從而形成相互交聯(lián)的網(wǎng)格發(fā)生沉淀。而抗原或抗體過量時(shí)，不能形成網(wǎng)格，故不發(fā)生沉淀。反應(yīng)系統(tǒng)中存在多種抗原抗體反應(yīng)稱為多特異性系統(tǒng)，它與單特異性反應(yīng)不同，在沉淀最多時(shí)懸液中仍有過量的抗原或抗體，這是因?yàn)橐粋€(gè)獨(dú)立的反應(yīng)中，過量抗原會(huì)與另個(gè)獨(dú)立的反應(yīng)的過量抗體重疊的結(jié)果。此外，在一些反應(yīng)系統(tǒng)中，即使抗原抗體比例合適，也不形成可見的沉淀、這是因?yàn)榭贵w的親和力很低，或者抗體的雙價(jià)結(jié)合位點(diǎn)只結(jié)合一個(gè)大分子抗原，稱為單配雙價(jià)結(jié)合(monogamous bivalent bindi

54、ng)，或者抗體的雙價(jià)結(jié)合位結(jié)合了同一個(gè)抗原分子的重復(fù)的決定簇。在上述這些情況下無法形成網(wǎng)格結(jié)構(gòu)，這類抗體稱為不完全抗體(incomplete antibody)。 4交叉反應(yīng) 大分子抗原常常含有多個(gè)抗原決定簇，部分抗原決定簇與另一大分子上的抗原決定簇相同，當(dāng)用此類抗原免疫后所獲得的抗體既可以與同源抗原結(jié)合，又能與異源抗原結(jié)合?？贵w與同源抗原的親和力通常比異源抗原要高得多，所以反應(yīng)較強(qiáng)。少數(shù)交叉反應(yīng)用低親和力的抗體比用高親和力抗體更能顯示出來，如抗多糖抗體一般親和力較低，易表現(xiàn)交叉反應(yīng)。低親和力抗體往往是因?yàn)槠淇乖Y(jié)合位特異性低，易與結(jié)構(gòu)類似的抗原反應(yīng)。用免疫沉淀尤其是凝膠雙擴(kuò)散方法能非常容易

55、地鑒定交叉反應(yīng)，并且根據(jù)沉淀線形成的類型判斷幾種抗原間的交叉反應(yīng)關(guān)系。第三節(jié) 常見免疫分析方法免疫分析方法是利用抗原與抗體特異性反應(yīng)的特性對(duì)抗原或抗體進(jìn)行量或質(zhì)的測(cè)定分析。這類分析方法具有特異、靈敏和快速的特點(diǎn)，有的可以表現(xiàn)出一個(gè)氨基酸分子的差異，如用單克隆抗體進(jìn)行檢測(cè)的方法；測(cè)定的量可以達(dá)到g甚至ng的水平，如ELISA法，放射免疫法等；反應(yīng)在幾小時(shí)，幾分鐘甚至更短的時(shí)間可以看到測(cè)定的結(jié)果，如免疫沉淀法等。這類免疫分析的方法可以用于醫(yī)學(xué)，免疫學(xué)中抗原抗體的分析(包括病原的診斷，免疫細(xì)胞表面分子的檢測(cè)等)，而且可以廣泛的用于生命科學(xué)的幾乎各個(gè)領(lǐng)域，甚至于食品科學(xué)，環(huán)境科學(xué)及分析化學(xué)等更為廣泛的

56、學(xué)科領(lǐng)域。 一、免疫沉淀 1溶液中的沉淀反應(yīng) 在體外當(dāng)抗體與相應(yīng)抗原二者濃度比例適當(dāng)時(shí)，會(huì)發(fā)生免疫沉淀(immunoprecipitation)反應(yīng)，表明兩者之間有特異性反應(yīng)。免疫沉淀反應(yīng)廣泛用于抗原或抗體的定性及定量分析。在液相中形成的沉淀不易觀察判斷，利用抗原和抗體溶液之間的界面形成的沉淀線便于判斷，即環(huán)狀沉淀試驗(yàn)(ring precipitant test)(圖7l0)。沉淀試驗(yàn)可以在玻璃管中進(jìn)行，將小試管或毛管的底部加入抗原溶液，在上層輕輕鋪上不同稀釋倍數(shù)的抗體溶液，勿使界面破壞，為了使界面更好地形成，常在下層抗原溶液中加入10的蔗糖或甘油?？乖贵w溶液置于37或4孵育后，在界面上形成白色沉淀線。玻片上沉淀的形成必須在顯微鏡下觀察。2凝膠擴(kuò)散沉淀 抗原抗體可在半透明的半固相介質(zhì)中進(jìn)行沉淀實(shí)驗(yàn)?？乖肿雍涂贵w分子在凝膠介質(zhì)中自由擴(kuò)散形成濃度梯度，抗原與抗體在比例合適的一定擴(kuò)散部位相遇形成沉淀線。凝膠沉淀可用于測(cè)定抗原或抗體的相對(duì)濃度，也可用于比較不同抗原的特異性、純度及相互關(guān)系。最常用的方法為單向免疫擴(kuò)散(radial immuno diffusion )和雙向免疫擴(kuò)散(doubleimmuno