基因工程植物疫苗的研究進(jìn)展及應(yīng)用.docx

1、基因工程植物疫苗的研究進(jìn)展及應(yīng)用張軍梅（榆林市農(nóng)業(yè)干部學(xué)校，陜西榆林719000）插要：也因楨物疫苗巳成為疫苗研究領(lǐng)域的一個(gè)新熱點(diǎn),本文簡單介約了植物疫苗的免疫原理、枝物疫苗的特點(diǎn)、植物疫黃生產(chǎn)的表達(dá)系統(tǒng)、以枝粉為我休的免疫技術(shù)、植物疫苗的安會柱、植物廉因工程疫苗研霓進(jìn)展、基因工球獨(dú)物疫苗中的應(yīng)用以及展燮等關(guān)鍵詞：枝物疫苗；基因工程;表達(dá)系統(tǒng)；安會性1 植物疫苗的免疫原理植物疫苗可誘導(dǎo)粘膜免疫反應(yīng)，小腸淋巴組織的粘膜上有一種特殊的細(xì)胞叫做膜細(xì)胞（M細(xì)胞）'粘膜免疫應(yīng)答就是由M細(xì)胞識別抗原開始的。M細(xì)胞識別抗原并將其傳遞給巨噬細(xì)胞，巨噬細(xì)胞和其它抗原呈遞細(xì)胞,再將抗原展示給輔助性T細(xì)胞，

2、輔助性T細(xì)胞識別外源蛋白質(zhì)片段后就會刺激B細(xì)胞制造和釋放能中和抗原的抗體，當(dāng)疾病因子出現(xiàn)時(shí)，記憶輔助性T細(xì)胞剌激胞毒T細(xì)胞攻擊受感染的細(xì)胞，同時(shí)它迅速刺激記憶B細(xì)胞分泌中和抗體消滅入侵的病原體。總的來說，轉(zhuǎn)基因植物疫苗可以誘導(dǎo)相應(yīng)的血清型的IgA和IgG反應(yīng)。2 植物疫苗的特點(diǎn)2.1安全性高植物是人類食物來源之一,除個(gè)別人群對某些特定的植物過敏外，其安全性高。用動物細(xì)胞生產(chǎn)疫苗，可能有動物病毒的污染，對人類存在潛在危害。而植物病毒不會感染人類，比較安全,同時(shí)也可避免微生物生產(chǎn)疫苗帶來的有害產(chǎn)物。2.2成本低植物種植系統(tǒng)簡單易行，植物細(xì)胞培養(yǎng)條件簡單，便于進(jìn)行遺傳操作，訶通過大面積栽培獲得廉價(jià)的

3、疫苗,且不需妾技術(shù)、設(shè)備和種植條件等巨大投資。農(nóng)作物可以當(dāng)?shù)厣a(chǎn)，還易于儲藏和運(yùn)輸，而且經(jīng)過長期種植,植物栽培、收獲、貯藏、加工程序已經(jīng)形成工業(yè)化。與植物生物反應(yīng)器相比,原核生物反應(yīng)器與動物生物反應(yīng)器生產(chǎn)時(shí)需要昂貴的技術(shù)設(shè)備、大址的人力物力。2.3楂物具有完整的真核表達(dá)系統(tǒng)具有與動物相同的直核加工修飾系統(tǒng)?？梢詫χ亟M蛋白進(jìn)行糖基化、磷酸化、酰胺化、亞基正確裝配等。微生物系統(tǒng)不能對真核生物蛋白進(jìn)行正確的翻譯后加工。2.4轉(zhuǎn)基因植物中的外源基因可重組通過植物雜交的方法進(jìn)行基因重組，進(jìn)而在植物體內(nèi)積累多種病原體的抗原基因，生產(chǎn)出方便高效的多聯(lián)疫苗。3 植物基因工程疫苗外源基因的表達(dá)系統(tǒng)3.1睨時(shí)表達(dá)

