丹參酮ⅡA對(duì)腦缺血再灌注損傷大鼠的保護(hù)作用及機(jī)制

1、丹參酮A對(duì)腦缺血再灌注損傷大鼠的保護(hù)作用及機(jī)制 作者：李浩，劉開祥，俸軍林，曾愛源，唐永剛【摘要】 目的探討丹參酮A（Tan A）對(duì)缺血再灌注損傷大鼠保護(hù)作用及對(duì)額頂部皮質(zhì)中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)、自由基含量、能量代謝的影響。方法將大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組、缺血再灌注組、Tan A低劑量組和Tan A高劑量治療組，線栓法建立局灶性腦缺血再灌注模型。Tan A高、低劑量治療組于術(shù)前連續(xù)灌胃給藥3 d，1次/d。用生化法觀察缺血90 min再灌注24 h大鼠額頂部皮質(zhì)髓過(guò)氧化物酶（MPO）活性、超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛（MDA）含量、三磷酸腺苷（ATP）含量及腦含水量變化，并進(jìn)行2，3，5三苯基氯化四氮

2、唑（TTC）染色檢測(cè)腦梗塞體積。結(jié)果Tan A治療組腦梗塞體積較缺血再灌注組減小，高、低劑量組之間差異亦具有顯著性（P0.05）；與缺血再灌注組比較，Tan A治療組顯著降低MPO活性、MDA含量，增加SOD 、ATP含量，降低腦組織含水量，高、低劑量組之間差異亦具有顯著性（P0.05）。結(jié)論Tan A對(duì)缺血再灌注腦損傷具有保護(hù)作用，其機(jī)制可能與減輕缺血再灌注損傷炎癥反應(yīng)，減輕氧化性損傷和改善能量代謝有關(guān)。 【關(guān)鍵詞】 缺血再灌注； 髓過(guò)氧化物酶； 自由基； 三磷酸腺苷； 丹參酮Abstract：ObjectiveTo study the effect of Tanshinone A (Tan

3、 A) on neutrophils infiltration and the contents of free radical and ATP in ischemic frontal and parietal cortex of cerebral ischemia reperfusion（I/R） rats.MethodsIn this experiment, rats were randomly divided into 4 groups, namely sham operated group, I/R group,low dose Tan A treated group and high

4、 dose Tan A treated group. The focal middle cerebral artery occlusion(MCAO) model was made by suture-occluded method.Rats were pretreated with Tan A ig for 3d,respectively. After 90min MCAO following 24h of reperfusion, the MPO activity, the contents of SOD and MDA in ischemic frontal and parietal c

5、ortex were investigated. TTC staining was used to calculate the cerebral infarct volume.ResultsCompared with I/R group,cerebral infarction volume in low dose Tan A treated group and high dose Tan A treated group decreased in a dose-dependent manner (all P0.05). Compared with I/R group, low and high

6、dose Tan A treated groups dose-dependently reduced MPO activity,the content of MDA and brain water content, increased the activity of SOD and the content of ATP. ConclusionTan A may aueviate cerebral ischemia-reperfusion injury by decreasing the inflammation reaction , free radicals and the disbanla

7、nce of energy metabolism.Key words：Ischemia-reperfusion; Myeloperoxidase; Free radical; ATP；Tanshinone A 丹參Salvia miltorrhiza Bge為唇形科多年生草本植物，是我國(guó)傳統(tǒng)具有活血化淤作用的中藥，已被廣泛用于心腦血管疾病的治療，但其作用機(jī)制尚不十分清楚。丹參酮( Tanshinone)是丹參的有效活性組分，其中丹參酮A（Tanshinone A，Tan A） 為丹參酮中含量最高的活性成分。本實(shí)驗(yàn)采用大鼠局灶性腦缺血再灌注模型，研究丹參酮A對(duì)大鼠腦缺血再灌注損傷缺血區(qū)額頂部皮質(zhì)

8、中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)、自由基含量、能量代謝、腦組織含水量及梗塞體積變化的影響，探討其對(duì)腦再灌注損傷保護(hù)作用機(jī)制。1 材料與方法1.1 藥品與試劑Tan A由提供上海第一生化藥業(yè)有限公司提供，純度85。髓過(guò)氧化物酶（MPO），丙二醛（MDA）和超氧化物歧化酶（SOD）試劑盒均購(gòu)于南京建成生物工程研究所。TTC購(gòu)自醫(yī)藥集團(tuán)上海化學(xué)試劑公司。1.2 動(dòng)物分組及給藥方法健康Wistar大鼠，雄性，清潔級(jí)，共100只，質(zhì)量（25030）g（廣西醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供）。按隨機(jī)分組原則分成假手術(shù)組（25只）、缺血再灌注組（25只）、Tan A低劑量治療組（25只）及Tan A高劑量治療組（25只）。Tan低劑

