蛋白質(zhì)電泳操作步驟

1、SDS-PAGE 電泳操作步驟：試劑配制：（實(shí)驗(yàn)中采用均為分析純）（ 1）丙烯酰胺貯液（ 4下棕色瓶中儲(chǔ)存，試劑盡量勿存儲(chǔ)過(guò)久）丙烯酰胺貯液（T=30%， C=3%）稱取29.1 g丙烯酰胺和0.9 g甲叉雙丙烯酰胺，用雙蒸水溶解，定容至100 ml,過(guò)濾備用。（試劑有毒，操作中注意防護(hù)）（ 2）濃縮膠緩沖液（1 mol/L Tris-HCl， pH 6.8） （ 4下棕色瓶中儲(chǔ)存，試劑盡量勿存儲(chǔ)過(guò)久）6.06 g Tris溶解于35 ml雙蒸水中，用濃鹽酸調(diào)節(jié) pH至6.8,再用雙蒸水定容至 50 ml。（ 3）分離膠緩沖液（1.5 mol/L Tris-HCl， pH 8.8） （ 4下棕

2、色瓶中儲(chǔ)存，試劑盡量勿存儲(chǔ)過(guò)久）18.16 g Tris溶解于75 ml雙蒸水中，用濃鹽酸調(diào)節(jié)pH至8.8,再用雙蒸水定容至 100 ml。（ 4） 10% SDS（ 5） 10% 過(guò)硫酸銨（APS） ：使用前新鮮配制，低濃度APS 一般當(dāng)天用當(dāng)天配制，勿過(guò)夜使用。（ 6）尿素（ 7） TEMED（N， N， N ， N -四甲基乙二胺）（8）電極緩沖液（1（棕色瓶中4c儲(chǔ)存，一般使用3-4次）0.025 mol/L Tris， 0.192 mol/L 甘氨酸，0.1% SDS， pH 8.3（9）電極緩沖液（2（棕色瓶中4c儲(chǔ)存，一般使用3-4次）0.050 mol/L Tris， 0.38

3、4 mol/L 甘氨酸，0.1% SDS， pH 8.3（ 10）樣品緩沖液（pH 6.8） （ 4下棕色瓶中儲(chǔ)存，試劑盡量勿存儲(chǔ)過(guò)久）1.6 ml 濃縮膠緩沖液（pH 6.8） + 4 ml 10% SDS + 0.6 g二硫蘇糖醇（DTT） + 2.5 ml 87%甘油+0.1 mg澳酚藍(lán)，用雙蒸水稀釋到20 ml.（ 11）考瑪斯亮藍(lán)R-250 染色方法：a.固定液20%三氯乙酸b.脫色液250 ml 乙醇， 80 ml 冰醋酸，加水稀釋至1000 ml。c.染色液稱取0.29 g考瑪斯亮藍(lán)R-250溶于250 ml上述脫色液中樣品處理：處理完樣品應(yīng)盡快使用，若存儲(chǔ)，須于-20下。d.C

4、ytC酶解樣每管分別加入 8 l 細(xì)胞色素 C (20 mg/ml), 10 ul 50 mM Tris-HCl (pH 8.0) ,1胰蛋白酶(細(xì)胞色素C:胰蛋白酶=50: 1)。37c水浴，2 h0立即放入-20 C冰 箱冷凍保存?zhèn)溆?。上樣前?5小比樣BUFFER, 75c水浴5-10min)大腸桿菌蛋白取10仙杳程菌種接入10nmi LB液體培養(yǎng)基里，過(guò)夜培養(yǎng)12h,取出1ml菌液離 心 10000g/r, 5min。棄上清，用 1ml Tris-Hcl (pH 8.0 50mM)洗滌 1-2 次，后 分別加入 20?(pH8.0 5mM)、10EDTA, -20C保存。上樣前加入 2