4、系統(tǒng)主要采用植物病毒作為載體.而外源基因插入到病毒基因組中，通過病毒感染植株，從而將外源基因?qū)胫参锛?xì)胞內(nèi)，采用這種轉(zhuǎn)化方式，外源基因并不整合至植物基因組中，只是利用寄主細(xì)胞在細(xì)胞質(zhì)中進(jìn)行復(fù)制，以高拷貝的形式游離于植物中，并進(jìn)行高效的表達(dá)，因此可在短時(shí)間內(nèi)在植物細(xì)胞內(nèi)積累大量的外源蛋向。采用農(nóng)桿圜介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化，外源基因蛋白的產(chǎn)域一般要低于細(xì)胞內(nèi)可溶性蛋白總量的1%；而采用這種瞬時(shí)表達(dá)系統(tǒng),外源基因蛋白總址會遠(yuǎn)大于1%03.2穩(wěn)定整合系統(tǒng)3.2.1土壤農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化。目前根癌農(nóng)桿菌主要用于雙子葉植物的遺傳轉(zhuǎn)化，其轉(zhuǎn)化植物的機(jī)制已從分子水平上基本得到解釋。而發(fā)根農(nóng)桿菌，由于對Ri質(zhì)粒亍解得還不

5、充分，所以對這種轉(zhuǎn)化系統(tǒng)的研究主要集中在以生產(chǎn)次生代謝產(chǎn)物為目的的根組織培養(yǎng)和根的發(fā)育。采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的植物轉(zhuǎn)化最常采用共培養(yǎng)法，即使用農(nóng)桿菌菌液與葉盤、愈傷組織、懸浮培養(yǎng)細(xì)胞、莖段、下胚軸段、子葉切片等部分進(jìn)行共培養(yǎng)，從而達(dá)到轉(zhuǎn)化的目的。3.2.2外源DNA直接導(dǎo)入法。主要包括基因槍法、電激發(fā)、PEG誘導(dǎo)法、激光穿孔法、脂質(zhì)體法、超聲波法，其中最常用的是基因槍法。它是將帶有外源基因的質(zhì)粒用亞精胺包裹為直徑iFim左右的金彈或鴇彈,再用高壓藏氣、火藥爆炸力、高慶放電氣體作為動力加速子彈，使它們穿過植物細(xì)胞壁和細(xì)胞膜.將外源基因帶入具有再生能力的植物組織,這樣可以在很大程度上縮短再生的時(shí)間，從而

6、避免體細(xì)胞變異的發(fā)生。4 以植物為載體的免疫技術(shù)4.1枝物疫苗免疫原性和免疫保護(hù)作用由于植物疫苗一般是通過食用來被人體利用。所以如何避免消化酶的影響來保護(hù)抗原就是-個(gè)重要的研究課題。目前，避免消化酶的影響來保護(hù)抗原可分為2類方法：用沙門氏菌和弧狀霍亂桿菌作為載體;用保護(hù)性的包被對抗原進(jìn)行包裝。用減毒的菌株可以把抗原引向粘膜的表面.有利于粘膜免疫系統(tǒng)攝取所表達(dá)的抗原。但是基于減毒菌株的方法具有潛在安全缺陷.而后者可通過生物降解的多聚物、脂質(zhì)體、錢白質(zhì)體或者表達(dá)抗原的轉(zhuǎn)基因植物來實(shí)現(xiàn)。許多研究表明，植物材料可潛在地保護(hù)所選定的抗原。特別在種子中，植物可為亞單位疫苗提供一個(gè)富含蛋白酶抑制物的糖類聚合

