淺論EB病毒膜蛋白家兔免疫血清的制備及其特性研究

1、淺論EB病毒膜蛋白家兔免疫血清的制備及其特性研究                作者：陸麗君，孟銳鋒，國強，朱珊麗，張麗芳【摘要】  目的：制備高效價EB病毒膜蛋白抗體，并對其效價及其與EBV結(jié)合的特異性進行鑒定。方法：將B95-8細(xì)胞培養(yǎng)至3×105/mL時，超聲破碎，純化獲得EB病毒膜蛋白抗原；EB病毒膜蛋白抗原經(jīng)弗氏佐劑乳化，在家兔背部皮下多點免疫注射，間隔2周免疫，共3次，并分別于免疫前和每次免疫后1周取兔血清，檢測兔免疫血清抗

2、體IgG；進一步采用Western blot檢測制備的血清抗體與EBV結(jié)合的特異性，同時采用ELISA法檢測兔血清抗體水平及各周抗體滴度的變化趨勢。結(jié)果 ：所有家兔在全程免疫后都產(chǎn)生了高效價膜蛋白的特異性抗體，最高滴度達1:6 400。結(jié)論 ：用B95-8細(xì)胞制備的EB病毒膜蛋白抗原免疫家兔，可成功制備高效價的特異性血清抗體，為EB病毒膜蛋白抗原的免疫學(xué)檢測奠定了基礎(chǔ)。 【關(guān)鍵詞】  EBV；抗體；免疫性   Abstract:  Objective: To prepare high-titer rabbit serum antibody against

3、 EBV membrane protein. Methods: B95-8(EBV) cells were cultivated and proliferated in cell culture system with RPMI-1640 culture medium (with 10% FBS and Pen/Strep). Thereafter，the purified B95-8(EBV) was harvested using supercentrifuge method. Prepare EBV membrane protein containing Freund adjuvant

4、by routine method. Four rabbits were immunized with the prepared antigen by subcutaneous injection at various sites of skin on back for every two weeks，three times in all. The sera of these immunized rabbits were collected separately for preparation of the rabbit serum IgG. Specific binding of the r

5、abbit serum antibody and the EBV membrane protein were analyzed by Western blot and the titer was assayed by ELISA. Results: All of the immunized rabbits produced high-titer serum antibody after the second booster. The highest titer of antibody against EBV membrane protein was 1:6 400. The result of

6、 Western blot showed the rabbit serum antibody could bind to the EBV membrane protein specifically. Conclusion: The specific rabbit serum antibody against EBV membrane antigen，with high titer，is successfully prepared. It laid a foundation of development of immunology method for detection of EBV memb

7、rane antigen.   Key words:  EBV；antibody；immunity   EB病毒（Epstein-Barr virus，EBV）是一含有包膜的DNA病毒，在人群中感染非常普遍，與某些腫瘤的發(fā)生和發(fā)展密切相關(guān)1，如Burkitts淋巴瘤、鼻咽癌、何杰金病和成人T細(xì)胞淋巴瘤等，其中鼻咽癌在東南亞及我國南方地區(qū)高發(fā)；研究發(fā)現(xiàn)，EBV感染尚與胃癌、乳腺癌和肺癌等腫瘤的發(fā)病有一定的相關(guān)性2-3。EBV在感染機體時，可在宿主細(xì)胞膜上表達包膜糖蛋白及潛伏膜蛋白（latent membrane protein，LMP）等膜蛋白，

8、可誘導(dǎo)機體產(chǎn)生特異性的免疫反應(yīng)。因此，EBV膜蛋白是EBV病毒檢測及其疫苗制備研究的靶抗原，是目前EBV研究的前沿?zé)狳c之一。為獲得高效價的EBV膜蛋白抗體，本研究利用B95-8細(xì)胞制備EBV膜抗原，通過免疫家兔制備特異性免疫血清，并對其效價和與EBV結(jié)合的特異性進行了鑒定。    1  材料和方法   1.1  材料   1.2  方法    2  結(jié)果   2.1  B95-8細(xì)胞培養(yǎng)  B95-8細(xì)胞為懸浮細(xì)胞，

9、鏡下觀察細(xì)胞數(shù)目多，形成多個細(xì)胞島，形態(tài)規(guī)則，折光性好，表明生長狀態(tài)良好，見圖1。   2.2  EB病毒膜蛋白血清抗體效價檢測結(jié)果  4只家兔免疫血清經(jīng)1:50直至1:6 400稀釋度倍比稀釋，各稀釋度血清于490 nm波長處讀取吸光度值，見表1。按照公式：待測標(biāo)本A值-空白對照A值/(陰性對照A值-空白對照A值)2.1為陽性，陽性血清的最高稀釋度即為該血清的效價。結(jié)果，4只家兔在全程免疫后均產(chǎn)生了血清特異性抗體。   2.3  EB病毒膜蛋白血清抗體產(chǎn)生趨勢分析結(jié)果   4只家兔血清特異性抗體在0、1