5、?5%X, 再力口入50仙比樣BUFFER, 75c水浴5-10min.CytC15?CytC 加入 15n?H¥ BUFFER, 75c水浴 5-10min0 .低分子量肽標(biāo)準(zhǔn)取 8-10N?Maker (2mg/ml)，加入 10N？¥ buffer,再加入 5?ddH2O, 75 c 水 浴 5-10min.SPI多肽的制備I材料及試劑(試劑均為分析純) 純大豆粉木瓜蛋白酶(sigma P3250 500-2000AU/g)正己烷 巰基乙醇Tris-HCl 緩沖液（0.03 M 、 pH 8.0 ）0.2 M HCl 疊氮鈉 考馬斯亮藍(lán)G250標(biāo)準(zhǔn)牛血蛋白 n制備方法

6、i .SPI制備：大豆分離蛋白的制備參照Iwabuchi和Yamauchi 9的方法，具 體步驟如下：全脂豆粉加正己烷（1/5）室溫下攪拌1 h脫脂，于3 000 g離心5 min, 取沉淀反復(fù)脫脂兩次，于沉淀中加入1520倍含10 mM 琉基乙醇0.03 M、pH 8.0的Tris-HCl緩沖液，室溫?cái)嚢?2 h,于20 C 6 000 g 離心25 min,取 上清液,用 0.2 M HCl 調(diào)節(jié) pH 至 4.8, 置于冰箱下層冷沉過(guò)夜, 再于 4 9000 g 離心 20 min, 取沉淀分散于少量水中, 調(diào)節(jié) pH 至 7.0, 攪拌 1 h 充分溶解后于 4 下用含 0.05 %

7、疊氮鈉的蒸餾水透析2 d, 再用蒸餾水透析兩次去疊氮鈉 , 冷凍干燥即得大豆分離蛋白（SPI）。 （可能透析會(huì)損失掉一定量的多肽。）ii.SPI蛋白含量測(cè)定：利用考馬斯亮藍(lán)蛋白含量測(cè)定法，根據(jù)牛血蛋白作出的標(biāo) 準(zhǔn)蛋白曲線，測(cè)定SPI的蛋白濃度：（具體方法參見生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)原理和方法P174)0 00.010.020.030.040.050.06蛋白濃度標(biāo)準(zhǔn)蛋白曲線一吸光度-線性(吸光度)6114 2 1 8 6 4 2 S c5ss度光吸測(cè)得1% (1mg/ml )的SPI吸光度為0.779 ,求得即在SPI質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%的情況 下，其蛋白濃度約為3mg/ml.iii.SPI多肽制備：本實(shí)驗(yàn)采用

8、木瓜蛋白酶水解SPI,制取SPI多肽。標(biāo)準(zhǔn)的酶解體 系為溶于0.05 mol/L, pH8.0Tris-HCl 緩沖溶液的SPI溶液(質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2%), 含質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.05%的疊氮鈉，先于38 c下預(yù)熱5 min,分別添加蛋白酶至750 AU/mL ,然后繼續(xù)于反應(yīng)溫度下反應(yīng)，反應(yīng)時(shí)間也很影響 SPI多肽的產(chǎn)率，木瓜 蛋白酶持續(xù)低溫水解16小時(shí)也可以產(chǎn)生較多小肽。反應(yīng)混合物可定期取樣并分 別加入X- PAGE樣品緩沖液終止反應(yīng)(1:1, v/v)。實(shí)驗(yàn)上樣一般采用過(guò)夜酶解透 析樣(2%*5%)。上樣前應(yīng)將酶解樣與樣品緩沖液混合物水浴。操作方法：所制均為1.0mm小板所需體積(1)配制分離膠(

9、16.5%T, 3%C):丙烯酰胺貯液一3ml分離膠緩沖液一1.5ml 尿素一2.16g 10%SDS 72??？ (2)配制濃縮膠(4%T, 3%C)丙烯酰胺貯液 一0.34ml濃縮膠緩沖液 一0.24ml ddH2。一 1.4ml 10% SDS 24 1 (3)將上兩步配制的分離、濃縮膠真空抽氣15min,同時(shí)配制10%過(guò)硫酸?。?準(zhǔn)確稱量0.1g過(guò)硫酸俊固體(因其易氧化，操作盡量快，且盡量從底部取樣 )， 溶于1ml雙蒸水中，即配即用，低濃度 APS只限當(dāng)天使用。(4)吸取22M過(guò)硫酸俊及5MTEMED于分離膠中，輕輕混勻，灌膠，小心的 在分離膠的表面加封一層水，封住膠面。注意分離膠與濃