7、物基質(zhì)環(huán)境。其它的抗原包裝方法需要煩瑣的處理步驟；而通過植物種子來進(jìn)行生物包裝不需要任何額外的代價(jià),就可以為這些抗原提供保護(hù)。在有關(guān)轉(zhuǎn)基因馬鈴薯的研究中，從輪狀病毒和產(chǎn)腸毒素大腸桿菌中所選的抗原分別與霍亂毒素的B和A：亞單位融合，抗原的免疫反應(yīng)顯示出對TM的偏愛性，并可誘導(dǎo)白細(xì)胞介索2和干擾素,CD4+水平也相應(yīng)增加。Thl的偏愛性很可能是抗原或者載體的選擇結(jié)果。在佐劑的幫助下，亞單位疫苗的釋放能增加免疫反應(yīng)量。霍亂毒素和大腸桿菌的熱不穩(wěn)定毒索，它們與抗原共表達(dá)，有利于誘導(dǎo)保護(hù)性的免疫產(chǎn)生,改變口服免疫低效率遞呈。另外,有人證實(shí)了轉(zhuǎn)基因植物疫苗的粘膜傳輸中所誘發(fā)的免疫應(yīng)答所具有的黏膜佐劑的特征

8、，這給【I服免疫可不需佐劑提供了依據(jù)，同時(shí)也提高了其安全性。在以植物疫苗的口服免疫研究中，所候選的亞單位疫苗也具有較好的保護(hù)作用。馬鈴薯塊莖或谷物種子中表達(dá)的熱不穩(wěn)定毒素的B亞基和馬鈴磐中表達(dá)的霍亂毒素B亞基用于小鼠口服免疫.可以保護(hù)老鼠免受痢疾的感染。另外，口服免疫由谷物種子表達(dá)的傳播性腸炎病毒的島糖蛋白，對乳豬能夠起到很好的保護(hù)作用。目前，通過植物遞送系統(tǒng)來生產(chǎn)B型肝炎的疫苗也逐漸成熟。4.2提高抗原在植物中的表達(dá)水平利用植物進(jìn)行疫苗開發(fā)，首要的問題是.植物能否表達(dá)相關(guān)的蛋白？目前為止,許多亞單位候選抗原在轉(zhuǎn)基因植物中成功表達(dá),這些抗原主要包括感染人類、家畜、野生動物的細(xì)菌和病毒抗原。表達(dá)

9、水平很大程度上取決于表達(dá)的蛋白和用于表達(dá)的植物種類.同時(shí).構(gòu)建的表達(dá)系統(tǒng)也影響抗原的表達(dá)水平，比如用于表達(dá)的細(xì)胞器基因組(核和質(zhì)粒)、啟動子的強(qiáng)度和組織專一性、非翻譯前導(dǎo)序列和信號序列的選擇和表達(dá)蛋白的靶細(xì)胞器的定位等均對表達(dá)產(chǎn)生影響。一般而言.利用上述策略可以實(shí)現(xiàn)抗原高水平表達(dá)c然而，很難對表達(dá)系統(tǒng)進(jìn)行比較,因?yàn)樘囟乖瓕χ参锉磉_(dá)系統(tǒng)的選擇很重要.在不同的系統(tǒng)中其表達(dá)效果是不-樣的。近來.研究人員利用內(nèi)質(zhì)網(wǎng)滯留信號可提高外源基因的表達(dá)量.Mason等利用一個(gè)核表達(dá)系統(tǒng)，把蛋白定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)滯留信號之后，熱不穩(wěn)定毒素B亞單位在馬玲誓塊莖中表達(dá)址可達(dá)總可溶性蛋白質(zhì)的0.2%;在谷物種子中的表達(dá)量約

10、占總可溶蛋白的4%或12%,這些都依賴于所用的調(diào)節(jié)序列。另外.霍亂毒素(B)亞單位在利用內(nèi)質(zhì)網(wǎng)滯留信號時(shí)在煙草葉片中的表達(dá)甘約占總可溶蛋白的4%。膜蚩白比可溶性蛋白更難于在轉(zhuǎn)基因植物中表達(dá).大量研究表明.膜飯白在植物中的表達(dá)量遠(yuǎn)不及可溶性蛋白.這就需要優(yōu)化表達(dá)系統(tǒng)以提高表達(dá)水平。目前，轉(zhuǎn)基因馬玲磐表達(dá)B型肝炎的表面抗原水平已由馬玲磐大約lmg/g增加到馬玲馨大約16mg/g抗原.這樣可以大大減少口服劑量。目前許多研究表明，所欲表達(dá)的抗原在植物中能夠表達(dá)并裝配成四級結(jié)構(gòu)。糖基化修飾的蛋白也可在植物中進(jìn)行精基化，盡管糖基化模式很可能存在著差別。在植物系統(tǒng)中表達(dá)的熱不穩(wěn)定蛋白毒素的B亞單位和雷亂毒素