9、量治療組（15 mg/kg）和高劑量治療組（30 mg/kg）均于術(shù)前連續(xù)灌胃給藥3 d，1次/d，假手術(shù)組和缺血再灌注組給予等量的生理鹽水灌胃。第3天給藥后1 h建立缺血90 min再灌注24h動(dòng)物模型。1.3 動(dòng)物模型的建立參照Longa等1的方法制備大鼠局灶性腦缺血再灌注模型。采用頸外動(dòng)脈插入線栓法，各組均進(jìn)行左側(cè)大腦中動(dòng)脈栓塞。線栓采用石蠟線栓。線栓直徑約0.27 mm，插入深度約18 mm，此時(shí)線栓頭位于大腦中動(dòng)脈起始部。缺血90 min時(shí)，抽提線栓實(shí)現(xiàn)再灌注。神經(jīng)功能缺陷評(píng)分：按照 Longa等1評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)，各組分別在再灌注24 h進(jìn)行評(píng)分。0分：正常，無(wú)神經(jīng)學(xué)征象；1分：動(dòng)物不能完

10、全神展右前肢；2分：動(dòng)物右側(cè)肢體癱瘓，行走時(shí)向右側(cè)轉(zhuǎn)圈，出現(xiàn)追尾現(xiàn)象；3分：動(dòng)物行走向右側(cè)跌倒，或動(dòng)物不能站立或動(dòng)物打滾；4分：無(wú)自發(fā)活動(dòng)，有意識(shí)障礙。神經(jīng)功能缺陷評(píng)分在13分為模型成功。1.4 MPO活性的測(cè)定再灌注24h，將大鼠開顱取腦，置于4冰箱5 min，在冰浴下取左側(cè)距離嗅球尖端711 mm之間的額頂部皮質(zhì)，以試劑盒提供的勻漿介質(zhì)制成腦組織勻漿。嚴(yán)格按試劑盒說(shuō)明書步驟要求操作，出MPO活力單位。1.5 MDA和SOD的測(cè)定再灌注24h，將大鼠開顱取腦，置于4冰箱5 min，在冰浴下取左側(cè)距離嗅球尖端711 mm之間的額頂部皮質(zhì)，以試劑盒提供的勻漿介質(zhì)制成腦組織勻漿（步驟和方法同上）。

11、嚴(yán)格按試劑盒說(shuō)明書步驟要求操作，計(jì)算出MDA和SOD含量。1.6 三磷酸腺苷（ATP）含量測(cè)定再灌注24 h，將大鼠開顱取腦，置于4冰箱5 min，在冰浴下取左側(cè)距離嗅球尖端711 mm之間的額頂部皮質(zhì)，迅速加入乙腈，混勻，冰浴離心脫蛋白，離心后取上清液水系濾膜過(guò)濾后，-86保存。用高效液相測(cè)定ATP含量。1.7 腦含水量檢測(cè)再灌注24 h，各組隨機(jī)取5只大鼠，斷頭取腦后，快速稱取左右大腦半球濕重，置110115烤箱內(nèi)烤至恒重，再分別稱其干重，用(濕重- 干重) /濕重的百分比，作為衡量腦含水量指標(biāo)。1.8 TTC染色再灌注24h，將各組另外5只大鼠深麻后開顱取腦。將鼠腦置于4冰箱20min后

12、，將其切成5等份冠狀位切片，置于2TTC溶液中，水浴、多聚甲醛液固定。用計(jì)算機(jī)病理圖像分析儀及梯形法計(jì)算出梗塞灶體積，各腦片梗死灶體積之和即為梗塞體積。左側(cè)大腦半球梗死灶區(qū)呈白色，主要為額頂部皮質(zhì)和尾殼核，正常組織呈紅色。部分組織表現(xiàn)為由白色向紅色過(guò)度區(qū)。1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法數(shù)據(jù)處理采用SPSS11.5統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行運(yùn)算，結(jié)果以s表示，組間差異顯著性檢驗(yàn)采用方差分析。1 2 結(jié)果2.1 TAN A對(duì)MPO活性的影響結(jié)果見表1。假手術(shù)組MPO活性呈低水平。缺血再灌注組缺血側(cè)MPO活性較假手術(shù)組明顯升高（P0.05）；TAN A高、低劑量組MPO活性較缺血再灌注組明顯降低（均P0.05）；高、低劑量組

13、之間差異亦具有顯著性（P0.05）。表1 TAN A對(duì)MPO，MDA， SOD，ATP含量，腦含水量及腦梗塞體積影響（略）2.2 Tan A對(duì)MDA、SOD含量的影響缺血再灌注組缺血側(cè)額頂部皮質(zhì)SOD含量下降，MDA含量升高，與假手術(shù)組比較，差異具有顯著性（P0.05）。Tan A治療組可提高額頂部皮質(zhì)SOD含量，降低MDA含量，與缺血再灌注組相比較，差異具有顯著性（P0.05）；高、低劑量組之間差異亦具有顯著性（P0.05）。見表1。2.3 Tan A對(duì)ATP含量的影響缺血再灌注組缺血側(cè)額頂部皮質(zhì)ATP含量下降，與假手術(shù)組比較，差異具有顯著性（P0.05）；Tan A治療組ATP含量升高，與