10、縮膠的比例。(5)大約40min,待分離膠聚合形成界面后，吸掉水，加11M過(guò)硫酸俊及4 plTEMED于濃縮膠中，輕輕混勻，灌注濃縮膠，慢慢斜插入梳子(以免產(chǎn)生氣 泡)。膠配制完成之后可直接放置于室溫下，而且切忌即配即用及4c下冷藏，應(yīng)使其充分凝固，這樣可以在一定程度上提高分辨率。(6)樣品處理【此省略】(7)上樣：將處理好的樣品依據(jù)其蛋白濃度加入上樣 buffer,水浴后離心，去 適量體積加入上樣孔內(nèi)，切忌樣品直接互相污染( 上樣量一般8-12閨，視樣品 不同而異)(8)電泳：將電極緩沖液注入電泳槽中。恒流情況下，電壓一般設(shè)為最大值(300V), 在分離膠內(nèi)電流一般為10mA左右，大約30m

11、in左右，樣品前沿跑過(guò)分、濃界面 后，電流加大為20-25mA,整體電泳時(shí)間約2 h;恒壓條件下，濃縮膠內(nèi)電壓取 60V,電流一般設(shè)最大值，樣品跑至分、濃界面后電壓加大到120V,整體電泳時(shí)間約2.5h。(9)染色：利用考瑪斯亮藍(lán) R-250染色系統(tǒng)固定、染色和脫色：電泳完畢后， 將膠置于固定液中固定1 h,然后放置于染色液中染色過(guò)夜，轉(zhuǎn)置脫色液中脫色， 并多次更換脫色液，直至背景清晰。(10)觀察分析電泳結(jié)果1一 月二月三月產(chǎn)品名稱數(shù)量金額利潤(rùn)產(chǎn)品名稱數(shù)量金額利潤(rùn)產(chǎn)品名稱數(shù)量金額利潤(rùn)合計(jì)合 計(jì)合 計(jì)四月五月六月產(chǎn)品名稱數(shù) 量金 額利 潤(rùn)產(chǎn)品名稱數(shù) 量金 額利 潤(rùn)產(chǎn)品名稱數(shù) 量金 額利 潤(rùn)合計(jì)

12、合 計(jì)合 計(jì)下午 13 : 00 17 : 00B-實(shí)行不定時(shí)工作制的員工，在保證完成甲方工作任務(wù)情況下，經(jīng)公司同意，可自行安排工作和休息時(shí)間。3.1.2打卡制度3.1.2.1 公司實(shí)行上、下班指紋錄入打卡制度。全體員工都必須自覺(jué)遵守工作時(shí)間，實(shí)行不定時(shí)工作制的員工不必打卡。3.1.2.2 打卡次數(shù)：一日兩次，即早上上班打卡一次，下午下班打卡一次。3.1.2.3 打卡時(shí)間：打卡時(shí)間為上班到崗時(shí)間和下班離崗時(shí)間；3.1.2.4 因公外出不能打卡：因公外出不能打卡應(yīng)填寫外勤登記表，注明外出日期、事由、外勤起止時(shí)間。因公外出需事先申請(qǐng)，如因特殊情況不能事先申請(qǐng)，應(yīng)在事畢到崗當(dāng)日完成申請(qǐng)、,由直接主管

13、簽字證明當(dāng)日的出勤狀況，報(bào)部門經(jīng)理、審批手續(xù)，否則按曠工處理。因停電、卡鐘（工卡）故障未打卡的員工，上班前、下班后要及時(shí)到部門考勤員處填寫未打卡補(bǔ)簽申請(qǐng)表人力資源部批準(zhǔn)后，月底由部門考勤員據(jù)此上報(bào)考勤。上述情況考勤由各部門或分公司和項(xiàng)目文員協(xié)助人力資源部進(jìn)行管理。3.1.2.5 手工考勤制度3.1.2.6 手工考勤制申請(qǐng)：由于工作性質(zhì)，員工無(wú)法正常打卡（如外圍人員、出差），可由各部門提出人員名單，經(jīng)主管副總批準(zhǔn)后，報(bào)人力資源部審批備案。3.1.2.7 參與手工考勤的員工，需由其主管部門的部門考勤員（文員）或部門指定人員進(jìn)行考勤管理，并于每月 26日前向人力資源部遞交考勤報(bào)表。3.1.2.8 參