11、的B亞單位，均有GM1受體結(jié)合活性B型肝炎表面抗原和諾沃克病毒衣殼蛋白可形成類病毒顆粒類病毒顆粒的形成，可認(rèn)為有利于誘導(dǎo)免疫反應(yīng)。5 植物基因工程疫苗研究進(jìn)展5.1反轉(zhuǎn)錄病毒栽體反轉(zhuǎn)錄病毒作為載體是在進(jìn)行動物基因工程中發(fā)現(xiàn)的，許多研究人員認(rèn)為它同樣適于植物基因工程，但目前研究的不多。5.2單鏈RNA植物病毒單鏈RNA植物病毒,即病盤RNA可直接作為mRNA的植物病毒，主要包括苜?；ㄈ~病毒(ALMV)、就豆花葉病毒(CPMV)、雀麥花葉病毒(BMV)、煙草花葉病毒(TMV)等。它們作為外源基因載體主要通過以下步驟感染植物：病毒RNA首先反轉(zhuǎn)錄為一條單鏈cDNA,在DNA聚合酶作用下形成雙鏈DNA

12、,將其克隆入細(xì)菌質(zhì)粒中，將外源基因插入質(zhì)粒的cDNA中，最后通過體外轉(zhuǎn)錄，用帶有外源基因的RNA病毒感染植物,將其轉(zhuǎn)入植物細(xì)胞。5.3單MDNA病毒裁體在單鏈DNA植物病毒載體中，研究最多的是Gemi-nivimses(簡稱GeNV)，又叫做雙粒病毒或雙聯(lián)體病毒。它般含有2個(gè)成對并存的病毒顆粒，大小約為1820nm,遺傳物質(zhì)是單鏈DNA,每2個(gè)顆粒中包含】2個(gè)、2.53.0kb的環(huán)狀DNA分子。該病毒寄主廣泛.單子葉植物和雙子葉植物均可被感染，但感染部位僅限于植物的維管組織.且其傳播媒介主要是昆蟲,不能通過機(jī)械接種。5.4雙鏈DNA植物病毒載體雙鏈DNA植物病毒載體中最典型的是花榔菜花葉病毒，

13、它的基因組長約8kb,主要感染花挪菜、油菜、擬南芥等，主要寄主是蕓苔屬植物，目前尚未發(fā)現(xiàn)可感染豆科和單子葉植物。6 植物疫苗的安全性6.1對環(huán)境的影響由于在植物疫苗中包含了病原體的DNA片段，因而花粉和種子的散播造成的基因逃逸可能給人類帶來新的病原、毒素、過敏原等，因此對可能引起的基因漸滲現(xiàn)象必須做出充分的安全性評價(jià)，并規(guī)范植物疫苗的利用和管理，同時(shí)尋求技術(shù)方法。如可恢復(fù)性功能阻塞(RBF)技術(shù)，它能使自然界中因漸滲而攜帶RBF的雜種或近緣系植物死亡或不育或利用葉綠體轉(zhuǎn)化植物疫苗或培育植物疫苗的雄性不育系,這樣就可避免花粉傳播而帶來的潛在威脅，轉(zhuǎn)基因植物疫苗有著傳統(tǒng)疫苗無法比擬的優(yōu)越性.已經(jīng)成