14、缺血再灌注組相比較，差異具有顯著性（P0.05），高、低劑量組之間差異亦具有顯著性（P0.05）。見表1。2. 4 Tan A對(duì)腦水腫的影響缺血再灌注組缺血側(cè)腦組織含水量較假手術(shù)組明顯升高，差異具有顯著性（P0.05）； Tan A治療組降低腦組織含水量，與缺血再灌注組相比差異有顯著性(P0.05) ，高、低劑量組之間差異亦具有顯著性（P0.05）。見表1。2.5 Tan A對(duì)腦梗塞體積的影響TTC染色后，缺血再灌注24h左側(cè)大腦半球梗塞灶區(qū)呈白色，主要為額頂部皮質(zhì)和尾殼核，正常組織呈紅色。部分組織表現(xiàn)為由白色向紅色過(guò)度區(qū)。TTC染色形態(tài)學(xué)觀察顯示，用石蠟線栓法制備大鼠局灶性腦缺血再灌注模型，

15、可使大腦中動(dòng)脈供血區(qū)出現(xiàn)恒定的、復(fù)制性良好的梗塞灶（圖1）。 Tan A高、低劑量組梗死體積較缺血再灌注組顯著減?。≒0.05）；高、低劑量組之間差異亦具有顯著性（P0.05）。3 討論 何麗娜等2研究發(fā)現(xiàn)，丹參酮對(duì)原代大鼠神經(jīng)細(xì)胞缺血性損傷有保護(hù)作用。本研究結(jié)果也證實(shí)，腦缺血再灌注損傷給予Tan A治療，可明顯減少減輕再灌注損傷腦水腫及梗塞體積，對(duì)缺血腦組織有保護(hù)作用，高劑量GBE的保護(hù)效果更顯著。 MPO主要存在于中性粒細(xì)胞的噬天青顆粒中。MPO活性反映中性粒細(xì)胞在腦組織中浸潤(rùn)程度。我們前期研究已證實(shí)，腦缺血再灌注損傷出現(xiàn)了中性粒細(xì)胞參與為標(biāo)志的炎癥反應(yīng)過(guò)程，減輕腦缺血再灌注損傷后炎癥反應(yīng)

16、對(duì)缺血腦組織有保護(hù)作用3。本研究結(jié)果提示，腦缺血再灌注損傷給予Tan A腹腔注射治療，可明顯減少缺血再灌注后MPO活性，減少中性粒細(xì)胞的浸潤(rùn)，對(duì)缺血再灌注損傷炎癥反應(yīng)有抑制作用。胡霞敏等4預(yù)防性用藥給予缺血再灌注損傷大鼠Tan A治療，發(fā)現(xiàn)Tan A對(duì)缺血再灌注損傷炎癥反應(yīng)也有抑制作用，與我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果相一致。 缺血性腦卒中損傷機(jī)制中自由基連鎖反應(yīng)是重要一環(huán)。當(dāng)腦缺血特別是再灌注期，自由基生成和代謝的動(dòng)態(tài)平衡被打破，氧化應(yīng)激反應(yīng)發(fā)生，活性氧簇生成增多，引起脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)，形成脂質(zhì)過(guò)氧化物如MDA等，最終導(dǎo)致膜結(jié)構(gòu)的完整性遭到破壞，細(xì)胞內(nèi)環(huán)境紊亂；同時(shí)，自由基誘導(dǎo)DNA、RNA、蛋白質(zhì)交聯(lián)，生物

17、活性大分子斷裂、解聚；線粒體變性，細(xì)胞凋亡或壞死。同時(shí)，當(dāng)腦缺血發(fā)生時(shí)， 腦組織供血不足，能量合成物質(zhì)供應(yīng)缺乏，細(xì)胞能量代謝發(fā)生障礙，細(xì)胞內(nèi)ATP水平下降， Na,K+-ATP酶活性降低，大量Na+內(nèi)流，K+外流，細(xì)胞去極化，細(xì)胞內(nèi)游離Ca2濃度升高，導(dǎo)致了自由基的生成遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過(guò)了機(jī)體的清除能力，造成自由基堆積，形成惡性循環(huán)，加重腦損傷。SOD則能夠清除超氧陰離子自由基，保護(hù)細(xì)胞免受損傷，其活性間接反映了機(jī)體清除自由基的能力。我們的實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，Tan A可顯著降低缺血側(cè)腦組織中MDA的含量，提高腦組織SOD活性和ATP水平，提示Tan A能降低氧化應(yīng)激程度，減少體內(nèi)自由基的形成，增加機(jī)體清除自由基的能力，并能改善能量代謝障礙，可能與Tan A抑制急性腦缺血細(xì)胞鈣超載有關(guān)5。 綜上所述，Tan A對(duì)缺血再灌注損傷具有保護(hù)作用，其機(jī)制可能與減少缺血再灌注后炎癥反應(yīng)，減輕氧化性損傷和改善能量代謝障礙有關(guān)，高劑量Tan A的保護(hù)效果更顯著?！尽?1Longa EZ,Weinstein PR,Carlson S,et al. Reversible middle cerebral artery occusion without cranietomy in rat