14、與手工考勤的員工如有請(qǐng)假情況發(fā)生，應(yīng)遵守相關(guān)請(qǐng)、休假制度，如實(shí)填報(bào)相關(guān)表單。3.1.2.9 外派員工在外派工作期間的考勤，需在外派公司打卡記錄；如遇中途出差，持出差證明，出差期間的考勤在出差地所在公司打卡記錄；3.2加班管理3.2.1 定義加班是指員工在節(jié)假日或公司規(guī)定的休息日仍照常工作的情況。A.現(xiàn)場(chǎng)管理人員和勞務(wù)人員的加班應(yīng)嚴(yán)格控制，各部門應(yīng)按月工時(shí)標(biāo)準(zhǔn)，合理安排工作班次。部門經(jīng)理要嚴(yán)格審批員工排班表，保證員工有效工時(shí)達(dá)到要求。凡是達(dá)到月工時(shí)標(biāo)準(zhǔn)的，應(yīng)扣減員工本人的存休或工資；對(duì)超出月工時(shí)標(biāo)準(zhǔn)的，應(yīng)說(shuō)明理由，報(bào)主管副總和人力資源部審批。B-因員工月薪工資中的補(bǔ)貼已包括延時(shí)工作補(bǔ)貼，所以延時(shí)

15、工作在4小時(shí)（不含）以下的，不再另計(jì)加班工資。因工作需要，一般員工延時(shí)工作4小時(shí)至8小時(shí)可申報(bào)加班半天，超過(guò) 8小時(shí)可申報(bào)加班1天。對(duì)主管（含）以上管理人員，一般情況下延時(shí)工作不計(jì)加班，因特殊情況經(jīng)總經(jīng)理以上領(lǐng)導(dǎo)批準(zhǔn)的延時(shí)工作，可按以上標(biāo)準(zhǔn)計(jì)加班。3.2.2.2 員工加班應(yīng)提前申請(qǐng)，事先填寫加班申請(qǐng)表，因無(wú)法確定加班工時(shí)的，應(yīng)在本次加班完成后3個(gè)工作日內(nèi)補(bǔ)填加班申請(qǐng)表。加班申請(qǐng)表經(jīng)部門經(jīng)理同意，主管副總經(jīng)理審核報(bào)總經(jīng)理批準(zhǔn)后有效。加班申請(qǐng)表必須事前當(dāng)月內(nèi)上報(bào)有效，如遇特殊情況，也必須在一周內(nèi)上報(bào)至總經(jīng)理批準(zhǔn)。如未履行上述程序，視為乙方自愿加班。3.2.2.3 員工加班，也應(yīng)按規(guī)定打卡，沒(méi)有打卡

16、記錄的加班，公司不予承認(rèn)；有打卡記錄但無(wú)公司總經(jīng)理批準(zhǔn)的加班，公司不予承認(rèn)加班。3.2.2.4 原則上，參加公司組織的各種培訓(xùn)、集體活動(dòng)不計(jì)加班。3.2.2.5 加班工資的補(bǔ)償：?jiǎn)T工在排班休息日的加班，可以以倒休形式安排補(bǔ)休。原則上，員工加班以倒休形式補(bǔ)休的，公司將根據(jù)工作需要統(tǒng)一安排在春節(jié)前后補(bǔ)休。加班可按1 : 1的比例沖抵病、事假。3.2.3加班的申請(qǐng)、審批、確認(rèn)流程3.2.3.1 加班申請(qǐng)表在各部門文員處領(lǐng)取，加班統(tǒng)計(jì)周期為上月26日至本月25日。3.2.3.2 員工加班也要按規(guī)定打卡，沒(méi)有打卡記錄的加班，公司不予承認(rèn)。各部門的考勤員（文員）負(fù)責(zé)加班申請(qǐng)表的保管及加班申報(bào)。員工加班應(yīng)提