14、為一個(gè)研究熱點(diǎn)了。未來的研究應(yīng)著眼于生產(chǎn)出作為醫(yī)藥商品的安全、可靠、有效的植物疫苗。轉(zhuǎn)基因植物疫苗應(yīng)用最大的限制就是表達(dá)量低?，F(xiàn)在的研究表明：可以通過葉綠體轉(zhuǎn)化、植物育種和利用食品加工技術(shù)來提高表達(dá)水平,而旦研究還指出，運(yùn)用攜帶蛋白和輔助蛋白可以增加抗原被免疫系統(tǒng)識別的能力。這些研究都使我們越來越接近生產(chǎn)出廉價(jià)“安全口服的商品植物疫苗”，這樣的疫苗將可以幫助人們預(yù)防疾病的傳播。6.2對人類和動物的影響抗生素抗性基因是篩選轉(zhuǎn)基因植物常用的標(biāo)記基因。長期食用這類轉(zhuǎn)基因疫苗是否會對人體或動物造成抗生素醫(yī)療無效。轉(zhuǎn)基因植物中的新基因會不會傳遞給人畜腸道的正常微生物,引起菌群和數(shù)量的變化或插入并表達(dá)，從

15、而危害人畜健康？這些問題目前都無法解答.仍需大景學(xué)者繼續(xù)研究t侖證。7 展望利用植物來表達(dá)和遞送疫苗技術(shù)的發(fā)展給免疫研究注入了新的內(nèi)容。以往的研究中，在植物中表達(dá)了包括過濾性病毒、細(xì)菌、腸道和非腸道的病原體等各種不同的抗原,并做了相應(yīng)免疫學(xué)研究。但植物疫苗面臨的最大問題是抗原蛋白在植物細(xì)胞表達(dá)量不高，低劑量抗原蛋白往往不能激發(fā)足夠的免疫反應(yīng),這不能僅靠增加植物組織攝取量得以解決，因?yàn)榈蛣┝康闹貜?fù)免疫可能會導(dǎo)致機(jī)體的免疫耐受，導(dǎo)致機(jī)體對此抗原免疫反應(yīng)保持“低調(diào)”，即使以后增加抗原蛋白的劑量也不能改變。另外，機(jī)體每天對植物組織的攝取雖:是一定的,淺談宜君縣林業(yè)產(chǎn)業(yè)建設(shè)張娟（宜君縣國有哭泉林場.陜西

16、宜君727202）摘要:文章闡述了宜君縣林業(yè)產(chǎn)業(yè)建設(shè)現(xiàn)狀、存在的問題，提出了產(chǎn)業(yè)建設(shè)的發(fā)展思路。關(guān)鍵詞：林業(yè)產(chǎn)業(yè)；建設(shè)林業(yè)產(chǎn)業(yè)是林業(yè)I：作的一個(gè)重要組成部分，是林業(yè)經(jīng)濟(jì)可持續(xù)發(fā)展的耄要?jiǎng)恿Α＜涌炝謽I(yè)發(fā)展，既是林業(yè)建設(shè)的客觀內(nèi)在要求，也是促進(jìn)經(jīng)濟(jì)社會發(fā)展的必然需要。近年，宜君縣在抓好生態(tài)建設(shè)的同時(shí),把林業(yè)建設(shè)作為促進(jìn)自身發(fā)展和保證自身穩(wěn)定的一項(xiàng)重要工作，切實(shí)抓緊抓好，抓出成效,堅(jiān)持“兩手抓”的方針，立足當(dāng)前，著眼長遠(yuǎn).整體規(guī)劃，分步實(shí)施，重點(diǎn)發(fā)展,真正實(shí)現(xiàn)林業(yè)3大效益同步提高。1 宜君縣林業(yè)產(chǎn)業(yè)建設(shè)的現(xiàn)狀近年來，宜君縣在“十七大”及“三個(gè)代表”重要思想引導(dǎo)下.適應(yīng)生態(tài)建設(shè)和市場需求的變化，充分發(fā)