10、、3、5周產(chǎn)生趨勢，見圖2。于免疫后約1周，4 只家兔均開始產(chǎn)生血清特異性抗體，并于第5周達到最大值。4只家兔之間血清特異性抗體效價比較差異無顯著性（P0.05）。   2.4  EBV血清抗體特異性檢測結(jié)果  兔免疫血清分別按1:50、1:100 和1:200稀釋后，用Western Blot檢測其與EBV膜蛋白結(jié)合的特異性。結(jié)果如圖3示，血清稀釋到1:100時硝酸纖維膜上出現(xiàn)清晰的3條特異性條帶，分子質(zhì)量大小分別約為54 kD、39 kD和18 kD。而培養(yǎng)基對照孔則無。   3  討論   目前，制

11、備抗體常用的方法有免疫動物或雜交瘤細(xì)胞技術(shù)等。利用雜交瘤技術(shù)制備的單克隆抗體具備純度高、特異性強等優(yōu)點，在臨床診斷、治療和實驗研究中應(yīng)用廣泛，但是單克隆抗體仍然存在僅針對單個抗原表位的局限性，同時制備技術(shù)要求高，成本昂貴。而利用免疫動物制備的免疫血清多克隆抗體具有制備簡單、成本低、來源方便等優(yōu)點，且可同時針對多個抗原表位從而提高檢測的敏感性，因此在免疫學(xué)檢測和診斷實驗技術(shù)中仍然應(yīng)用廣泛。   Tsuge等從傳染性單核細(xì)胞增多癥患者體內(nèi)分離的B細(xì)胞中提取EBV，進而感染非洲絨猴B淋巴細(xì)胞，建立了EBV轉(zhuǎn)化的細(xì)胞系，即B95-8細(xì)胞。B95-8細(xì)胞為一懸浮細(xì)胞，其培養(yǎng)上清中含有

12、釋放出的EB病毒完整顆粒，而細(xì)胞膜上卻表達各種EB病毒的蛋白，包括包膜糖蛋白和僅在潛伏感染時表達的LMP。LMP有LMP1和LMP2兩種類型，前者是目前唯一被證實能促進細(xì)胞轉(zhuǎn)化甚至惡變的重要物質(zhì)，其引起的免疫反應(yīng)較弱；后者本身不是轉(zhuǎn)化蛋白，但在EB病毒感染的患者體內(nèi)可持續(xù)表達，并可誘導(dǎo)機體產(chǎn)生有效的保護性免疫應(yīng)答。因此，LMP2成為EBV相關(guān)腫瘤治療的理想靶抗原，用于EB病毒感染相關(guān)疾病的免疫機制、疫苗設(shè)計及其免疫效應(yīng)等研究。   根據(jù)B95-8細(xì)胞的特點，各家實驗室均有報道利用其制備EBV及EBV膜蛋白進行研究。Dolken等10用B95-8細(xì)胞制備的蛋白，通過固相放射免

13、疫測定法，證實用B95-8細(xì)胞可成功制備EBV膜蛋白，并且其膜蛋白復(fù)合物至少存在兩個亞型。Sairenji等11用B95-8制備了EBV膜蛋白，發(fā)現(xiàn)可被EB病毒糖蛋白包膜抗原gp350/220的3種單克隆抗體所識別。本研究經(jīng)Western blot檢測，發(fā)現(xiàn)用B95-8細(xì)胞制備的EBV膜蛋白可出現(xiàn)3條特異性條帶，其中分子量約54 kD和39 kD的條帶分別與已知的LMP2A（54 kD）和LMP2B（40 kD）的分子量相一致。            采用B95-8細(xì)胞作為EB病毒膜蛋白抗原，通

14、過免疫家兔制備EBV病毒膜蛋白免疫血清，經(jīng)PubMed檢索未見有類似的報道。本研究獲得的EBV膜蛋白兔免疫血清，可進一步應(yīng)用于EBV感染及其相關(guān)腫瘤性疾病的檢測，如可通過免疫熒光或免疫組化等方法檢測組織細(xì)胞表達的EBV膜蛋白抗原，可進行定位診斷EBV感染等，為EBV感染的免疫機制研究及臨床EB病毒感染的檢測打下了基礎(chǔ)?！緟⒖嘉墨I】  1 Sample J, Liebowitz D, Kieff E. Two related Epstein-Barrvirus membrane proteins are encoded by separate genes J. JVirol, 1989

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