17、前申請(qǐng)，事先填寫加班申請(qǐng)表加班前到部門考勤員（文員）處領(lǐng)取加班申請(qǐng)表，加班申請(qǐng)表經(jīng)項(xiàng)目管理中心或部門經(jīng)理同意，主管副總審核，總經(jīng)理簽字批準(zhǔn)后有效。填寫并履行完審批手續(xù)后交由部門考勤員（文員）保管。3.2.3.3 部門考勤員（文員）負(fù)責(zé)檢查、復(fù)核確認(rèn)考勤記錄的真實(shí)有效性并在每月27日匯總交人力資源部，逾期未交的加班記錄公司不予承認(rèn)。下午 13 : 00 17 : 00度。全體員工都必須自覺(jué)遵守工作時(shí)間，實(shí)行不定時(shí)工作制的員工不必打卡。3.1.2.2 打卡次數(shù)：一日兩次，即早上上班打卡一次，下午下班打卡一次。3.1.2.3 打卡時(shí)間：打卡時(shí)間為上班到崗時(shí)間和下班離崗時(shí)間；3.1.2.4 因公外出不

18、能打卡：因公外出不能打卡應(yīng)填寫外勤登記表，注明外出日期、事由、外勤起止時(shí)間。因公外出需事先申請(qǐng)，如因特殊情況不能事先申請(qǐng)，應(yīng)在事畢到崗當(dāng)日完成申請(qǐng)、審批手續(xù)，否則按曠工處理。因停電、卡鐘（工卡）故障未打卡的員工，上班前、下班后要及時(shí)到部門考勤員處填寫未打卡補(bǔ)簽申請(qǐng)表，由直接主管簽字證明當(dāng)日的出勤狀況，報(bào)部門經(jīng)理、人力資源部批準(zhǔn)后，月底由部門考勤員據(jù)此上報(bào)考勤。上述情況考勤由各部門或分公司和項(xiàng)目文員協(xié)助人力資源部進(jìn)行管理。3.1.2.5 手工考勤制度3.1.2.6 手工考勤制申請(qǐng)：由于工作性質(zhì)，員工無(wú)法正常打卡（如外圍人員、出差），可由各部門提出人員名單，經(jīng)主管副總批準(zhǔn)后，報(bào)人力資源部審批備案。

19、3.1.2.7 參與手工考勤的員工，需由其主管部門的部門考勤員（文員）或部門指定人員進(jìn)行考勤管理，并于每月 26日前向人力資源部遞交考勤報(bào)表。3.1.2.8 參與手工考勤的員工如有請(qǐng)假情況發(fā)生，應(yīng)遵守相關(guān)請(qǐng)、休假制度，如實(shí)填報(bào)相關(guān)表單。3.1.2.9 外派員工在外派工作期間的考勤，需在外派公司打卡記錄；如遇中途出差，持出差證明，出差期間的考勤在出差地所在公司打卡記錄；3.2加班管理3.2.1 定義加班是指員工在節(jié)假日或公司規(guī)定的休息日仍照常工作的情況。A.現(xiàn)場(chǎng)管理人員和勞務(wù)人員的加班應(yīng)嚴(yán)格控制，各部門應(yīng)按月工時(shí)標(biāo)準(zhǔn)，合理安排工作班次。部門經(jīng)理要嚴(yán)格審批員工排班表，保證員工有效工時(shí)達(dá)到要求。凡是達(dá)到月工時(shí)標(biāo)準(zhǔn)的，應(yīng)扣減員工本人的存休或工資；對(duì)超出月工時(shí)標(biāo)準(zhǔn)的，應(yīng)說(shuō)明理由，報(bào)主管副總和人力資源部審批。B-因員工月薪工資中的補(bǔ)貼已包括延時(shí)工作補(bǔ)貼，所以延時(shí)工作在4小時(shí)（不含）以下的，不再另計(jì)加班工資。因工作需要，一般員工延時(shí)工作4小時(shí)至8小時(shí)可申報(bào)加班半天，超過(guò) 8小時(shí)可申報(bào)加班1天。對(duì)主管（含）以上管理人員，一般情況下延時(shí)工作不計(jì)加班，因特殊情況經(jīng)總經(jīng)理以上領(lǐng)導(dǎo)批準(zhǔn)的延時(shí)工作，可按以上標(biāo)