17、揮當(dāng)?shù)刭Y源優(yōu)勢，鞏固提高第一產(chǎn)業(yè)調(diào)整優(yōu)化第二產(chǎn)業(yè)，積極引導(dǎo)發(fā)展第三產(chǎn)業(yè)建設(shè)，力爭多種渠道實(shí)現(xiàn)全縣林業(yè)經(jīng)濟(jì)可持續(xù)發(fā)展戰(zhàn)略C1.1林業(yè)產(chǎn)業(yè)發(fā)展速度加快，經(jīng)濟(jì)效益顯著增加近年來，宜君埃以經(jīng)濟(jì)林、苗木花卉、林區(qū)資源開發(fā)為重點(diǎn)的林業(yè)產(chǎn)業(yè)得到全面發(fā)展c1.2苗木花卉產(chǎn)業(yè)異軍突起，發(fā)展規(guī)模逐步壯大全縣發(fā)展國有和個(gè)體苗圃.以縣中心苗圃為龍頭,4個(gè)國有林場及各類小型苗圃為輔助，積極發(fā)展（五林區(qū)）苗木花卉產(chǎn)業(yè)。多種經(jīng)營呈現(xiàn)良好發(fā)展態(tài)勢，特色產(chǎn)業(yè)逐步興起。2 產(chǎn)業(yè)建設(shè)中存在的問題宜君縣生態(tài)建設(shè)良好。相對而言,林業(yè)產(chǎn)業(yè)建設(shè)發(fā)展滯后，總的來看其在整個(gè)林業(yè)工作中仍是一個(gè)薄弱環(huán)節(jié)仍存在-定的問題。2.1產(chǎn)業(yè)建設(shè)規(guī)模小，項(xiàng)目

18、少，產(chǎn)品結(jié)構(gòu)品種單一2.1.1科技含量低，效益低,后勁不足c雖然產(chǎn)業(yè)建設(shè)取得一定成績,但由于技術(shù)力量薄弱，缺乏一定的專業(yè)技術(shù)人才,使產(chǎn)業(yè)管理脫節(jié)嚴(yán)重，經(jīng)濟(jì)效益甚微。2.1.2市場信息閉塞。產(chǎn)品品種與市場需求不接軌，不能生產(chǎn)出適銷對路的新品種，缺乏市場導(dǎo)向,產(chǎn)品銷售不暢，沒有真正達(dá)到產(chǎn)、供、銷一條龍服務(wù)C2.1.3缺乏龍頭企業(yè)和精深加工業(yè)。3 產(chǎn)業(yè)建設(shè)的發(fā)展思路為了促進(jìn)宜君縣產(chǎn)業(yè)建設(shè)的發(fā)展，我們應(yīng)做好以下幾方面的工作：3.1加快林業(yè)產(chǎn)業(yè)結(jié)構(gòu)升級要加快建立以森林資源培育為基礎(chǔ)，以基地建設(shè)為突破口，以龍頭企業(yè)和精深加工為帶動，以科技進(jìn)步為支撐的林業(yè)產(chǎn)業(yè)的發(fā)展新格局，適應(yīng)生態(tài)建設(shè)和市場需求的變化，加大林業(yè)產(chǎn)業(yè)的重組力度,進(jìn)一步優(yōu)化資源配置.加快林業(yè)產(chǎn)業(yè)結(jié)構(gòu)升級步伐。特別是國家天然林保護(hù)工程實(shí)施后，由于全面禁止采伐天然林，這就為發(fā)展林業(yè)產(chǎn)業(yè)提供了必要條件。因此，為r滿足社會對木材等林業(yè)產(chǎn)品多樣化的需求，提高林業(yè)職工和林區(qū)群眾收入，推動地方財(cái)政增收，促進(jìn)區(qū)域經(jīng)濟(jì)發(fā)展，加強(qiáng)國有林業(yè)企業(yè)特別是國有林場經(jīng)營機(jī)構(gòu)調(diào)整，不斷優(yōu)化林業(yè)產(chǎn)業(yè)化程度勢在必行。3.2加快商品用材林基地建設(shè)要大力營造以商品型為主的材林,特別是要加快以速生豐產(chǎn)林用材林為主的林業(yè)產(chǎn)業(yè)基礎(chǔ)工程建設(shè),在條件具